CC BY
118
2014
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
Сер. 11
Вып. 3
ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ. ЭПИДЕМИОЛОГИЯ. МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 577.112:577.2
Е. А. Бормотова1, А. Н. Суворов1,2, Т. В. Гупалова1
ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ СТРЕПТОКОККА ГРУППЫ G И АНАЛИЗ ИХ СПОСОБНОСТИ СВЯЗЫВАТЬ АЛЬБУМИН ЧЕЛОВЕКА
1 Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН, Российская Федерация, 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12
2 Санкт-Петербургский государственный университет, Российская Федерация, 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9
Многие грамположительные бактерии продуцируют поверхностные белки, которые связывают человеческий сывороточный альбумин (ЧСА). Они могут использоваться как аффинные реагенты для выделения ЧСА из сыворотки крови и для получения его в высокоочищенном состоянии и как партнеры для слияния с рекомбинантными белками для облегчения их аффинной очистки. Рекомбинантные ЧСА-связывающие белки могут найти применение и в лабораторной диагностике для количественного определения ЧСА в различных биологических жидкостях. Кроме того, они могут быть использованы в протеомике для удаления ЧСА из сыворотки крови человека. Для этого необходимо создать реагент, обладающий способностью связывать ЧСА с высокой специфичностью. Настоящее исследование посвящено получению рекомбинантных полипептидов, обладающих высокой способностью специфически связывать ЧСА. Рекомби-нантные полипептиды А1, А2 и А3 получены из стрептококка группы G, выделенного из коровьего молока. Они обладают высокой ЧСА-связывающей активностью. Однако полипептид А1, состоящий из областей N, E1, E2, области двух ЧСА-связывающих GA модулей и W области и имеющий самый большой молекулярный вес, обладает и самой высокой аффинностью по отношению к ЧСА. Показано, что аффинность полипептида по отношению к ЧСА зависит от структуры и размера всего полипептида. Библиогр. 14 назв. Ил. 5. Табл. 1.
Ключевые слова: стрептококки группы G, ЧСА-связывающие GA модули, рекомбинантные полипептиды.
PRODUCTION OF RECOMBINANT POLYPEPTIDES OF GROUP G STREPTOCOCCUS AND ANALYSIS OF THEIR ABILITY TO BIND HUMAN SERUM ALBUMIN
E. A. Bormotova1, A. N. Suvorov1,2, T. V. Gupalova1
1 Institute of Experimental Medicine of the North-West Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, 12, ul. akad. Pavlova, St. Petersburg, 197376, Russian Federation
2 St. Petersburg State University, 7/9, Universitetskaya nab., St. Petersburg, 199034, Russian Federation
Many Gram-positive bacteria produce surface proteins that bind human serum albumin (HSA). They can be used as affinity reagents for the isolation of HSA from serum and receiving it in a highly purified condition; and as a fusion partners with recombinant proteins to facilitate their affinity purification. Recombinant HSA-binding proteins can be used in the laboratory diagnostics, for example for the quantitative detection of HSA in various biological fluids. Furthermore, they can find an application in
proteomics for the removal of HSA from human serum. Therefore, it is necessary to create a reagent, binding HSA with high specificity. This study is devoted to synthesis of recombinant polypeptides having high capability to exclusively bind HSA. The recombinant polypeptides A1, A2 and A3 are derived from Streptococcus group G, extracted from cow's milk. They have high HSA-binding activity. However, A1 polypeptide, containing the areas N, E1, E2, region of the two HSA-binding GA modules and W region, has the highest molecular weight, and the highest affinity towards HSA. It was shown that the affinity of the polypeptide towards HSA both depends on the structure and size of the entire polypeptide. Refs 14. Figs 5. Table 1.
Keywords: group G streptococci, HSA-binding modules GA, recombinant polypeptides.
Многие грамположительные бактерии продуцируют поверхностные белки, способные связывать человеческий сывороточный альбумин (ЧСА). Такие белки из различных видов бактерий содержат ЧСА-связывающие домены. Поверхностный белок одного из штаммов анаэробных бактерий Finegoldia magna (прежнее название Peptostreptococcus magna), связывающий ЧСА, PAB (peptostreptococcal albumin binding) белок, содержит домен в 45 аминокислотных остатков, отвечающий за это связывание [1]. Данная последовательность показала высокую степень гомологии с ЧСА-связывающими доменами белка G, выделенного из штамма G148 стрептококка группы G человеческого происхождения. Стрептококковый белок G связывает и иммуноглобулин G, и ЧСА. Анализ гена, кодирующего PAB белок, показал, что этот домен произошел из белка G и был перенесен и введен в pab ген с помощью конъюгативной плазмиды, с последующей рекомбинацией [2]. Такой межвидовой обмен структурно определен как подвижный модуль в прокариотических клетках и обозначен как ЧСА-связывающий GA модуль.
