Научная статья на тему 'Неиммунное взаимодействие белка М5 стрептококков группы А с компонентом комплемента C1q'

Неиммунное взаимодействие белка М5 стрептококков группы А с компонентом комплемента C1q Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
260
62
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
СТРЕПТОКОКК ГРУППЫ А / БЕЛОК М5 / АКТИВАЦИЯ СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА / КОМПОНЕНТ C1Q

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Королева Ирина Владимировна, Шохольм А., Шален К.

В работе было исследовано неиммунное связывание рекомбинантного белка М5 (рМ5), клонированного из стрептококка группы А М5-го серотипа, с компонентом комплемента Clq. Константа связывания Clq белком рМ5 была определена равной величине К = 6,8 x 107 М-1. Было показано, что глобулярный, а не коллагеноподобный фрагмент Clq неиммунно взаимодействовал с белком рМ5, и это взаимодействие не приводило к активации системы комплемента по классическому пути. Кроме того, было обнаружено, что белок рМ5 дозозависимым образом ингибировал активацию системы комплемента, вызванную инкубацией человеческой гипогаммаглобулиновой сыворотки с иммунным комплексом. Преинкубация белка рМ5 с Clq частично устраняла данный ингибирующий эффект, предполагается, что прямое связывание глобулярного фрагмента Clq белком рМ5, возможно, блокирует активацию системы комплемента по классическому пути.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Королева Ирина Владимировна, Шохольм А., Шален К.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Nonimmune Interaction Between Group A Streptococcal M5 Protein and Complement Component Clq

Recombinant M5 protein (rM5) cloning from group A streptococci type M5 was tested for nonimmune binding to complement factor Clq. The affinity constant for the binding of Clq to rM5 was estimated as К = 6.8 х 107М-1. It was demonstrated that the globular rather than the collagen-like fragment of Clq interacted with rM5 and this interaction didn't activate the classical pathway. Moreover, it was found that rM5 in dose dependent manner inhibited the activation of the classical pathway caused by human hypogammaglobulinemic serum incubation with the immune complex. Preincubation of rM5 with С1q partly abolished this inhibitory effect suggesting that the direct binding of the globular part of Clq to rM5 might block the classical pathway. (Med. Iinmunol., 2002, vol. 4, N 3, pp 439-446)

Текст научной работы на тему «Неиммунное взаимодействие белка М5 стрептококков группы А с компонентом комплемента C1q»

Медицинская Иммунология 2002, Т. 4, №3, стр 439-446 © 2002, СПб РО РААКИ

Оригинальные статьи

НЕИММУННОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БЕЛКА М5 СТРЕПТОКОККОВ ГРУППЫ А С КОМПОНЕНТОМ КОМПЛЕМЕНТА C1q

Королева И.В., Шохольм А.*, Шален К.*

Институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия * Институт инфекционных болезней и медицинской микробиологии, Лунд, Швеция

Резюме. В работе было исследовано неиммунное связывание рекомбинантного белка М5 (рМ5), клонированного из стрептококка группы А М5-го серотипа, с компонентом комплемента Clq. Константа связывания С1 q белком рМ5 была определена равной величине К =6,8x107 М'1. Было показано, что глобулярный, а не коллагеноподобный фрагмент С1 q неиммунно взаимодействовал с белком рМ5, и это взаимодействие не приводило к активации системы комплемента по классическому пути. Кроме того, было обнаружено, что белок рМ5 дозозависимым образом ингибировал активацию системы комплемента, вызванную инкубацией человеческой гипогаммаглобу-линовой сыворотки с иммунным комплексом. Преинкубация белка рМ5 с Clq частично устраняла данный ингибирующий эффект, предполагается, что прямое связывание глобулярного фрагмента Clq белком рМ5, возможно, блокирует активацию системы комплемента по классическому пути.

Ключевые слова: стрептококк группы А, белок М5, активация системы комплемента, компонент C1q.

Koroleva I. V, Sjoholm A., Schalen C.

