CC BY
46
УДК 535.33
Морошкина Евгения Борисовна
кандидат физико-математических наук Санкт-Петербургский государственный университет
Оедова ольга Борисовна
Костромской государственный университет им. Н.А. Некрасова
взаимодействие днк с производным АКТИНОЦИНА, СОДЕРЖАЩИМ в АМИДНЫХ ГРУППАХ РАДИКАЛ - (БЕНЗо-15-КРАУН-5),
в присутствии ионов K+ в растворе
Методами спектрофотометрического и спектрополяриметрического титрования исследовано взаимодействие производного актиноцина, содержащего радикалы (бензо-15-краун-5) в амидных группах, с молекулой ДНК в водно-солевых растворах KCl. Исследуемое соединение образует три спектрально различимые агрегационные формы: ди-меры и агрегаты Н- и J-типа. Последние обладают оптической активностью. В растворах кс1 в присутствии ДНК независимо от её концентрации и ионной силы раствора не происходит образования агрегационных форм исследованного производного актиноцина. Н- и J-форма не только не образуются в присутствии ДНК, но и разрушаются в случае их предварительного образования. Данное соединение взаимодействует с ДНК в виде димеров или мономеров в зависимости от соотношения молярных концентраций лиганда и ДНК, что свидетельствует о большом сродстве соединения ДНК в растворах KCl.
Ключевые слова: спектрофотометрия, спектрополяриметрия, производные актиноцина, краун-группа, ДНК.
Введение
Антибиотик актиномицин D является одним из первых антибиотиков, у которых была обнаружена противоопухолевая активность [13]. Однако наличие побочных эффектов у этого препарата стимулирует поиск эффективных соединений среди его аналогов. Ряд таких аналогов был синтезирован в Санкт-Петербургском государственном техническом университете сотрудниками кафедры органической химии [9].
Одним из синтезированных соединений является производное актиноцина, содержащее в амидных группах радикал - (бензо-15-краун-5) [1]: O ^ /NHR O ^ /-NHR
Г1ТТ
Т о
CH 3 CH3
гъ
над другом, их центры находятся на одной оси, перпендикулярной плоскости хромофора, образуя агрегат в виде «стопки». В случае J-агрегатов плоскости хромофоров молекул сдвинуты относительно друг друга, образуя агрегат в виде «кирпичной кладки» [5]. Спектры поглощения этих форм соединения представлены на рис. 1. С течением времени форма агрегата соединения может меняться в зависимости от условий окружающей среды [5].
Ранее было проведено спектральное исследование взаимодействия данного соединения с молекулой ДНК в растворе 0,1М КС1 [4]. Было показано, что соединение, находящееся в этих условиях в димерной форме, имеет большое сродство с молекулой ДНК и взаимодействует с ней, образуя комплекс лиганд-ДНК в виде мономеров, димеров или агрегатов на поверхности двойной спирали в зависимости от соотношения молярных концен-
аЮ М 'см'
R=
Его особенность заключается в том, что пеп-тидлактонные группировки актиномицина D, способные связывать катионы металлов [10], были заменены на краун-эфиры, обладающие аналогичными свойствами [11; 8].
Ранее было показано, что изучаемое соединение может находиться в водно-солевых растворах, содержащих ионы К+ или №+, в различных формах: в виде мономеров, димеров, агрегатов Н-типа и агрегатов J-типа. В случае Н-агрегатов плоскости хромофоров молекул располагаются друг
¿f
• .... IV
t/.s " v. \
£4 \\
Рис. 1. Форма спектров поглощения исследуемого соединения.
Кривая I - мономерная форма, II - димерная форма, III - Н-агрегаты, IV - 1-агрегаты [4]
Вестник КГУ им. H.A. Некрасова № 6, 2014
© Морошкина Е.Б., Седова О.Б., 2014
H
2
24
траций лиганда и пар азотистых оснований ДНК в р^тшре Спиг/СдНК.
