CC BY
94
20. Matsubayashi H., Arai T., Izumi S., Sugi T., McIntyre J.A., Tsune-hisha M. Antiannexin V antibodies in patients with early pregnancy loss of implantation failure. Fertil. Steril. 2001; 26: 694-9.
21. Bizzaro N., Antico A., Musso M., Platzgummer S., Camogliano L., Tozzoli R. et al. A prospective study of 1038 pregnancies on the predictive value of anti-annexin V antibodies for fetal loss. Ann. N.Y. Acad. 2005; 1050: 348-56.
22. Rand J.H., Wu X.X., Quinn A.S., Taatjes D.J. The annexin A5-medi-ated pathogenic mechanism in the antiphospholipid syndrome: role in pregnancy losses and thrombosis. Lupus. 2010; 19: 460-9.
23. Bertolaccini M.L., Atsumi T., Koike T., Hughes G.R., Khamashta M.A. Antiprothrombin antibodies detected in two different assay systems. Prevalence and clinical significance in systemic lupus erythematosus. Thromb. Haemost. 2005; 93: 289-97.
24. Conti F., Allessandri C., Sorice M., Capozzi A., Longo A., Garofalo T. et al. Thin-layer chromatography immunostaining in detecting anti-phospholipid antibodies in seronegative anti-phospholipid syndrome. Clin. Exp. Immunol. 2012; 167: 429-37.
25. Sugi T. Kininogen-dependent antiphosphatidylethanolamine antibodies and autoantibodies to factor xII in patients with recurrent pregnancy loss. J. Obstet. Gynaecol. Res. 2013; 39 (7): 1223-9.
ORIGINAL ARTICLE
26. Bozic B., Cucnik S., Kveder T., Rozman B. Avidity of anti-be-ta-2-glycoprotein I antibodies. Autoimmunity Reviews. 2005; 4: 303-8.
27. Cucnik S., Kveder T., Artenjak A., Ulkova-Gallova Z., Swadzba J., Musial J. et al. Avidity of anti-P2-glycoprotein I antibodies in patients with antiphospholipid syndrome. Lupus. 2012; 21: 764-5.
28. Samarkos M., Davies K.A., Gordon C., Walport M.J., Loizou S. IgG subclass distribution of antibodies against P2-GP1 and cardiolipin in patients with systemic lupus erythematosus and primary antiphos-pholipid syndrome, and their clinical associations. Reumatology. 2001; 40: 1026-32.
29. Sammaritano L.R., Ng S., Sobel R., Lo S.K., Simantov R., Furie R. et al. Anticardiolipin IgG subclasses: association of IgG2 with arterial and/or venous thrombosis. Arthritis Rheum. 1997; 40 (11): 1998-2006.
30. Menzhinskaya I.V. IgG subclasses distribution and pathogenic activity of autoantibodies to human chorionic gonadotropin in women with a history of reproductive failure. Akusherstvo i gynekologiya. 2011; 3: 32-6. (in Russian)
Поступила 04.03.15 Принята к печати 18.06.15
БИОТЕХНОЛОГИЯ И ВАКЦИНЫ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 612.124.017.1.06
Сергеева В.Е., Трофимов А.В., Жахов А.В., Родин С.В., Ищенко А.М.
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ДЛЯ РЕГУЛЯЦИИ СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА
ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России, 197110, г. Санкт-Петербург
Моноклональные антитела (МАТ), способные влиять на функциональную активность комплемента, представляют в настоящее время повышенный интерес фармакологов и биотехнологов, разрабатывающих новые лекарственные средства для коррекции активации системы комплемента. В данной статье представлены способы иммунизации с использованием смесей, содержащих как нативные белки комплемента, так и их производные, образовавшиеся в процессе активации, и методы отбора гибридом для получения обширной панели МАТ к белкам системы комплемента человека. В результате такого подхода было получено 45 гибридом, продуцирующих МАТ к 10 белкам системы комплемента и продуктам их активации. Среди них были выявлены 12 типов МАТ различной специфичности, которые модулировали активность отдельных звеньев каскадных реакций комплемента. Детальное исследование функций антител позволило определить МАТ, блокирующие активацию комплемента по классическому и альтернативному пути, а также 2 типа МАТ, которые потенцировали активацию. В числе МАТ, полученных после иммунизации мышей сывороткой человека, активированной зимозаном или эритроцитами барана, были выявлены несколько типов антител к ключевым компонентам, которые блокировали активацию системы комплемента с высокой эффективностью в концентрациях, значительно ниже эквимолярных по отношению к уровням специфичных им компонентам, циркулирующим в сыворотке крови.