NONIMMUNE INTERACTION BETWEEN GROUP A STREPTOCOCCAL M5 PROTEIN AND COMPLEMENT COMPONENT Clq

Abstract. Recombinant M5 protein (rM5) cloning from group A streptococci type M5 was tested for nonimmune binding to complement factor Clq. The affinity constant for the binding of Clq to rM5 was estimated as К =6.8xl07M'1. It was demonstrated that the globular rather than the collagen-like fragment of Clq interacted with rM5 and this interaction didn’t activate the classical pathway. Moreover, it was found that rM5 in dose dependent manner inhibited the activation of the classical pathway caused by human hypogammaglobulinemic serum incubation with the immune complex. Preincubation of rM5 with С1 q partly abolished this inhibitory effect suggesting that the direct binding of the globular part of Clq to rM5 might block the classical pathway. (MedJmmunol., 2002, vol.4, N 3,pp 439-446)

Введение

Streptococcus pyogenes, или стрептококки группы А (СГА), вызывают широкий спектр заболеваний человека от локальных (фарингит, импетиго), острых (ангина, скарлатина) до генерализованных форм, таких как стрептококковый сепсис, стрептококковый шоковый синдром и некротический фасцит. Патогенность этого вида микроба также выражается в его способности вызывать различные осложнения (отит, хорея, ревматизм и гломерулонефрит), последние из которых подчас принимают хронический характер, что становится причиной инвалидизации населения.

Адрес для переписки:

197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12, ГУНИИЭМ РАМН, отдел Молекулярной микробиологии, Королева Ирина Владимировна.

Тел.: (812) 234-05-42. Факс: (812) 234-94-77.

E-mail: root@suvorov.spb.su

Если в предыдущие десятилетия научные исследования были направлены на выявление продуктов стрептококковой клетки, вызывающих развитие инфекционного процесса, то в настоящее время акцент делается на изучении биологической роли взаимодействия компонентов стрептококковой клетки с белками организма хозяина. В этой связи взаимодействие СГА с иммунной системой человека естественно приобретает приоритетное значение. Одним из защитных механизмов иммунной системы человека является активация системы комплемента (СК) но классическому пути. Известно, что для инициации классического пути активации СК необходима прочная фиксация глобулярного фрагмента С^ Рс-час-тью иммуноглобулинов класса С и М. Однако не так давно было продемонстрировано, что и неиммунное взаимодействие ряда веществ с компонентом СЦ также приводит к активации СК по классическому пути [9].

В 70-х годах XX века появились сведения о неиммунном взаимодействии бактерий с компонентом Clq. Было установлено, что липополисахариды и порины, выделенные из ряда грамотрицательных бактерий (Klebsiella pnemoniae, Salmonella minnesota, Proteus mirabilis), активно взаимодействуют с Clq, что приводит к активации СК [1, 16, 17]. В случае же грамотрицательного патогена человека Neisseria gonorrhoeae наблюдался противоположный эффект: фиксация Clq на поверхности клеток способствовала защите бактерий от фагоцитоза и развитию экспериментальной бактериемии [19].

Первые опыты по исследованию взаимодействия СГА с иммунной системой человека, осуществленные в 40-50-х годах, были связаны с открытием устойчивости СГА к фагоцитозу полиморфноядерными лейкоцитами, обусловленной гиалуроновой капсулой и М-белком клеточной стенки СГА [4, 15]. Было обнаружено, что способность стрептококкового М-белка связывать фибриноген плазмы играет значительную роль в защите микроба от атаки со стороны иммунной системы человека [12]. Позже было продемонстрировано, что стрептококковый М-белок участвует в агрегации стрептококков, а также в процессах адгезии и инвазии клеток организма [5,8,20]. В настоящее время, с помощью методов молекулярной биологии, доказано, что “классический” М-белок, относится к более широкому семейству М-по-добных белков, обладающих гомологией в аминокислотной последовательности и сходной пространственной структурой [23, 24].

Ранее нами было показано взаимодействие фибриноген связывающих М-подобных белков СГА и компонента Clq в отсутствие антител [13]. Целью представленной работы стало более подробное изучение данного взаимодействия с использованием рекомбинантного белка М5 (рМ5).

Материалы и методы

СГА М5 серотипа (штамм 20/59) для выделения хромосомной ДНК с последующим клонированием етт гена был получен из Национального института здоровья (Прага, Чехия). Культура E.coli BL21(DE3), содержащая ген, кодирующий белок рМ5, была любезно предоставлена В.Е.Катеровым. Белок рМ5 очищали из лизата бактериальных клеток с помощью аффинной хроматографии на фибриноген-сефароза 4В колонке с последующей очисткой на колонке с сефадексом G-150.

Выделение и очистку компонента Clq из нормальной человеческой плазмы осуществляли с помощью ионообменной хроматографии и гель-фильтрации по методу Tenner с соавторами [28]. Глобулярный и коллагеноподобный фрагменты Clq получали по методам Paques с соавторами и Reid [21,25].