Методами ядерно-магнитного резонанса и рентгеноструктурной кристаллографии определена структура GA модуля из стрептококкового белка G, а также структура ЧСА в комплексе с GA модулем PAB белка Finegoldia magna [3, 4]. Модель комплекса показывает связывающий эпитоп, локализованный во втором домене молекулы ЧСА. ЧСА-связывающий GA модуль имеет закрученную влево трехспи-ральную структуру, в которой аминокислоты второй и третьей спирали вовлечены в связывание с молекулой ЧСА [5, 6].
Белки, способные связывать ЧСА, могут использоваться как аффинные реагенты для выделения альбумина из сыворотки крови и для получения его в высокоочи-щенном состоянии и как партнеры для слияния с рекомбинантными белками для облегчения их аффинной очистки [7, 8]. Рекомбинантные ЧСА-связывающие белки могут найти применение и в лабораторной диагностике в тест-системах для количественного определения ЧСА в различных биологических жидкостях [9].
Кроме того, они могут быть использованы в протеомике для удаления альбумина из сыворотки крови человека. Около 70% общего содержания белков сыворотки крови приходится на ЧСА. В то же время именно соотношение минорных компонентов в плазме представляет наибольший интерес для протеомных исследований. Поэтому залогом успешного проведения протеомного анализа является специфичное удаление ЧСА из сыворотки крови. Для этого необходимо создать реагент, обладающий способностью связывать ЧСА с высокой специфичностью. Некоторые штаммы стрептококков группы G, выделенных из коровьего молока, в отличие от штаммов стрептококка группы G, выделенных от человека, не связывают иммуноглобулин G, но по способности связывать ЧСА превосходят их.
Настоящее исследование посвящено получению рекомбинантных полипептидов из стрептококка группы G, выделенного из коровьего молока, обладающих высокой способностью специфически связывать ЧСА.
Материалы и методы. Использован штамм стрептококка группы G, Streptococcus canis, DG13, выделенный из коровьего молока и полученный из Института медицинской микробиологии Университета Лунда, Швеция. Хромосомную ДНК штамма DG13 использовали в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для выделения хромосомной ДНК клетки микроба лизировали 50 мМ ЭДТА (Serva, Германия) и лизоцимом в концентрации 1 мг/мл. ДНК депротеинезировали фенолом и хлороформом, а затем экстрагировали спиртом.
Фрагменты ДНК, соответствующие различным областям гена ЧСА-связывающего белка, были амплифицированы в ПЦР с помощью Taq полимеразы («Ampli Taq», Perkin-Elmer, Cetus, США) и амплификатора (Bio-Rad, США). Выделение амплифицированного участка ДНК проводили с использованием набора «QIA-quick Gel Extraction Kit» (Qiagen, США). Олигонуклеотидные праймеры представлены в таблице.
Таблица. Олигонуклеотидные праймеры
Название Ориентация Нуклеотидная последовательность от 5' к 3'
РА1 Прямой CGGGATCCCGTCTGTGCTAGTTGGTGCGAA
РА2 Обратный GGGGTACCCCACAGATTCGCCTGTCGATGG
РАЗ Прямой GG GGTACCCСTTTAGATCAAGСTAAGCAAG
РА4 Обратный AAAACTGCAGTTCGCCTGTCGATGGAAGTT
РА5 Обратный TGGTTAAGCTTAGGAGTTAAGAATAAGGTCTTT
pQE 1 Прямой GCGGATAACAATTTCACACAGAA
pQE 2 Обратный CCGTAATATCCAGCTGAACG
Выделенные полужирным шрифтом звенья нуклеотидной последовательности указывают на сайты рестрикции.
Конструирование рекомбинантных плазмид. Клонирование амплифицирован-ных фрагментов ДНК осуществляли с помощью системы экспрессионных векторов pQE 30/31/32 («The QIAexpress System» Qiagen, США) по сайтам рестрикции, заложенным в праймеры при их конструировании. Продукты гидролиза ДНК разделяли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле и выделяли из агарозы с помощью набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, США), лигировали и трансформировали в гетерологичную систему E. coli М15. Процедуры лигирования и трансформации проводили по Маниатису [10]. Среды для отбора трансформантов содержали 100 мкг/мл ампициллина и 25 мкг/мл канамицина. Антибиотикоустойчивые трансформанты откалывали на две параллельные чашки Петри с антибиотиками. Колонии с одной чашки переносили на нитроцеллюлозную мембрану и вскрывали раствором, содержащим 0,2 N NaOH, 0,1% SDS и 0,5% ß-меркаптоэтанола. Далее мембрану отмывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и инкубировали 1 ч при комнатной температуре в блокирующем растворе (2 части 3% молока и 1 часть ФСБ) для удаления неспецифического связывания и затем в блокирующем растворе, содержащем ЧСА, меченный пероксидазой хрена (Sigma, США). После этого мембрану последо-
вательно отмывали блокирующим раствором и ФСБ. Пероксидазную активность проявляли раствором тетраметилбензидина (Sigma, США). Из колоний с наиболее выраженной экспрессией ЧСА-связывающей активности выделяли рекомбинант-ные плазмиды с помощью Mini-prep. plasmid DNA purification kit (Qiagen, США).
