CC BY
63
УДК 537.323.2
Морошкина Евгения Борисовна
кандидат физико-математических наук Санкт-Петербургский государственный университет
evmorosh@mail.ru,
Седова Ольга Борисовна
Костромской государственный университет им. Н.А. Некрасова
sedova_olga_fmf@mail.ru
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДНК С ПРОИЗВОДНЫМ АКТИНОЦИНА, СОДЕРЖАЩИМ В АМИДНЫХ ГРУППАХ РАДИКАЛ - (БЕНЗО-15-КРАУН-5) В РАСТВОРЕ С ИОННОЙ СИЛОЙ 0,1
Методами спектрофотометрии и кругового дихроизма в присутствии ионов К+ и Ма+ при ионной силе ц=0,1 исследовано взаимодействие молекулы ДНК с аналогом противоопухолевого антибиотика актиномици-на D, содержащим в амидных группах радикалы — (бензо-краун-5)-4 ’-ил. В зависимости от природы катиона соединение связывается с ДНК в виде димера, мономера или образует агрегаты.
Ключевые слова: актиноцин, ДНК, краун-группировка, спектрофотометрическое и спектрополяриметрическое титрование.
Молекула ДНК является мишенью действия многих агентов, обладающих . противоопухолевой активностью. Среди них - антибиотик актиномицин D, содержащий в положениях 1, 9 актиноцинового хромофора пентапептидлактонные группировки. В процессе направленного поиска новых активных противоопухолевых препаратов на кафедре органической химии Санкт-Петербургского государственного технического университета были синтезированы многочисленные аналоги этого антибиотика, содержащие вместо пентапептидлак-тонных группировок радикалы различной природы [1, с. 23-30]. Спектральными, гидродинамическими и оптическими методами было показано, что способность актиноцинового хромофора интеркалировать в двойную спираль ДНК зависит от ионного состояния лиганда [9, с. 438443] и от положения катионоидного центра [10, с. 448-455]. Заместители, способные специфическим образом взаимодействовать с ДНК в составе молекулы лиганда, могут препятствовать интер-каляции хромофора в двойную спираль ДНК [7, с. 950-956].
Было установлено, что пептидлактонные группировки актиномицина D способны, подобно краун-эфирам, связывать катионы №+ [2, с. 19831986]. Это явилось предпосылкой нового направления конструирования комплексонов ДНК на основе объединения в одной молекуле фрагментов, ответственных за взаимодействие с ДНК, и различных краун-соединений [5, с. 1573-1576;
6, с. 406-408 ].
В настоящей работе исследовали взаимодействие ДНК с производным актиноцина, содержащим в амидных группах радикал - (бензо-15-кра-ун-5) в водно-солевом растворе (KCl и NaCl) с ионной силой 0,1.
Экспериментальная часть
Использовали ДНК из тимуса теленка фирмы «Sigma» с молекулярной массой М = 107 Да. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически по методу А.С. Спирина [11, т. 23, с. 656].
Исследуемое в работе соединение (рис. 1) было синтезировано на кафедре органической химии Санкт-Петербургского государственного технического университета [5, с. 1573-1576]. Соединение растворяли в этиловом спирте, насыщенном NaCl или KCl, и затем разбавляли водносолевым раствором до нужной концентрации. Комплексы готовили путём смешивания растворов ДНК и лиганда соответствующих концентраций. При этом концентрация спирта не превышала 5% и ДНК в растворах оставалась в В-форме.
Рис. 1. Структура производного актиноцина, содержащего в амидных группах радикал -(бензо-15-краун-5)
© Морошкина Е.Б., Седова О.Б., 2010
Вестник КГУ им. Н.А. Некрасова ♦ № 4, 20101
350 400 450 500
НМ
Рис. 2. Форма спектра поглощения лиганда. Кривая I - мономерная форма, II - димерная форма, III - H-агрегаты, IV - J-агрегаты
Ионная сила полученных растворов была равна 0,1 и в дальнейшем сохранялась при концентрационных измерениях. Концентрацию соединений определяли по величине оптической плотности растворов и коэффициенту экстинкции 8450=25000 М-1см-1.
Параллельно проводили спектрофотометрическое титрование (СФТ) и спектрополяриметрическое титрование (СПТ) с использованием одних и тех же растворов. Спектры поглощения регистрировались на спектрофотометре «Specord UV-Vis». Спектры КД регистрировались с помощью дихрографа «Jobin-Ivon Mark 5».