Рекомбинантные аналоги полученных МАТ, обладающих высокой нейтрализующей активностью, могут быть использованы для получения терапевтических антител, предназначенных для лечения патологий, связанных с неконтролируемой активацией комплемента. МАТ из полученной панели антител были использованы для разработки тест-систем для определения содержания компонентов комплемента в сыворотке крови человека и оценки уровня ее активации.
Ключевые слова: активация комплемента; блокирование системы комплемента; гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела.
Для цитирования: Сергеева В.Е., Трофимов А.В., Жахов А.В., Родин С.В., Ищенко А.М. Моноклональные антитела для регуляции системы комплемента человека. Иммунология. 2016; 37 (1): 9-13. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-1-9-13.
Для корреспонденции: Сергеева Валерия Евгеньевна - мл. науч. сотр. лаборатории биохимии белка ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России, E-mail: [email protected].
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Sergeeva V.E., TrofimovA.V., ZhakhovA.V., Rodin S.V., IshchenkoA.M.
MONOCLONAL ANTIBODIES FOR THE REGULATION OF THE COMPLEMENT SYSTEM OF MAN
Federal state unitary enterprise State research Institute of highly pure biopreparations of the Russian FMBA of Russia, 197110, St. Petersburg
Monoclonal antibodies (mAbs) that have capabilities to modulate the complement system activity currently are of special interest to pharmacologists and biotechnologists when designing novel antibody-based therapeutics. In the present study, we describe the methods for mice immunization using ( (a mixture of
native (un-cleaved) complement components and the complement activation fragments)), and the methods for generating and cloning hybridomas to produce a wide panel of mAbs reactive against human complement components. Altogether, we have developed 45 hybridomas, producing mAbs with reactivity against 10 complement components and complement activation fragments. Among these, we identified 12 clones of different specificity that were able to modulate activities of certain links of the complement cascade - some mAbs blocked complement activation via the classical and alternative pathways as well as 2 clones enhanced the complement activation.
Of the monoclonal antibodies produced by mice immunization with either zymosan- or sheep erythrocyte-activated NHS, we identified several high-reactive antibody clones that blocked complement activation in concentrations significantly below than equimolar to blood sera levels of the specific components.
Recombinant analogues of the monoclonal antibodies exhibiting high neutralizing activities might be suitable for designing antibody therapies for uncontrolled complement activation-associated pathologies. We have used the mAbs produced to design test kits for quantifying complement components and complement activation in human blood sera.
Keywords: complement activation; complement inhibition; hybridomas generating monoclonal antibodies.
citation: Sergeeva V.E., Trofimov A.V., Zhakhov A.V., Rodin S.V., Ishchenko A.M. Monoclonal antibodies for the regulation of the complement system of man. Immunologiya. 2016; 37 (1): 9-13. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-1-9-13.
For correspondence: Sergeeva Valeriya Evgen'evna - Junior researcher, laboratory of protein biochemistry State research Institute of highly pure biopreparations, St. Petersburg, Russia, E-mail: [email protected].
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Funding. The study had no sponsorship.
Received 14.04.15 Accepted 18.06.15
введение
В состав системы комплемента входят около 30 белков и гликопротеинов, включая растворимые белки, которые циркулируют в плазме крови в неактивном состоянии, а также мембранные рецепторы и регуляторные факторы, локализованные на клеточных мембранах [1]. Эволюционно система комплемента является одной из составляющих частей врожденного иммунитета, оказываясь барьером на пути вторгающихся в организм чужеродных агентов (бактерии, вирусы, простейшие, их производные). Проникшие микроорганизмы подвергаются прямой атаке комплементом в биологической среде хозяина и могут быть уничтожены в результате осмотического лизиса за счет перфорации клетки мембраноата-кующим комплексом С5Ь-9 (МАК), или путем комплемент-опосредованного фагоцитоза, происходящего вследствие захвата С4Ь, С3Ь, Ю3Ь - опсонизированных микроорганимов фагоцитами. Комплемент играет важную роль в развитии воспаления [2]. Главными воспалительными факторами являются анафилатоксины С3а, С5а, и С4а, а также МАК, которые образуются под действием конвертаз, формирующихся при активации системы комплемента [3]. В норме система комплемента сбалансирована, и спонтанная активация сдерживается за счет ряда ингибирующих факторов, дефицит которых, а также нарушение их функциональной активности, может приводить к неконтролируемой активации комплемента и развитию тяжелых патологий.