Конъюгирование пероксидазы хрена (ПХ) (Merck, Германия) с белками проводили с исполь-

зованием перйодатного метода с учетом эквимоляр-ных соотношений белков и ПХ. Для конъюгатов использовали: Clq человека, анти-Clq антитела и анти-С4с антитела (Lund University Hospital, Швеция).

Изучение Clq-связывания белком рМ5 проводили с помощью прямого метода иммуноферментного анализа (ИФА). По 50 мкл белка рМ5 сорбировали в лунках иммуноферментных (ИФА) планшетов с высокой сорбционной емкостью (Maxisorb, Nunc, Дания). Сорбцию проводили в течение 12 часов при t=20°C в 0,1 М бикарбонатном буфере, рН=9,6. После сорбции белка рМ5 планшеты 4 раза отмывали 0,01 М вероналовым буфером, содержащим 0,15 М NaCl и 0,01 М этилен-диамин-тетрауксусную кислоту, рН=7,4 (VBS-EDTA) и 0,05% Tween-20, и затем блокировали при t=20°C в течение 90 минут с помощью VBS-EDTA, содержащего 0,25% желатины и 0,25% Tween-20 (по 100 мкл). После очередной отмывки планшеты инкубировали с Clq, конъюгированным с ПХ, (Clq-ПХ) в разведении 1:400 при t=20°C в течение 90 минут. После инкубации планшеты отмывали 3 раза VBS-EDTA, содержащим 0,05% Tween-20, и один раз - забуференным физиологическим раствором, рН=7,4 (PBS). Реакцию визуализировали 0,1% раствором ортофенилендиами-на в 0,1 М цитратном буфере, рН=5,2, содержащем

0,05% перекись водорода. После инкубации в темноте в течение 30 минут оптическую плотность проб регистрировали повторно при 450 нм на приборе Titertek Multiskan (Хельсинки, Финляндия). Каждый эксперимент повторяли как минимум дважды, и пробы дублировали.

Для определения равновесной константы связывания (Ка) компонента Clq белком рМ5 был применен метод конкурентного связывания. Белок рМ5 в концентрации (К) К=1,5 мг/л сорбировали в лунках ИФА планшетов, как выше описано. После отмывок и блокирования разные концентрации немеченного Clq (от 0 до 54 нМ) либо фрагментов Clq (от 0 до 200 нМ; в экспериментах конкурентного ингибирования) добавляли одновременно с постоянной концентрацией конъюгата Clq-ПХ (1:400; по 50 мкл) для инкубации при t=20°C в течение 90 минут. После инкубации отмывку и детекцию результатов проводили аналогично методу, описанному выше.

Для определения С4с-депозиции, вызванной активацией системы комплемента по классическому пути, использовали двухслойный метод ИФА. По 50 мкл белка рМ5 (К=10 мг/л) сорбировали в лунках ИФА планшетов, как описано выше. После сорбции планшеты 4 раза отмывали PBS, содержащим 0,05% Tween-20 (PBST), и блокировали при t=20°C в течение 90 минут 0,1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS (по 100 мкл). После очередной четырехкратной отмывки PBST планшеты инкубировали с человеческой нормальной сывороткой (ЧНС) или с человеческой гипогаммаглобулиновой

сывороткой (ЧГС) (Lund University Hospital, Швеция) в различных разведениях в течение 15 минут при t=37°C. Сыворотки разводили в VBS буфере, содержащем 1,5х10~4М Са2+ и 5х10'5 М Mg2+ (VBS2+). ЧГС содержала иммуноглобулины IgG и IgM в концентрации: KIgG=0,18 г/л и KIgM=0,02 г/л.

Для создания иммунного комплекса (ЧСА - анти-ЧСА антитело) человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) сорбировали в лунках ИФА планшетов в PBS при t=20°C в течение 2 часов (К=200 мг/л; по 50 мкл). После трехкратной отмывки тем же буфером планшеты инкубировали с антителами к ЧСА (анти-ЧСА антитела) в PBST (К=100 мг/л; по 50 мкл) при t=20°C в течение 2 часов. Несвязавшийся белок был удален четырехкратной отмывкой PBST.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета стандартных программ Microsoft Excel.