Поскольку данное производное актиноцина образует в зависимости от ионной силы среды агрега-ционные формы различной структуры, что может повлиять на его способность взаимодействовать с молекулой ДНК, мы провели исследование взаимодействия этого соединения с ДНК в растворах 0,01М KCl и 0,001М KCl.
Материалы и методы
Для эксперимента была использована ДНК из тимуса теленка фирмы «Sigma» с молекулярной массой М = 107 Да. Молекулярная масса ДНК была определена по величине ее характеристической вязкости в 0,15 М NaCl [7]. Концентрация ДНК определялась по поглощению ее гидролизата [6]. Коэффициент экстинкции ДНК е258 = 6400-6700 М-1см-1.
Исследуемое производное актиноцина растворяли в этиловом спирте, насыщенном KCl. Его концентрацию в исходных спиртовых растворах определяли по коэффициенту экстинкции е =25000 М-1см-1.
450
Спектрофотометрическое титрование (СФТ) и спектрополяриметрическое титрование (СПТ) двух типов проводили параллельно с использованием одних и тех же растворов. При титровании первого типа концентрированный спиртовой раствор соединения в мономерной форме добавляли в ДНК-содержащие водно-солевые растворы KCl различной ионной силы (д). Содержание спирта в конечных растворах не превышало 1% (по объёму). При титровании второго типа смешивали водно-солевые растворы соединения и ДНК одинаковой ионной силы. В этом случае в зависимости от ионной силы раствора исходное состояние соединения соответствовало H- или J-форме.
Для регистрации спектров поглощения использовали спектрофотометр «Specord UV-Vis». Спектры кругового дихроизма были получены на дих-рографе «Jobin-Ivon Mark 5».
Результаты и их обсуждение
СФТ и СПТ I типа, ¡1=0,01, ¡1=0,001
При титровании I типа исходное состояние соединения в растворе является мономерным. В присутствии ДНК в растворе спектры поглощения лиганда имеют форму, соответствующую форме спектров поглощения связанных с ДНК мономеров или димеров актиноцина, в зависимости от величины Слиг/СДНК [2] (рис. 2, а). Изменений спектров поглощения во времени не наблюдается.
Мономерная форма соединения оптически не активна. В присутствии ДНК наблюдается индуцированный круговой дихроизм (ИКД), сопряженный с длинноволновой полосой поглощения соединения, вызванный его взаимодействи-
D, o.e.
й£
400
500
600
Рис. 2. Спектры поглощения (а) и ИКД (б) лиганда при д=0,001 при титровании I типа: Слиг/Сднк = 1,5(1); 1,0 (2); 0,5(3); 0,1 (4); 0,05(5).
С = 10-5 М.
лиг
ем с ДНК (рис. 2, б). При изменении отношения Слиг/Сднк в диапазоне 0,5-1,5 спектры ИКД имеют экситонный вид с изоэллиптической точкой при Х=450 нм, что характерно для спектров ИКД связанных с ДНК димеров производных актиноцина [3]. С дальнейшим увеличением концентрации ДНК интенсивность отрицательной полосы уменьшается, и при Слиг/СДНК < 0,1 наблюдается предельный спектр ИКД, соответствующий изолированно связанной с ДНК молекуле лиганда. Следует отметить, что этот предельный ИКД имеет положительный знак, в отличие от соответствующего ИКД производных актиноцина, не имеющих кра-ун-группировки в амидных группах и взаимодействующих с двойной спиралью ДНК интеркаляци-онным способом [3]. Это может свидетельствовать либо о разной ориентации актиноцинового хромофора в интеркаляционном сайте, либо вообще о другом способе связывания данного производного актиноцина с ДНК.