Так, например, дефицит С1-ингибитора, который контролирует сборку и активацию комплекса С1 (С^- (С1г-С^)2), строго связан с ангионевротическим отеком [4], а дефицит ингибитора сборки МАК на мембранах эритроцитов СD59 является причиной пароксизмальной ночной гемоглобину-рии [5].
Система комплемента может быть активирована не только микроорганизмами, но также циркулирующими иммунными комплексами, измененными структурными элементами собственных поврежденных тканей [6], а также при контакте крови с искусственными материалами (гемодиализные мем-
браны, имплантаты и др.) [7]. В этих случаях активация происходит в той же последовательности с образованием аналогичных интермедиатов, но с той лишь разницей, что при этом баланс физиологической активации может быть сдвинут в сторону ее усиления. При патологической активации комплемента в циркуляцию крови поступает значительное количество вновь образовавшихся биологически активных молекул, которые могут стимулировать системное воспаление и приводить к развитию тяжелых болезней [8].
Среди множества белков комплемента можно выделить ключевые компоненты и факторы, воздействие на которые позволяет достичь положительной коррекции, что может быть использовано при терапии комплемент-зависимых патологий. Имеются данные о том, что при почечной патологии блокирование фактора D, строго контролирующего активацию по альтернативному пути, положительно влияет на ход болезни [9]. Система комплемента активируется вследствие образования комплексных ферментов: С3 конвертазы классического и альтернативного пути С4Ь2а и СЗЬВЬ - соответственно; С5 конвертазы классического (С4ЬС2аС3Ь), альтернативного или лектинового пути [(ВЬС3Ь)пР], определяющие сборку МАК. Эти комплексные ферменты стабильны только в фиксированном связанном с активаторами состоянии, и быстро распадаются в растворе. Стабилизация конвертаз, возникающая вследствие некоторых патологий, как, например, в случае образования нефритического фактора, который представляет собой IgG к короткоживущей жидкофазной С3 конвертазе (С42), приводит к усиленному расходу С3 и С5 компонентов и соответственно к повышению уровня анафи-латоксинов [10].
Получение антител, которые ограничивают активность перечисленных ключевых компонентов и звеньев комплемента, в том числе способных препятствовать сборке конвертаз, может способствовать эффективной регуляции активности комплемента и достижению положительной терапевтической коррекции болезней [11-13].
Цель работы заключалась в получении широкой пане-
ли моноклональных антител, специфичных как к нативным компонентам комплемента, так и компонентам, претерпевшим конформационные изменения или подвергнувшимся ограниченному протеолизу в результате активации системы комплемента, а также в исследовании свойств этих антител.
Для достижения поставленной цели были использованы различные схемы иммунизации и специальные подходы при скрининге гибридом.
1. Иммунизация мышей линии Balb/c
Для получения гибридом, продуцирующих МАТ к натив-ным, функционально полноценным компонентам комплемента, первую группу животных иммунизировали нормальной пулированной сывороткой крови доноров.
С целью получения антител к компонентам, претерпевшим физиологически значимые изменения при альтернативном пути активации (АПК), вторую группу животных иммунизировали сывороткой, активированной зимозаном. Для этого 450 мкл сыворотки смешивали с 50 мкл 20 мМ Hepes буфера pH 7,4, содержащего 150 мМ NaCI, 100 мМ ЭГТА, 50 мМ MgCI2 и 10 мг/мл зимозана. Полученную смесь инкубировали при постоянном перемешивании в течение 60 мин при температуре 37 °С. По концентрации образуемого С3а судили об эффективности активации. Как правило, характеризующая активацию конверсия С3 составляла не менее 55-60%.
Третью группу животных иммунизировали сывороткой, активированной по классическому пути (КП). Смешивали 450 мкл сыворотки с 50 мкл 20 мМ Hepes буфера pH 7,4, содержащего 150 мМ NaCI, 15 мМ CaCl2, 5 мМ MgCI2 и 20 мг/ мл агрегированных человеческих иммуноглобулинов, иммобилизованных на Сефароза-4В. Полученную смесь инкубировали при постоянном перемешивании в течение 60 мин при температуре 37oC. По концентрации образуемого С3а судили об эффективности активации, конверсия С3 составляла не менее 10-15%.