Результаты

Взаимодействие рекомбинантного белка М5 с компонентом комплемента С1ц. Количественные характеристики связывания компонента С1^ белком рМ5, кодируемым етт геном, были получены с ис-

о

X X <? _ п ^ к 2S т х

0 *

К ГС

1 -« ё

ё 1

§ 2 X £

пользованием прямого твердофазного метода ИФА. Уровень связывания достигал максимального значения при концентрации белка рМ5, равной К=3,0 мг/л. Показатели связывания определяли через 5 минут инкубации белков при 1=20°С. Равновесного значения С1 q-cвязывaниe достигало через 60 минут. Дальнейшее увеличение времени инкубации существенно не влияло на уровень С ^-связывания.

Равновесную константу С^-связывания (Ка) определяли с помощью метода конкурентного связывания (см. Мат. и мет.). Анализ кривой связывания как функции концентрации немеченного С1д (рис. 1 А) позволяет говорить о существовании двух независимых типов связывания. В диапазоне малых значений концентраций СЦ (0-45 нМ) кривая связывания достигала уровня насыщения, что свидетельствует о наличии максимального числа мест связывания на молекуле белка рМ5 и характеризует первый тип связывания. Эти данные дали возможность рассчитать равновесную константу связывания Ка, используя метод Скэтчарда [26]. Константа связывания была определена как абсолютная величина тангенса угла наклона графика Скэтарда и оказалась равной Ка=6,8х107 М'1 (рис. 1Б). В области больших значений концентраций С1д (>45 нМ) кри-

Концентрация C1q (нМ)

И

И

=Г 2

£ о

S Z

Q) и

S о

X X 0) X

11 £ “

£

о

о

ш

о

£

Концентрация связанного комплекса (нМ)

Рис. 1. Определение равновесной константы связывания С1ц белком рМ5. Кривая связывания С1д белком рМ5 (1,5 мг/л) как функция концентрации С1 я (А). График Скэтчарда (Б): К=6,8хЮ7М '.

Концентрация ингибитора (нМ)

Рис. 2. Ингибирование глобулярным фрагментом С1 я (о) или коллагеноподобным фрагментом С1ц (■) связывания С1д-ПХ белком рМ5 (К=1,5 мг/л).

0,8 ■

0,7 I

I 0,6 ■

X

8 0,5

А I 0,4

0

1 0,3

§ 0,2 о с

0,1

о

Ю

0

X

X

1

о

р

25 50 100 200

Разведения нормальной сыворотки (титр)

400

0 25 50 100 200 400

Разведения гипогаммаглобулиновой сыворотки (титр)

Рис. 3. Связывание анти-С4с антитело-ПХ фиксированным С4с: после инкубации ЧНС (А) либо ЧГС (Б) с белком рМ5 (К=10 мг/л) (в) или иммунным комплексом (■).

вая связывания имела тенденцию дальнейшего роста, что говорит о наличии второго типа связывания с низкой аффинностью. Как правило, такой тип связывания носит электростатический характер, который зависит от ионного окружения.

Для определения части Clq, взаимодействующей с белком рМ5, был также использован метод конкурентного связывания (см. Мат. и мет.). Рис. 2 демонстрирует ингибирующее действие фрагментов Clq на связывание Clq-ПХ белком рМ5. Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод о том, что связывание Clq-ПХ белком рМ5 ингибируется глобулярным фрагментом Clq. Однако следует отметить, что при концентрациях белка рМ5 более 150 нМ наблюдалась тенденция ингибирования коллагеноподобным фрагментом Clq связывания Clq-ПХ белком рМ5. Поскольку такие концентрации относятся к области высоких значений, то взаимодействие коллагеноподобного фрагмента Clq с рМ5 можно рассматривать как неспецифическое. В данных экспериментах в качестве отрицательного контроля использовали Б С А, который не ингибировал Clq-связывание в исследуемом диапазоне концентраций.

Депозиция компонента комплемента С4с в ИФА планшетах с адсорбированным рекомбинантным белком М5. При активации СК по классическому пути происходит фиксация фрагмента С4 - С4Ь на поверхности, вызвавшей активацию. При изучении неиммунного связывания Clq белком М в данной работе был применен метод определения фиксации С4с (фрагмента С4Ь) с помощью анти-С4с антител, конъюгированных с ПХ. Таким образом, количественно определяя уровень анти-С4с-связывания с помощью двухслойного твердофазного метода ИФА можно было количественно оценить уровень С4с-депозиции. Для наглядности интерпретации результатов мы указываем величину С4с-депозиции в процентах, исходя из полученных значений анти-С4с-связывания. Рис. ЗА демонстрирует уровень депозиции С4с в планшетах с адсорбированными белком рМ5 (К=10 мг/мл) и иммунным комплексом (в качестве положительного контроля) после инкубации с человеческой нормальной сывороткой (ЧНС). Также необходимо отметить, что в контрольных экспериментах мы не наблюдали взаимодействия белка рМ5 с сывороточным С4 (ранее это было продемонстрировано Hong с соавторами [10]).