Спектр поглощения исследуемого соединения в присутствии ионов К+ при ц=0,1 изображен на рисунке 2 (кривая II) и соответствует спектру поглощения димеров актиноцина, образованных в результате взаимодействия хромофоров [3, с. 47-125]. Такая форма соединения стабильна во времени. В присутствии ионов №+, независимо от ионной силы среды, при переходе из спиртового в водный раствор сначала наблюдается спектр поглощения III (рис. 2), соответствующий агрегатам Н-типа, который затем в течение 515 минут переходит в спектр IV (рис. 2), соответствующий агрегатам 1-типа. В случае Н-агрега-тов плоскости хромофоров молекул находятся друг над другом, их центры - на одной оси, перпендикулярной плоскости молекулы, «стопка». В случае J-агрегатов плоскости хромофоров молекул сдвинуты относительно друг друга - «край к краю» [4, с. 721-722]. Агрегаты соединения Ни J-типа могут образоваться в результате взаимодействия краунгруппировок разных молекул с образованием структур типа «сэндвич».
Поскольку в присутствии ионов №+ исследуемое соединение изменяло свое состояние во времени, СФТ и СПТ растворов, содержащих ионы №+, проводилось двумя способами. В первом случае в каждый раствор, содержащий различную концентрацию ДНК, непосредственно перед измерением спектров поглощения или КД
X, пт
Рис. 3. Спектрополяриметрическое (шкала слева; и спектрофотометрическое (шкала справа) титрование лиганда в 0,1 M KCl при разных г:
1) чистый лиганд; 2) г=0,73; 3) г=0,5; 4) г=0,26; 5) г=0,13; 6) г=0,07
X, пт
Рис. 4. Изменение во времени спектров поглощения и кругового дихроизма для комплекса лиганд-ДНК при г=0,27 в 0,1М №С1 (номер спектра соответствует времени с момента приготовления в
минутах)
добавляли концентрированный спиртовой раствор лиганда в мономерной форме. Во втором случае в растворы, содержащие соответствующие концентрации ДНК, добавляли водный раствор лиганда в J-форме.
Результаты и их обсуждение
Титрование растворов лиганда растворами ДНК в 0,1М KCl показывает, что свободный лиганд в данных условиях находится в димерной форме (кривая 1, рис. 3 а). Изменения спектров поглощения, происходящие при последовательном увеличении концентрации ДНК, свидетельствуют о связывании лиганда с ДНК сначала в виде димеров (кривые 2-4, рис. 3 а), а затем в виде мономеров (кривые 5,6, рис. 3а). Аналогичное поведение наблюдалось ранее в случае производных актиноцина, содержащих в амидных группах радикалы - (бензо-18-краун-6) [8, с. 2015-2020]. Появление индуцированного КД и его изменение в процессе спектрополяриметрического титрования позволяет сделать вывод, что при соотношении концентраций лиганда и ДНК г^0,6 димеры лиганда интенсивно связываются с молекулой ДНК, образуя на ее поверхности агрегаты (кривые 2, 3, рис. 3b). При увеличении концентрации ДНК (г^0,2) связанный лиганд находится в виде димеров (кривые 4,5, рис. 3b), а при большом избытке ДНК (г <0,1) - в виде мономеров (кривая 6, рис. 3b). Большое сродство лиганда к ДНК в этих
условиях обусловлено тем, что димер лиганда содержит 4 краунгруппировки, каждая из которых ассоциирует один ион К+, а фосфатные группы ДНК имеют отрицательный заряд.
При проведении СФТ и СПТ в 0,1М NaCl 1-ым способом (введение лиганда в виде спиртового раствора мономеров в водные растворы, содержащие ДНК) наблюдали изменения во времени спектров поглощения и индуцированного КД (рис. 4). Сначала формируются спектры Н-фор-мы, которые затем переходят в спектры J-формы. Концентрация ДНК в растворе оказывала влияние только на скорость этого перехода: чем больше концентрация ДНК, тем медленнее происходит переход.