Для иммунизации каждой группы животных 200 мкл раствора антигена смешивали с 300 мкг полного адъюванта Фрейнда, эмульгировали и вводили по 20 мкл в апоневроз задних конечностей. Через 28 дней мышам повторно внутривенно вводили 50 мкл антигена, разбавленного в 10 раз физиологическим раствором.
2. Слияние
Через четыре дня после второй иммунизации выделяли лимфоузлы и селезенку, источник B-лимфоцитов для проведения слияния. Слияние проводили по распространенному протоколу по Мильштейну-Келеру [14].
3. Определение специфичности МАТ проводили в режиме твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Для проведения ИФА использовали следующие буферные системы.
Посадочный буфер, используемый для сорбции белков на плату. Состав: 20 мМ боратный буфер рН-8,0, содержащий 150 мМ NaCI
Промывочный буфер, используемый на всех стадиях отмывки ячеек при проведении ИФА. Состав: посадочный буфер, содержащий 0,05% Tween 20.
Буфер Д для приготовления растворов антител, антигена и конъюгатов при проведении ИФА. Состав: промывочный буфер, содержащий 10 мг/мл бычьего сывороточного альбумина БСА.
Схема анализа. В ячейки плат с повышенной сорбцион-ной емкостью вносили по 100 мкл раствора козлиных поли-клональных антимышинных антител (производства Sigma Aldrich) с концентрацией 1,5 мкг/мл. Сорбцию проводили при комнатной температуре во влажной камере в течение 18 часов. После отмывки в ячейки вносили по 100 мкл куль-туральной среды, разбавленной в 5 раз буфером Д. Все инкубации проводили при 37oC на шейкере в течение 60 мин. После инкубации ячейки отмывали и вносили по 100 мкл
ORIGINAL ARTICLE
раствора антигена, по которому проходила иммунизация животных, разбавленного в 100 раз буфером Д. На последней стадии проведения ИФА в ячейки вносили рабочие разбавления поликлональных конъюгатов к компонентам комплемента (производства Behring Diagnostics). В качестве субстрата при окрашивании использовали раствор ТМБ (производства Хема).
4. Методы, позволяющие выявить МАТ, обладающие функциональной активностью
4.1 Определение способности МАТ влиять на активацию комплемента по альтернативному пути при активации зимозаном
Буфер F: 20 мМ Hepes буфер pH 7,4, содержащий 150 мМ NaCI, 10 мМ ЭГТА, 5 мМ MgCI2, 1 мг/мл БСА.
Буфер S для остановки активации комплемента: 20 мМ фосфатный буфер рН 7,4, содержащий 200 мМ ЭДТА и 10 мМ PMSF.
В ячейки платы для иммунологических работ вносили 50 мкл культуральной среды, 50 мкл раствора нативной сыворотки, содержащей 1 М 6-аминогексановой кислоты, разбавленной в 5 раз буфером F. Полученную смесь инкубировали в течение 5 мин на шейкере и затем в ячейки вносили 10 мкл буфера F, содержащего 10 мг/мл зимозана. В качестве контрольных точек определения максимальной активации использовали культуральную среду ячеек, не содержащих гибридом; для определения спонтанной активации в ряд контрольных ячеек после внесения раствора зимозана добавляли 10 мкл буфера S.
Ячейки инкубировали при постоянном перемешивании в течение 60 мин при температуре 37oC. Активацию комплемента останавливали внесением 10 мкл буфера S. Для определения концентрации С3а и С5а использовали иммунофер-ментные тест-системы ООО "Цитокин".
4.2 Определение способности МАТ влиять на активацию комплемента по альтернативному пути при активации эритроцитами кролика (гемолитический тест)
ВСБ: 25 мМ раствор 5,5'-диэтилбарбитурата натрия, содержащий 75 мМ NaCl и 20,5 г/л глюкозы, рН 6,1.
ЖВСБ (Mg, ЭГТА): ВСБ, содержащий 0,1% желатина, 5 мМ MgCl2, 10 мМ CaCl2.