При высокой концентрации ЧНС в планшетах с адсорбированным белком рМ5 фиксировалось 79% С4с по сравнению с положительным контролем. Такую положительную реакцию можно объяснить присутствием в нормальной сыворотке антител к белку рМ5, что приводит к активации СК по классическому пути. С другой стороны, можно предположить, что данная активация является результатом прямого (неиммунного) связывания Clq белком рМ5.

Концентрация рМ5 белка (мг/л)

Рис. 4. Ингибирование белком рМ5 активации СК по классическому пути, вызванной в результате инкубации ЧГС (в разведении 1:80) с иммунным комплексом.

120

0 10 20 30 40 50

Концентрация белка рМ5 (мг/л)

Рис. 5. Эффект преинкубации С1 я с белком рМ5. С1 я (К=1 мг/л) (к) или буфер (■) были инкубированы с различными концентрациями белка рМ5. Затем эту смесь добавляли вместе с ЧГС (в разведении 1:80) к иммунному комплексу.

Для того, чтобы исключить влияние сывороточных анти-М5 антител вышеописанный эксперимент был повторен с человеческой гипогаммаглобулино-вой сывороткой (ЧГС), которая практически не содержала иммуноглобулинов класса С и М. Как показывает рис. ЗБ, даже при высокой концентрации ЧГС не отмечалось депозиции С4с в лунках планшетов с адсорбированным рМ5 при наличии положительного контроля. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что неиммунное связывание компонента СЦ белком рМ5 не приводит к активации СК по классическому пути.

Ингибирование экспериментально вызванной активации системы комплемента по классическому пути рекомбинантным белком М5. Для выяснения роли белка рМ5 в процессе активации СК различные концентрации белка рМ5 (от 1 до 100 мг/л)

добавляли одновременно с ЧГС (в разведении 1:80) к адсорбированному в лунках планшетов иммунному комплексу (рис. 4). Показатели связывания анти-С4с антител, конъюгированных с ПХ, были рассчитаны в процентах ингибирования максимальной величины связывания, вызванного инкубацией ЧГС с иммунным комплексом. При К=10 мг/л добавленного белка рМ5 был отмечен ингибирующий эффект анти-С4с-связывания, который при К=20 мг/л добавленного белка рМ5 достигал 18%. Добавление белка рМ5 в концентрации К=50 мг/л вызывало почти полное ингибирование (85%) анти-С4с-связы-вания и, следовательно, С4с-депозиции. Этот эксперимент дает основание утверждать, что белок рМ5 ингибирует активацию СК по классическому пути, инициированную иммунным комплексом. В качестве дополнительного контроля различные концентрации БСА добавляли одновременно с ЧГС для инкубации с адсорбированным в планшетах иммунным комплексом. Даже большие концентрации БСА (К>200 мг/л) не вызывали никакого ингибирования.

Эффект неиммунного связывания рекомбинантным белком М5. Ингибирующее действие белка рМ5 на экспериментально вызванную активацию СК по классическому пути можно объяснить результатом неиммунного взаимодействия СЦ с белком рМ5. Для подтверждения этой гипотезы возрастающие концентрации белка рМ5 инкубировали с постоянной концентрацией С^ (К=1 мг/л) в эпин-дорфах, и затем эту смесь добавляли вместе с ЧГС для инкубации с иммунным комплексом, адсорбированным в ИФА планшетах (рис. 5). Показатели связывания анти-С4с антител, конъюгированных с ПХ, рассчитывали в процентах от максимальной величины связывания, вызванного инкубацией ЧГС с иммунным комплексом. Рис. 5 демонстрирует, что при К=20 мг/л добавленного белка рМ5 (после пре-инкубации с СЦ) вместе с ЧГС к иммунному комплексу, адсорбированному в планшетах, происходило повышение уровня депозиции С4с до максимальной величины. Это дает возможность утверждать, что преинкубация С^ с данной концентрацией белка рМ5 устраняла его ингибирующий эффект на активацию СК. При больших концентрациях белка рМ5 (К=40 мг/л и К=50 мг/л) очевидно, что преинкубация С^ с белком рМ5 не полностью восстанавливала уровень С4с-депозиции до уровня положительного контроля, а, следовательно, не устраняла полностью ингибирующий эффект, вызванный белком рМ5. Можно предположить, что при концентрациях К=40 мг/л и К=50 мг/л белок рМ5 после преин-кубации с СЦ сохранял способность связывать СЦ из ЧГС. С другой стороны, принимая во внимание, что высокомолекулярный С^ имеет тенденцию к агрегации, комплекс рМ5-СЦ мог абсорбировать на себя другие молекулы С^ из ЧГС. Контрольные эксперименты, в которых белок рМ5 преинкубиро-

