CC BY
32
Бормотова Е.А.1, Гупалова Т.В.2 ©
'Н.с.; 2д.б.н., в.н.с. отдел молекулярной микробиологии Федеральное государственное бюджетное учреждение
«Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» СЗО РАМН
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО АЛЬБУМИНА И РЕКОМБИНАНТНЫХ ДЕРИВАТОВ АЛЬБУМИН-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА СТРЕПТОКОККА ГРУППЫ G.
Аннотация
Статья посвящена изучению взаимодействия человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) и рекомбинантных производных ЧСА-связывающего белка стрептококка группы G. Особенности структуры каждого из трех полипептидов определяют различия между ними по ЧСА-связывающей активности. Наибольшая способность связывать ЧСА принадлежит полипептиду А2, обладающего самой длинной аминокислотной последовательностью. Все три полипептида обладают способностью к селективному связыванию ЧСА, что делает перспективным их применение для целей медицины, биотехнологии и протеомики.
Ключевые слова: стрептококк группы G, рекомбинантный ЧСА-связывающий полипептид, ИФА.
Keywords: streptococci of group G, recombinant HSA-binding polypeptide, ELISA.
Введение. Несмотря на успехи последних лет [], изучение патогенных стрептококков и вызываемых ими заболеваний продолжает оставаться одной из актуальных задач теоретической медицины и практического здравоохранения. Как и в случае всех инфекционных заболеваний, патогенез стрептококковых инфекций является итогом взаимодействия биологической системы организма хозяина и микроба. Вирулентность стрептококков коррелирует с их способностью продуцировать ряд поверхностных белков. Одним из таких белков является G белок на поверхности стрептококков групп C и G. Он содержит иммуноглобулин G (IgG)- и альбумин (ЧСА)- связывающие домены [1]. Присутствие этих доменов может позволить инфицирующим бактериям покрыть свою поверхность плазменными белками хозяина и тем самым скрыться от защитной функции иммунной системы хозяина.
Белок бактерий Finegoldia magna, PAB белок, содержащий ЧСА-связывающий домен в 45 аминокислотных остатков, ассоциируется исключительно с патогенными штаммами, изолированными от пациентов с локализованными гнойными инфекциями [2]. Следовательно, взаимодействие между ЧСА-связывающим доменом и ЧСА может играть важную роль в патогенезе стрептококковых инфекций. Было высказано предположение, что этот домен перемещен из стрептококков групп C и G в штамм Finegoldia magna [3]. Такой межвидовой обмен структурно был определен как подвижный модуль и обозначен как GA модуль (G related albumin-binding domain).
На поверхности патогенных стрептококков группы G, Streptococcus canis, животного происхождения находится ЧСА-связывающий белок, содержащий два GA модуля [4]. Этот белок, в отличие от G белка, связывает только ЧСА и с более высокой ЧСА-связывающей активностью.
Интерес авторов к этому белку определила его способность к высокоселективному связыванию ЧСА. Нами были сконструированы рекомбинантные полипептиды А2, А3 и А4 на основе поверхностного ЧСА-связывающего белка путем амплификации в ПЦР фрагментов хромосомной ДНК штамма DG 13 Streptococcus canis и их последовательного клонирования в системе экспрессионных векторов pQE-30/31/32. Рекомбинантные дериваты ЧСА-связывающего белка, А2, А3 и А4, были очищены аффинной хроматографией. Их последовательности состоят из 346, 140 и 223 аминокислотных остатка, соответственно. Все три полипептида содержат ЧСА-связывающую область. Рекомбинантные полипептиды А2, А3
© Бормотова Е.А., Гупалова Т.В., 2014 г.
и А4, полученные методами генетической инженерии, предположительно должны обладать свойствами, характерными для их прототипа и одно из них - селективное взаимодействие с молекулами ЧСА, что позволило бы определить перспективу применения производных ЧСА-связывающего белка. Тем не менее, как показывает практика создания рекомбинантных полипептидов и полипептидов на основе ЧСА-связывающего белка, дифференциация производных по длине и положению ЧСА-связывающей области относительно N-конца значительно влияет на их свойства.