В ячейки круглодонной платы для иммунологических работ вносили по 50 мкл культуральной среды, содержащей исследуемые МАТ, добавляли 50 мкл человеческой сыворотки, разведенной в 20 раз в ЖВСБ (Mg, ЭГТА), и после предварительной инкубации при перемешивании в течение 5 мин добавляли 50 мкл суспензии эритроцитов кролика в ЖВСБ (Mg, ЭГТА) с концентрацией 5-108 кл/мл. Плату инкубировали при постоянном перемешивании в течение 60 мин при температуре 37oC. По окончании инкубации клетки осаждали центрифугированием при 1000 g, супернатант переносили в плоскодонную плату и определяли оптическую плотность в ячейках при длине волны 415 нм.
В качестве контрольных точек определения максимальной активации использовали культуральную среду ячеек, не содержащих гибридом; для определения спонтанной активации в ряд контрольных ячеек после внесения суспензии эритроцитов добавляли 10 мкл буфера S.
4.3 Определение способности МАТ влиять на активацию комплемента по классическому пути (гемолитический тест)
ЖВСБ (Ca, Mg): ВСБ, содержащий 0,1% желатина, 0,5 мМ MgCl2, 1,5 мМ CaCl2.
Приготовление сенсибилизированных эритроцитов барана. Брали 300 мкл эритроцитарной массы, содержащей 3 109 эритроцитов. Эритроциты отмывали центрифугированием при 1000 g в ЖВСБ (Ca, Mg). Осадок эритроцитов после отмывки ресуспензировали в 6 мл ЖВСБ (Ca, Mg), содержащего реактив "Комплемент" (лиофилизат сыворотки морской свинки, иммунизированной эритроцитами барана), разве-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
а б
-ф— ССЗ-З ■ ССЗ-4 А ССЗ-6
О— CFD-1 * СС5-1 —#— СС5-2
Рис. 1. Процент ингибирования активации (ПИ) некоторых МАТ в различных концентрациях: а - ПИ (С3а); б - ПИ (С5а).
денный в 100 раз. Суспензию инкубировали при постоянном перемешивании в течение 30 мин при температуре 37oC.
По окончании инкубации эритроциты отмывали центрифугированием при 1000 g в ЖВСБ (Ca, Mg). Осадок эритроцитов разводили в ЖВСБ (Ca, Mg) до концентрации 5 108 кл/ мл. Оптическая плотность, соответствующая полному гемолизу, составляла 3,4 ед.
Схема анализа. В круглодонную плату для иммунологических работ вносили в каждую ячейку по 50 мкл сыворотки, разведенной в 20 раз в ЖВСБ (Ca, Mg) и 50 мкл культураль-ной среды. После предварительной инкубации в течение 5 мин в ячейки вносили по 50 мкл суспензии эритроцитов. Плату инкубировали при постоянном перемешивании в течение 60 мин при температуре 37oC. По окончании активации эритроциты осаждали центрифугированием, супернатант переносили в плоскодонную плату и определяли оптическую плотность в ячейках при длине волны 415 нм.
В данном анализе применялись такие же контрольные точки, как описано в п. 4.2.
5. Изотипирование МАТ
Изотипирование МАТ проводили с помощью набора kit ISO-2 фирмы Sigma согласно инструкции.
60 50 40 30 20 10
У7Л 77Л тт
Ч \ П/ \ Ч Ч Т, <Ь *>
с/ О^ сР4 ^ * * * о°
Рис. 2. Результаты гемолитического теста на способность МАТ блокировать КПК (процент ингибирования гемолиза для различных МАТ).
6. Наработка и выделение МАТ
Для наработки асцитов мышам линии Balb/с предварительно за 10 дней до введения клонов, вводили пристан (200 мкл/мышь). Клетки отобранных клонов вводили в брюшную полость мыши в количестве 1106 клеток/мышь. Через 2-4 нед мышей декапитировали. Из асцитных жидкостей выделяли МАТ с помощью хроматографии на белок-А сефарозе.
После очистки МАТ были диализованы против 20 мМ Hepes буфера pH 7,4, содержащего 150 мМ NaCI. В растворах определяли концентрацию МАТ.
результаты и обсуждение
В результате иммунизации тремя описанными способами и последующего скрининга было получено 45 гибридом, продуцирующих антитела к различным эпитопам белков комплемента: C1q, C3, C3a, C3d, C4, C4bp, C5, C5a, Factor H, Factor D, Clinh. Анализ показал, что 12 антител из них оказывали заметное воздействие на активацию комплемента. Основные характеристики этих МАТ приведены в таблице.