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

вали с БСА вместо С lq, показали, что данная преинкубация не оказывала влияния на уровень депозиции С4с.

Также было исследовано влияние фибриногена человека на неиммунное взаимодействие Clq с белком рМ5 в реакции конкурентного связывания, поскольку в плазме крови содержание фибриногена обычно достаточно высоко (2,0-4,5 г/л). Присутствие малых концентраций фибриногена (5-15 мг/л), не оказывало какого-либо эффекта на уровень Clq-свя-зывания белком рМ5. Высокие концентрации фибриногена (К=35 мг/л) усиливали уровень Clq-связывания более, чем в полтора раза, что вполне объяснимо, поскольку Clq способен взаимодействовать с фибриногеном [6].

Обсуждение

В работе Miller с соавторами [18] было продемонстрировано, что М-белки из OF-отрицательных СГА штаммов М5, Мб и М24 серотипов имеют высокий процент гомологии. Штаммы этих типов относятся к ревматогенным, т.е. вызывают процессы, приводящие к развитию различных форм ревматизма. Гены М-белков этих штаммов проклонированы и хорошо охарактеризованы. М-белок OF-отрицательных штаммов СГА, кодируемый етт геном, относится к так называемым “классическим” М-белкам. Основными отличительными особенностями “классического” М-белка являются его антифагоцитарная активность и способность связывать фибриноген [12, 15]. Вследствие антифагоцитарных свойств “классический” М-белок рассматривают в качестве основного фактора вирулентности Streptococcus pyogenes. В течение долгого времени считали, что взаимодействие М-белка с фибриногеном способствует подавлению фагоцитоза М-положительными штаммами [29]. Тем не менее, Jacks-Weis с соавторами продемонстрировали устойчивость отдельных М-положи-тельных штаммов (Мб и М49 серотипов) к фагоцитозу и в отсутствие фибриногена плазмы человека [11]. Хорошо установлено, что М-белок М5 и Мб штаммов не взаимодействует с Fe-частью IgG млекопитающих, что характерно для большинства штаммов СГА [14]. Взаимодействие СГА с Fe-частью IgG млекопитающих относят к механизмам патогенности стрептококков, поскольку это взаимодействие препятствует активации СК и приводит к “сбою” в работе иммунной системы человека [2, 3]. С другой стороны, среди 20 исследованных нами ранее СГА штаммы М5, Мб и М49 показали максимальный уровень связывания радиоактивного Clq [13]. Эти факты говорят в пользу предположения, что неиммунное связывание компонента Clq М-белком может играть для штаммов этих конкретных серотипов более значимую роль для защиты микробов в организме хозяина.

В настоящей работе были получены убедительные данные о способности белка рМ5 ингибировать экспериментально вызванную активацию СК по классическому пути. Мы предполагаем, что молекулы М-белка, добавленные в ЧГС, фиксировали сывороточный Clq. Это приводило к уменьшению концентрации сывороточного Clq, способного участвовать в активации СК, и, вследствие этого, блокированию нормальной активации СК по классическому пути. Преинкубация белка рМ5 с Clq приводила к частичной потере ингибирующего эффекта белком рМ5, что подтверждает предложенную выше интерпретацию.

Результаты проведенной работы показали, что неиммунное связывание белка рМ5 с глобулярной частью Clq не приводит к активации СК по классическому пути. Это позволяет предположить, что данное взаимодействие может блокировать связывание Clq с Fc-частью фиксированных антител класса G и М, тем самым помогая микробу, несущему М-белок, уменьшить атаку со стороны иммунной системы организма хозяина. Однако надо принять во внимание, что определенная нами константа связывания компонента Clq белком рМ5 (Ка=6,8х107 М1) приблизительно на два порядка ниже константы связывания антител белком М, что будет играть роль в случае конкурентного связывания, если компонент Clq и антитело имеют одинаковые сайты связывания на молекуле М-белка.