Можно предположить, что сродство мономеров лиганда к ДНК в этих условиях не велико. По этой причине процесс образования Н-агрегатов идет и в присутствии ДНК, однако идет тем медленнее, чем больше концентрация ДНК. Это связано с тем, что в образовании свободной Н-фор-мы принимают участие только не связанные с ДНК молекулы лиганда. Переход свободного лиганда в Н-форму нарушает равновесие свободный - связанный лиганд, что приводит к постепенной диссоциации лиганда с ДНК и переходу его в Н-форму. Затем наблюдается переход Н-формы в J-форму. Этот переход сопровождается появлением сравнительно интенсивного сигнала кругового дихроизма (рис. 4Ь). Интенсив-
Вестник КГУ им. Н.А. Некрасова ♦ № 4, 2010|
ность конечного спектра ИКД в несколько раз превышает интенсивность спектра КД J-формы свободного лиганда. Это позволяет сделать предположение, что в присутствии ДНК образование J-агрегата идет на поверхности молекулы ДНК.
Для выяснения возможности связывания лиганда с ДНК в J-форме проводилось СФТ и СПТ второго типа, когда соединение вводится в растворы, содержащие ДНК в виде уже сформировавшихся в растворах NaCl J-агрегатов. В этом случае отсутствуют изменения во времени как спектров поглощения, так и спектров КД лиганда. При этом оба типа спектров практически не отличаются от спектров свободной J-формы. Можно сделать вывод, что сформированные в отсутствие ДНК J-агрегаты соединения практически не взаимодействуют с молекулой ДНК.
Проведенные исследования позволяют сделать вывод, что наличие двух краун-группировок существенно расширяет возможности соединения взаимодействовать с молекулой ДНК различными способами в зависимости от ионных условий среды. Это делает подобные соединения перспективными для создания специфичных противоопухолевых средств в тех случаях, когда в опухолевых клетках нарушается K+/Na+ обмен.
Библиографический список
1. Glibin E.N. Synthesis of Phenoxazone Drugs with Different Functional Groups in the Side Chains // Anti-Cancer Drug Design: Biological and Biophysical Aspects of Synthetic Phenoxazone Derivatives. -Sevastopol: Sevntu Press, 2002. - C. 23-30.
2. Khorti A.G., Glibin E.N., Korshunova Z.I. Influence of Complexation by Metal Cations on Solvophobic Retention of Crown Compounds in Reverse-phase High-performance Liquid Chromatography // Bulletin of the Academy of Sciences of the USSR. Division of Chemical Sciences. - 40. - .№10. - P. 1983-1986.
3. Maleev V.Ya., SemenovM.A., KruglovaE.B. A Spectroscopic and Calorimetric Study of DNA Complexation with a New Series of Actinocin Derivatives // Anti-Cancer Drug Design: Biological and Biophysical Aspects of Synthetic Phenoxazone Derivatives. - Sevastopol: Sevntu Press, 2002. -P 47-125.
4. McRae E.G., Kasha M. Enhancement of phosphorescence ability upon aggregation of dye molecules // J. Chem. Phys. - 1958. - №28. - P. 721-722.
5. ГлыбинЕ.Н., Овчинников Д.В., ПлехановаН.Г. Синтез аналогов актиномицина. XXI. Бензокраун-4 ’-илкарбамоилалкиламиды // Журнал органической химии. - 1997. - №33. - С. 1573-1576.
6. Глыбин Е.Н., Плеханова Н.Г., Овчинников Д.В. Синтез аналогов актиномицина. XX. Амиды акти-ноцина, содержащие краун группировки // Журнал органической химии. - 1996. - №32. - С. 406-408.
7. Кривцова М.А., Морошкина Е.Б., Глибин Е.Н. Взаимодействие ДНК с низкомолекулярными лигандами различной структуры. III Комплексы ДНК с дистакцинами // Молекулярная биология. -1984. - №18. - С. 950-956.
8. МорошкинаЕ.Б., Дрещинский А.В., Плеханова Н.Г. Влияние ионной силы на взаимодействие ДНК с краунсодержащими производными актиноцина // Журнал физической химии. - 2002. -№76. - C. 2015-2020.
9. Морошкина Е.Б., КривцоваМ.А., Глибин Е.Н. Взаимодействие ДНК с амфолитами на основе актиноцина // Молекулярная биофизика.- 2002. -№47. - С. 438-443.
10. Морошкина Е.Б., Кузьменко Е.В., Кривцова М.А. Взаимодействие ДНК с амидвми актиноцина, содержащими катионоидные центры в амидных группах // Молекулярная биология. - 2000. -№34. - С. 448-455.
11. Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот // Биохимия. - 1958. - Т. 23. - С. 656.