Для МАТ, приведенных в таблице, были проведены эксперименты, аналогичные описанным в п. 4.1, но вместо куль-туральных сред брали растворы МАТ в Буфере F различных концентраций. Концентрации МАТ рассчитывали исходя из концентрации антигена в сыворотке. В общем случае брали такие концентрации МАТ, чтобы молярное соотношение концентраций антитело/антиген было 4/1, 2/1, 1/1, 0,5/1, 0,25/1, 0,125/1, 0,0625/1. О степени активации комплемента по альтернативному пути судили по образованию в пробах анафи-латоксинов С3а и С5а. Полагали, что 100%-й активации соответствуют концентрации анафилатоксинов, измеряемые в контрольных пробах в отсутствие ингибирующих МАТ. Эффективность ингибирования комплемента зависела от концентрации внесенных специфических МАТ и выражалась в процентах ингибирования активации (ПИ), которые рассчитывали следующим образом:
ПИ = (А-В)/А100%,
где А - концентрация анафилатоксина в образце, не содержащем специфических МАТ; В - концентрация анафила-токсина в образце, содержащем тестируемые МАТ. [15]
На рис. 1 представлены зависимости способности некоторых МАТ подавлять активацию комплемента от концентрации МАТ в растворе.
Среди исследованных МАТ были найдены 2 типа анти-С5
ORIGINAL ARTICLE
Влияние МАТ на активацию комплемента по классическому пути по альтернативному пути
Наиме- Тип им- Функциональная актив-
нование муниза- Антиген Изотип ность
клона ции КП АПК
CC1q-1
CC1q-2
СС3-3
СС3-4
CC3-6
CC4-1
CC4-3
CC5-1
CC5-2
CC4bp-1
CFD-1
CFH-3
c1q c1q c3 c3 c3 c4 c4 c5 c5 c4bp Factor D Factor H
IgG1 IgM IgG2a IgG1 IgG1 IgG2a IgG2a IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1
Подавляет Подавляет Не влияет Не влияет Подавляет Подавляет Подавляет Подавляет Подавляет Усиливает Не влияет Не влияет
Не влияет Не влияет Усиливает Подавляет Подавляет Не влияет Не влияет Подавляет Подавляет Не влияет Подавляет Усиливает
лярных отношениях к С3 и С5 компонентам соответственно. Применяя в качестве антигена сыворотку, активированную по альтернативному или классическому пути, удалось получить антитела к другим антигенным детерминантам. Так антитело СС3-4 эффективно подавляло активацию комплемента по альтернативному пути в концентрациях, значительно ниже эквимолярных. При этой схеме иммунизации были получены несколько типов антител к С3 и С5 фрагментам, в том числе к анафилатоксинам С3а и С5а. На основе этих антител были разработаны методы для их количественного определения в цельной сыворотке. Были выявлены анти-СЗа и анти-С5а МАТ, которые подавляли биологическую активность анафилатоксинов, что дает основание рассматривать их в качестве основы для разработки терапевтических противовоспалительных антител.
Исследование не имело спонсорской поддержки.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА
3 15
Одинцов Ю.Н., Перельмутер В.М. Биологические функции комплемента. Бюллетень сибирской медицины. 2007; 2: 72-82. Картузова В.Е., Трофимов А.В., Ищенко А.М. Изучение антикомплементарной ингибирующей активности моноклональных антител. Цитокины и воспаление. 2014; 13 (1): 100.
антител и 4 типа анти-С3 антител, для которых ПИ > 90% достигался при соотношениях концентраций АТ/АГ от 4 до 1. Анти-FD антитела подавляли активность АПК в эквимоляр-ном соотношении. Наибольший интерес представляют выявленные анти-С3 МАТ, ингибирующее действие которых (ПИ > 90%) достигалось при существенном молярном недостатке по отношению к антигену: 1/16. Эти результаты указывают на то, что антитела распознают и блокируют ключевую детерминанту, которая экспонируется лишь на доле молекул С3, определяющих инициацию сборки активных конвертирующих ферментов комплемента. Это подтверждается тем фактом, что данные МАТ были получены при иммунизации мыши сывороткой, активированной по альтернативному пути.
Влияние МАТ на активацию комплемента по классическому пути. Для некоторых МАТ, приведенных в таблице, были проведены эксперименты, описанные в п. 4.3. Вместо культуральных сред использовали растворы очищенных МАТ с концентрацией, заведомо превышающей концентрацию антигена в реакционной смеси (рис. 2).