При фиксированной глобулярной части Clq на молекуле М-белка коллагеноподобная часть С1 q остается доступной для других взаимодействий, например, для связывания фибронектина, что, в свою очередь, может играть роль для адгезии микроба к клеткам организма хозяина. Несмотря на то, что на поверхности СГА имеются белки, специфически связывающие фибронектин, связывание фибронектина через коллагеноподобную часть Clq может дополнительно усиливать адгезивные свойства микроба. В поддержку этого предположения говорят опыты Sorvillo с соавторами, в которых было продемонстрировано, что неиммунное связывание Clq бактериями (5. aureus, S. epidermidis и Е. coli) значительно усиливало связывание фибронектина микробными клетками [27].

В исследованиях Lancefield 1962 года было показано, что добавление специфических анти-М антител к ЧНС приводило к полному фагоцитированию М-положительных штаммов [15]. Позднее эти данные неоднократно подтверждались другими авторами. В обзорной статье Fischetti при анализе анти-М антител, полученных к различным частям М белковой молекулы, был сделал вывод о том, что протек-тивными свойствами обладали анти-М антитела, полученные к N-терминальной части молекулы [7]. Значение N-терминальной части молекулы М-белка для блокады фагоцитоза было подтверждено и в

опытах Perez-Casal с соавторами [22]. Без сомнения идентификация области связывания компонента Clq на молекуле М-белка позволит получить дополнительные данные о механизмах антифагоцитарных свойств М-белков.

Список литературы

1. Alberti S., G. Marques, S. Camprubi, S. Merino, J.M. Tomas, F. Vivanco, and V.J. Benedi. Clq binding and activation of the complement and classical pathway by Klebsiella pneumoniae outer membrane protein // Infect. Immunity. - 1993. - Vol.61. - P.852-860.

2. Burova L.A., I.V. Koroleva, R.P. Ogurthzov, S.V. Murashov, M.L. Svensson, and C. Schalen. Role of streptococcal IgG Fc-receptor in tissue deposition of IgG in rabbits immunized with Streptococcus pyogenes // AP-MIS. - 1992. - Vol.100. - P.567-574.

3. Burova L.A., V.A. Nagornev, P.V. Pigarevsky, M.M. Gladilina, V.G. Seliverstova, C. Schalen, and A.A. Totolian. Triggering of renal tissue damage in the rabbit by IgG Fc-receptor-positive group A streptococci / / APMIS. - 1998. - Vol.106. - P.277-287.

4. Dale J.B., R.G. Washburn, M.B. Marques, and M.R. Wessels. Hyaluronate capsule and surface M protein in resistance to opsonization of group A streptococci // Infect. Immun. - 1996. - Vol.64. - P.1495-1501.

5. Ellen R.P., and R.J. Gibbons. M-protein-associat-ed adherence of Streptococcus pyogenes to epithelial surface: prerequisite for virulence // Infect. Immun. - 1972. Vol.5. - P.826-830.

6. Entwistle R.A., and L.T. Furcht. Clq component of complement binds to fibrinogen and fibrin // Biochemistry. - 1988. - Vol.27. - P.507-512.

7. Fischetti, V.A. Streptococcal M protein: molecular design and biological behavior // Clin. Microbiol. Rev. - 1989. - Vol.2. - P.285-314.

8. Fluckiger, U., K.F. Jones, and V.A. Fischetti. Immunoglobulins to group A streptococcal surface molecules decrease adherence to and invasion of human pharyngeal cells // Infect. Immun. - 1998. - Vol.66. - P.974-979.

9. Gewurz H., S.-C. Ying, H. Jiang, and T.F. Lint. Nonimmune activation of the classical complement pathway // Behring Ins. Mitt. -1993. - Vol.93. - P.138-147.

10. Hong, К., T. Kinoshita, J. Takeda, H. Kozono, P. Pramoonjago, Y.U.Kim, and K. Inoue. Inhibition of the alternative C3 convertase and classical C5 convertase of complement by group A streptococcal M protein // Infect. Immun. - 1990. - Vol.58. - P.2535-2541.

11.Jacks-WeisJ., Y. Kim, and P.P. Cleary. Restricted deposition of C3 on M+ group A streptococci: correlation with resistance to phagocytosis //J. Immunol. -1982. - Vol.128. - P. 1897-1902.