Настоящее исследование посвящено анализу особенностей и структурных аспектов взаимодействия ЧСА с рекомбинантными полипептидами А2, А3 и А4.
Материалы и методы. Во всех опытах для ИФА (прямого, непрямого и ингибиторного) использовали планшеты NUNC Maxisorp (Дания). Сенсибилизацию полипептидов А2, А3 и А4, разведенных в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), рН 7,4 проводили в течение 18 ч при 40С. Не связавшиеся реагенты удаляли трехкратным промыванием планшетов ФСБ с 0,05% твин 20 (ФСБТ). Активность пероксидазы хрена определяли с помощью субстрата, состоящего из тетраметиленбензидина, 0,1М фосфатно-цитратного буфера, pH 5,0 и 0,0065% перекиси водорода. Реакцию останавливали добавлением 2N серной кислоты. Оптическую плотность определяли на мультискане при длине волны 450 нм.
Результаты. Оценка селективности взаимодействия полипептидов А2, А3 и А4 с ЧСА. Избирательность взаимодействия полипептидов с ЧСА оценивали в трех вариантах ИФА. Прямой метод. В случае прямого ИФА полипептиды А2, А3 и А4 были иммобилизованы на твердой фазе. При этом оценивали количество связавшегося с ними меченого ЧСА (рис. 1). Полипептид А2 имел более высокую ЧСА-связывающую активность, чем полипептиды А3 и А4. На гистограмме (здесь и далее) приведены средние значения оптической плотности по данным нескольких опытов.
Рис. 1. Сравнение эффективности связывания полипептидов А2, А3 и А4 с ЧСА
Полипептиды А2, А3 и А4, имеют структурные различия, определяющие ЧСА-связывающую активность каждого из них. Можно допустить, что на реализацию этой способности влияют и условия постановки ИФА, а именно - нахождение полипептида на твердой фазе или в растворе. Способность полипептидов А2, А3 и А4 вступать во взаимодействие с ЧСА как в растворе, так и в адсорбированном состоянии, проверяли методами непрямого и ингибиторного ИФА.
Непрямой ИФА. В этом случае на твердой фазе адсорбировали ЧСА, к которому из раствора присоединялись молекулы А2, А3 или А4, в свою очередь связывающие из раствора меченный пероксидазой ЧСА. Рисунок 2 демонстрирует способность полипептидов, находящихся в свободном (не иммобилизованном) состоянии, связывать ЧСА. Однако, полипептид А2 связывал ЧСА с наибольшей активностью.
Ингибиторный РФА. Для постановки ингибиторного ИФА полипептиды А2, А3 и А4 были иммобилизованы на планшете. К ним добавляли заранее проинкубированную смесь соответствующего полипептида и разведенного меченого ЧСА. Проверялось связывание меченого ЧСА полипептидами в растворе. По значениям оптической плотности рассчитывали
процент ингибирования взаимодействия меченого ЧСА с адсорбированными молекулами А2, А3 и А4 каждым из полипептидов в растворе (рис. 3). Все полипептиды, находясь в растворе, препятствовали взаимодействию меченого ЧСА с адсорбированными молекулами А2, А3 и А4 в пределах 70-94%.
Рис. 2. Сравнение эффективности связывания в растворе полипептидов А2, А3 и А4 с ЧСА
Рис. 3. Сравнение эффективности связывания ЧСА адсорбированными полипептидами А2, А3 и
А4 и полипептидами А2, А3 и А4 в растворе
Таким образом, полипептиды А2, А3 и А4 обладали ЧСА-связывающей способностью, как в адсорбированном состоянии, так и в растворе. Однако, наибольшая способность связывать ЧСА принадлежит полипептиду А2, обладающего самой длинной аминокислотной последовательностью. Таким образом, особенности структуры каждого из трех полипептидов определяют различия между ними по ЧСА-связывающей активности.