Отсутствие процесса образования агрегаци-онных форм соединения в присутствии ДНК свидетельствует о том, что в растворах практически отсутствует свободный лиганд. Следовательно, в данных ионных условиях сродство исследуемого соединения к ДНК (К ) достаточно велико, учитывая использованную для титрования концентрацию соединения, К > 107М-1.
Рис. 3. Спектры поглощения (а) и ИКД (б) лиганда при д=0,01 при титровании II типа: без ДНК (1), Си/Сднк = 1,1(2); 0,5(3); 0,4 (4);
0,2(5); 0,1(6). Слиг= 10-5 М.
СФТи СПТIIтипа, ц =0,01 При титровании II типа при д = 0,01 исходное состояние соединения является Н-агрегатом, о чем свидетельствует кривая 1 (рис. 3, а).
Изменение спектров поглощения актиноцина в присутствии ДНК и при увеличении ее концентрации в растворе свидетельствует об образовании комплекса ДНК-лиганд (рис. 3, а).
Кривые СФТ и СПТ этого типа аналогичны кривым титрования I типа. Это означает, что Н-агрегаты быстро распадаются в результате взаимодействия лиганда с ДНК. Следовательно, в исходном растворе соединения при ц=0,01 имеет место динамическое равновесие между его мономерной и агрегационной Н-формой. В присутствии ДНК это равновесие нарушается в результате связывания мономеров с ДНК, что и приводит к быстрому разрушению Н-агрегата и образованию комплекса ДНК-лиганд.
СФТи СПТIIтипа, ц=0,001 При титровании J-формы соединения растворами ДНК в 0,001М КС1 при изменении С /С„и1Г в диапазоне 0,1-1,4 значительных измене-
лиг ДНК ' '
ний в спектрах поглощения не было в течение всего времени наблюдения. Форма спектров имеет вид, характерный для J-формы соединения, что может свидетельствовать об отсутствии взаимодействия J-агрегатов с ДНК. Однако при большом избытке
ДНК в растворе (Слиг/СДНК = 0,05) наблюдались значительные изменения спектра поглощения во времени. Сразу после приготовления раствора спектр поглощения также имеет вид J-формы, но в течение 36 минут происходят изменения в интенсивности и форме спектра, свидетельствующие о разрушении J-агрегатов (рис. 4, врезка).
Поскольку, в отличие от мономеров, димеров и агрегатов Н-формы, начальная J-форма соединения имеет собственный круговой дихроизм [5], изменение в спектрах КД в присутствии ДНК и во времени носит в этих условиях сложный характер. Тем не менее, при избытке ДНК в растворе конечный спектр КД имеет вид, аналогичный наблюдаемому в условиях взаимодействия изолированной молекулы соединения с ДНК (рис. 4, кривая 6).
Таким образом, при д = 0,001 также наблюдается разрушение исходной агрегационной формы актиноцина в процессе его взаимодействия с ДНК. Однако этот процесс идёт гораздо медленнее, чем разрушение Н-агрегатов. Возможно, это связано со структурной перестройкой J-агрегатов, предшествующей образованию комплекса.
Сопоставляя полученные данные с ранее опубликованными [4], можно сделать вывод, что в присутствии ДНК в растворах KCl независимо от концентрации ДНК и ионной силы раствора не происходит образования агрегационных форм исследованного производного актиноцина. Данное соединение взаимодействует с ДНК в виде диме-ров или мономеров в зависимости от соотношения молярных концентраций лиганда и ДНК. Такое поведение исследованного соединения свидетельствует об отсутствии свободного лиганда в растворе во всём исследованном диапазоне Слиг/СДНК и, следовательно, о большом сродстве соединения с ДНК в растворах KCl.
Результаты СФТ и СПТ H-формы и димерной формы соединения аналогичны результатам ти-
Рис. 4. Спектры КД лиганда при д=0,001 при титровании II типа: без ДНК (1); Слиг/СДНК = 1,4(2); 1,1(3); 0,5(4); 0,1 (5); 0,01(6). С = 10-5 М.