Выводы
Использование сложного композиционного антигена, каким является человеческая сыворотка, содержащая все компоненты и факторы комплемента, позволило в одну стадию иммунизации, минуя выделение отдельных белков, получить моноклональные антитела ко многим компонентам комплемента, таким как C1q, C1-ing, С3, С4, C5, факторам D и H. Наряду с этим, применяя разные схемы иммунизации и методы скрининга, нам удалось отобрать большое количество продуцентов МАТ к одним и тем же компонентам комплемента и его фрагментам. При этом характерно, что используя в качестве антигена неактивированную сыворотку, получили МАТ, которые распознавали нативные белки комплемента с высокой константой связывания. Данные МАТ оказались эффективными для разработки иммуноферментных тест-систем по определению С1-ингибитора, С3, С4 и С5 компонентов комплемента, факторов D и Н в сыворотке человека. Некоторые антитела, полученные в этой схеме иммунизации обладали способностью влиять на функциональную активность комплемента. Был выявлен один тип антител к С3 компоненту (CFH-3), потенцирующих активацию комплемента и два типа ингибирующих анти-С5 антител (СС5-1 и СС5-2). Модулирующие эффекты антител проявлялись при эквимо-
REFERENCES
1. Walport M.J. Complement. First of Two Parts. New Eng. J. Med. 2001; 344 (14): 1058-66.
2. Barrington R., Zhang M., Fisher M., Carrol M.C. The role of complement in inflammation and adaptive immunity. Immunol. Rev. 2001; 180: 5-15.
3. Odintsov Yu.N., Perelmuter V.M. Biological functions of complement. Byulleten'sibirskoy meditsiny. 2007; 2: 72-82. (in Russian)
4. Kaplan A.P. Enzymatic pathways in the pathogenesis of hereditary angioedema: the role of C1 inhibitor therapy. J. Allergy Clin. Immunol. 2010; 126 (5): 918-25.
5. Varela J.C., Brodsky R.A., Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and the age of therapeutic complement inhibition. Exp. Rev. Clin. Immunol. 2013; 9 (11): 1113-24.
6. Carroll M.V., Sim R.B. Complement in health and disease. Adv. Drug. Deliv. Rev. 2011; 63 (12): 965-75.
7. Nilsson B., Ekdahl K. N., Mollnes T. E., Lambris J. D. The role of complement in biomaterial-induced inflammation. Mol. Immunol. 2007; 44: 82-94.
8. Sarma J.V., Ward P.A. The Complement System. Cell Tissue Res. 2001; 343 (1): 227-35.
9. Elliott M.K., Jarmi T., Ruiz P., Xu Y., Holers V.M., Gilkeson G.S. Effects of complement factor D deficiency on the renal disease of MRL/lpr mice. Kidney Int. 2004; 65 (1): 129-38.
10. Paixao-Cavalcante D., Torreira E., Lindorfer M.A., Rodriguez de Cordoba S., Morgan B.P., Taylor R.P. et al. A humanized antibody that regulates the alternative pathway convertase: potential for therapy of renal disease associated with nephritic factors. J. Immunol. 2014; 192 (10): 4844-51.
11. Hu X., Holers V.M., Thurman J.M., Schoeb T.R., Ramos T.N., Barnum S.R. Therapeutic inhibition of the alternative complement pathway attenuates chronic EAE. Mol. Immunol. 2013; 54 (3-4): 302-8.
12. Okroj M., Heinegard D., Holmdahl R., Blom A.M. Rheumatoid arthritis and the complement system. Ann. Med. 2007; (39): 517-30.
13. Phuan P.W., Zhang H., Asavapanumas N., Leviten M., Rosenthal A., Tradtrantip L., Verkman A.S. C1q-targeted monoclonal antibody prevents complement-dependent cytotoxicity and neuropathology in in vitro and mouse models of neuromyelitis optica. Acta Neuropathol. 2013; 125 (6): 829-40.
14. Pandey S. Hybridoma technology for production of monoclonal antibodies. International J. Pharm. Sci. Rev. Res. 2010; 1 (2): 88-94.
15. Kartuzova V.E., Trofimov A.V., Ischenko A.M. Testing of the anticomplementary inhibiting activity of monoclonal antibodies. Citokiny i vospalenie. 2014; 13 (1): 100.
Поступила 14.04.15 Принята к печати 18.06.15