Изученные особенности во взаимодействии с ЧСА открывают широкие перспективы практического применения рекомбинантных полипептидов А2, А3 и А4 при создании диагностикумов по определению уровня ЧСА, а также в качестве ЧСА-связывающих реагентов для аффинного выделения ЧСА и удаления ЧСА из сыворотки для последующего ее протеомного анализа.
Литература
1 Ватазин А.В. и др. Методы экстракорпоральной гемокоррекции в комплексном лечении бактериальных и вирусных инфекций после трансплантации почки. // Альманах клинической медицины. - 2013. C. 72-78.
2 Крстич М., Зулькарнаев А.Б. Этиопатогенетические аспекты развития гнойно-септических
осложнений и уросепсиса у пациентов с урологическими заболеваниями до и после трансплантации
почки: современный взгляд на проблему. // // Альманах клинической медицины. - 2013. - №28. - C. 79-81.
3 Сипкин А.М. и др. Верхнечелюстной синусит: современный взгляд на диагностику, лечение и
реабилитацию. // Альманах клинической медицины. - 2013. - №28. - C. 82-87.
4 Васечкина Л.И., Тюрина Т.К. Функциональные нарушения органов пищеварения у детей -алгоритмы диагностики и подходы к лечению. // Альманах клинической медицины. - 2013. - №27. - C. 3-8.
5. Балканов А.С. и др. Адъювантное применение темозоломида (темодала) и лучевой терапии в режиме гипофракционирования у пациентов с глиобластомой головного мозга. // Альманах клинической медицины. - 2013. - №27. - C. 8-12.
6. Крстич М., Морозов А.А., Ветчинникова О.Н., Самусевич В.А. Доброкачественная гиперплазия предстательной железы у больного на перитонеальном диализе: Современные возможности лечения. // Альманах клинической медицины. - 2013. - №27. - C. 12-14.
7. Захарова Н.М., Шатохина И.С., Волошин В.П., Еремин А.В., Зубиков В.С., Ошкуков С.А., Цыбин А.А. Особенности местной воспалительной реакции в области хирургического вмешательства при эндопротезировании крупных суставов. // Альманах клинической медицины. - 2013. - №27. - C. 1418.
8. Зар В.В. и др. Функциональная оценка результатов внутрисуставного введения полиакриламидного геля «Нолтрекс» при лечении пациентов с гонартрозом. // Альманах клинической медицины. -2013. - №27. - C. 18-27.
9. Куликов Д.А. и др. Компежация мышечной джфункции ^ямой кишки. // Биофизика. 2010. Т. 55. № 6. С. 1147-1148.
10. Mashkov A.E., Kulikov A.V. и др. Experience of anal insufficiency treatment using medullary transplantation in experiment and clinic. // Альманах клинической медицины. 2011. № 25. С. 13-16.
11. Куликов А.В. и др. Увеличение средней и максимальной продолжительности жизни за счет трансплантации аллогенных клеток тимуса в переднюю камеру глаза животных. // Усп. геронтол. 2013. Т. 26. С. 643-646.
12. Т.В. Гупалова, В.И. Голубков А.Н. Суворов, А.А. Тотолян - Получение и свойства рекомбинантного белка G // Вестник АМН. - 1996. - С. 44-49.
13. M. de Chateau, L. Bjorck - Protein PAB, a mosaic Albumin-binding Bacterial Protein Representing the First Contemporary Example of Module Shuffing // JBC - 1994. - № 269. - P. 121471-2151.
14. M.U. Johansson et al.- Differences in Backbone Dynamics of Two Homologous Bacterial Albuminbinding Modules: Implications for Binding Specifity and Bacterial Adaptation // J. Mol. Biol. - 2002. -P. 1083-1099.
15. U. Sjobring - Isolation and Molecular Characterization of a Novel Albumin-Binding Protein from Group G Streptococci // Infection and Immunity. - 1992. - № 62. - P. 3601 - 3608.