12. Kantor, F.S. Fibrinogen precipitation by streptococcal M-protein. I. Identity of the reactants, and sto-

ichiometry of the reaction // J. Exp. Med. - 1965. -Vol.121. - P.849-859.

13. Irina V. Koroleva, Anders G. Sjoholm and Claes Schalen. Binding of the complement subcomponent C1 q to Streptococcus pyogenes: evidence for interaction with the M5 and FcRA76 proteins // FEMS. - 1998. - P.l 1-20.

14. Kronvall G. A surface component in group A, C and G streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin G //J. Immunol. - 1973. - Vol.111. -P.1401-1406.

15. Lancefield, R.C. Current knowledge of type-specific M antigens of group A streptococci // J. Immun. -1962. - Vol.89. - P.307-313.

16. Latsch M., J. Mollerfeld, H. Ringsdorf, and M. Loos. Studies on the interaction of Clq, a subcomponent of the first component of complement, with porins from Salmonella minnesota incorporated into artificial membranes//FEBS Let. -1990. - Vol.276. - P.201-204.

17. Merino S., M.M. Nogueras, A. Aguilar, X. Rubi-res, S. Alberti, V.J. Benedi, and J.M. Tomas. Activation of the complement classical pathway (Clq binding) by Mesophilic Aeromonas hydrophila outer membrane protein // Infect. Immun. - 1998. - Vol.66. - P.3825-3831.

18. Miller L., L. Gray, E.H. Beachey, and M.A. Ke-hoe. Antigenic variation among group A streptococcal M proteins: nucleotide sequence of the serotype 5 M protein gene and its relationship with genes encoding types 6 and 24 M proteins // J. Biol. Chem. - 1988. -Vol.263. - P.5668-5673.

19. Nowicki S., P. Ram, T. Pham, P. Goluszko, S. Morse, G.D. Anderson, and B. NowickiPelvic inflammatory disease isolates of Neisseria gonorrhoeae are distinguished by Clq-dependent virulence for newborn rats and by the sac-4 region // Infect. Immun. - 1997. -Vol.65. - P.2094-2099.

20. Okada, N., A.P. Pentland, P. Falk, and M.G. Cap-aron. M protein and protein F act as important deter-

minants of cell-specific tropism of Streptococcus pyogenes in skin tissue //J. Clin. Invest. - 1994. - Vol.94. - P.965-977.

21. Paques E.P., R. Huber, and I. Priess. Isolation of the globular region of the subcomponent q of the Cl component of complement // Hoppe-Seyler’s Z. Physi-

ol. Chem. - 1979. - Vol.360. - P.177-182.

22. Perez-CasalJ., N. Okada., M.G. Caparon, and J.R. Scott. Role of the conserved C- repeat region of the M protein of Streptococcus pyogenes // Mol. Microbiol. -1995. -Vol.15.-P.907- 916.

23. Phillips G.N., P.F. Flicker, C. Cohen, B.N. Man-jula, and V.A. Fischetti. Streptococcal M protein: a-he-lical coiled-coil structure and arrangement on the cell surface // Proc.Natl. Acad. Sci. USA. -1981. - Vol.78. -P.4689-4693.

24. Podbielski A. Three different types of organization of the vir regulon in group A streptococci // Mol. Gen. Genet. - 1993. - Vol.237. - P.287-300.

25. Reid K.B.M. Isolation by partial pepsin digestion, of the three collagen-like regions present in subcomponent Clq of the first component of human complement // Biochem. J. - 1976. - Vol.155. - P.5-17.

26. Scatchard, G. The attraction of proteins for small molecules and ions // Ann. N. Y.-Acad. Sci. - 1949. -Vol.51. - P.660-672.

27. Sorvillo J.M., I. Gigli, and Pearlstein, E. The effect of fibronectin on the processing of С lq-and C3b/ bi-coated immune complexes by peripheral blood monocytes // J. Immunol. - 1986. - Vol.136. - P.1023-1026.

28. Tenner A.J., P.H.Lesavre, and N.R.Cooper. Purification and radiolabelling of human Clq//J. Immunol. - 1981. - Vol.127. - P.648-653.

29. Whitnack E., and E.H. Beachey. Biochemical and biological properties of the binding of himan fibrinogen to M protein in group A streptococci //J. Bacteriol. -1985. - Vol.164. - P.350-358.

поступила в редакцию 16.11.2001 принята к печати 04.12.2001

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.