лиг
Врезка: изменение во времени спектра
поглощения лиганда при Сл
г/СДНК = 0,°5.
трования мономерной формы. Это означает, что димеры и Н-форма не только не образуется в присутствии ДНК, но и разрушаются в случае их предварительного образования. При титровании J-формы соединения в 0,001 М KCl процесс образования комплекса ДНК-лиганд идет гораздо медленнее и наблюдается только в присутствии большого избытка ДНК. При этом спектральные характеристики образовавшегося комплекса аналогичны наблюдаемым в других ионных условиях. Это означает, что J-форма соединения является более устойчивым агрегатом, чем димер или Н-агрегат, но также разрушается в присутствии ДНК, а структура образовавшегося комплекса аналогична наблюдаемой в условиях большей ионной силы.
Таким образом, можно сделать вывод, что условия, при которых происходит образование комплекса данного краун-содержащего производного актиноцина с ДНК, влияют только на динамику образования этого комплекса, но не на его структуру.
Библиографический список
1. Глибин Е.Н., Овчинников Д.В., Плеханова Н.Г. Синтез аналогов актиномицина. XXI. Бензокраун-4'-илкарбамоилалкиламиды // Журнал органической химии. - 1997. - № 33. - С. 1573-1576.
2. КривцоваМ.А., Морошкина Е.Б., Глибин Е.Н., Фрисман Э.В. Молекулярная биология. - М., 1982. - Т. 34. - С. 149-155.
3. Морошкина Е.Б., Кузьменко Е.В., Кривцова М.А., Глибин Е.Н. Молекулярная биология. - М., 2000. - Т. 34. - С. 448-455.
4. Морошкина Е.Б., Седова О.Б. Взаимодействие ДНК с производным актиноцина, содержащим в амидных группах радикал - (бензо-15-краун-5) в растворе с ионной силой 0,1 // Вестник
Костромского государственного университета им. Н.А. Некрасова. - 2010. - Т. 16. - № 4. - С. 11-14.
5. Морошкина Е.Б., Седова О.Б., Урусова Т.А. Формирование агрегатов производного актиноцина, содержащего в амидных группах радикалы 4'-бензо-15-краун-5, и их взаимодействие с молекулой ДНК // Журнал структурной химии. - 2011. -Т. 52. - № 6. - С. 1252-1258.
6. Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот // Биохимия. - 1958. - Т. 23. - С. 656.
7. Eigner J., Doty P. // J. Mol. Biol. - 1965. -Vol. 12. - P. 549-580.
8. Fery-Forgues S., Al-Ali F. // J. Photochem. Photobiol. C: Photochem. Rev. - 2004. - № 5. -P. 139-153.
9. Glibin E.N. Synthesis of Phenoxazone Drugs with Different Functional Groups in the Side Chains // Anti-Cancer Drug Design: Biological and Biophysical Aspects of Synthetic Phenoxazone Derivatives. -Sevastopol: Sevntu Press, 2002. - C. 23-31.
10. Khorti A.G., Glibin E.N., Korshunova Z.I. Influence of Complexation by Metal Cations on Solvophobic Retention of Crown Compounds in Reverse-phase High-performance Liquid Chromatography // Bulletin of the Academy ofSciences of the USSR. Division of Chemical Sciences. - 1991. -October. - V. 40. - № 10. - P. 1983-1986.
11. Kimura K., Shono T. In: Cation Binding by Macrocycles / eds. Y. Inoue, G.W. Gokel. - NY.: Marcel Dekker, 1990. - P. 429-463.
12. McRae E.G., Kasha M. Enhancement of phosphorescence ability upon aggregation of dye molecules // J. Chem. Phys. - 1958. - № 28. - P. 721-722.
13. Sengupta S.K. In Cancer Chemotherapeutic Agents, Foye, W. O., ed.; American Chemical Society. - Washington: D. C., 1995. - P. 270-292.