Получение и анализ рекомбинантных белков. Клоны E. coli M15, содержащие рекомбинантные плазмиды, культивировали в жидкой среде LB с антибиотиками (ампициллин, 100 мкг/мл, и канамицин, 25 мкг/мл) до поздней логарифмической фазы роста (OD600 0,7-0,9). Экспрессию рекомбинантного белка индуцировали изопропил-бета^-тиогалактопиранозидом (Хеликон, Россия) и клетки культивировали еще 4 ч. Бактерии осаждали центрифугированием, отмывали буфером А (20 мМ Ш2НРО4, 20 мМ NaH2PO4, 500 мМ NaCl, 20 мМ имидазола, pH 8,0) и суспендировали в том же буфере, добавляя ингибитор протеаз, фенилметилсульфонилфторид, до концентрации 1 мМ. Суспензии клеток вскрывали ультразвуком и центрифугировали. Надосадочные жидкости наносили на колонки, заполненные Ni-сефарозой (Qiagen, США). После того как полипептиды связывались с Ni-сефарозой, колонки промывали буфером А для удаления несвязавшихся белков. Рекомбинантные полипептиды элюировали буфером Б (20 мМ Na2HPO4, 20 мМ NaH2PO4, 500 мМ NaCl, 250 мМ имидазола, pH 8,0). После аффинной хроматографии полипептиды диализо-вали 18 ч против дистиллированной воды. Концентрацию белка определяли по методу Лоури [11]. Молекулярные массы рекомбинантных полипептидов определяли в SDS электрофорезе в 12% полиакриламидном геле.
Анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей. Нуклеотидная последовательность полученных фрагментов гена ЧСА-связывающего белка была определена фирмой Синтол (Москва). Аминокислотную последовательность полипептидов определяли на основании данных нуклеотидной последовательности, кодирующей соответствующий полипептид, с использованием компьютерной программы ExPASy [12]. Молекулярную массу и изоэлектрическую точку полипептидов вычисляли по компьютерной программе Compute pI/Mw tool [13].
Методы изучения взаимодействия рекомбинантных полипептидов с ЧСА. Способность рекомбинантных полипептидов связывать ЧСА изучали методами рецеп-торноферментного анализа (РФА) [9]. Для РФА использовали планшеты NUNC Maxi Sorp (Дания).
П р я м о й м е т о д. Иммобилизацию каждого полипептида в концентрации 1 мкг/мл, разведенного в ФСБ, проводили в течение 18 ч при 4°С. В контрольные лунки вместо раствора полипептида вносили раствор ФСБ. Несвязавшийся полипептид отмывали три раза добавлением по 150 мкл ФСБ с 0,05% твин 20 (ФСБТ) в каждую лунку. Во все лунки вносили двукратные разведения ЧСА, меченного пероксидазой, и инкубировали 1 ч. Избыток ЧСА удаляли трехкратным отмыванием раствором ФСБТ. Активность пероксидазы хрена определяли с помощью субстрата, состоящего из тетраметиленбензидина, 0,1 М фосфатно-цитратного буфера, pH 5,0 и 0,0065% перекиси водорода. Реакцию останавливали добавлением 2N серной кислоты. Оптическую плотность определяли на мультискане при длине волны 450 нм.
Метод конкурентного ингибирования. ЧСА, разведенный в ФСБ, в концентрации 1 мкг/мл адсорбировали на планшете в течение 18 ч при 4°С. Несвязавшийся альбумин три раза отмывали раствором ФСБТ. Затем наносили по 50 мкл каждого полипептида в двукратных разведениях, начиная с 20 мкг/мл, и по 50 мкл
ЧСА-связывающего полипептида, меченного пероксидазой, в соответсвующем разведении. В контрольные лунки вместо растворов полипептидов вносили раствор ФСБ, и планшет инкубировали при 37°С. Далее планшет отмывали три раза раствором ФСБТ. Активность пероксидазы хрена определяли, как описано в прямом методе.
Результаты и обсуждение. ЧСА присутствует в сыворотке в высокой концентрации в пределах от 35 до 50 мг/мл, поэтому для его удаления требуется получение полипептида, обладающего высокой способностью специфически связывать ЧСА. Из литературных данных известны нуклеотидная и аминокислотная последовательности ЧСА-связывающего белка стрептококка группы G животного происхождения. Последовательность этого белка состоит из NH2 — терминальной области (N), областей Е1 и Е2, области с двумя ЧСА-связывающими GA модулями и области W. На основании этой последовательности были сконструированы праймеры к различным фрагментам гена, кодирующего ЧСА-связывающий белок штамма DG13 стрептококка группы G. Этот штамм был выбран в результате скрининга коллекции штаммов стрептококков группы G, выделенного из коровьего молока, на выявление способности связывать ЧСА с наибольшей активностью [9].
Клонировали следующие фрагменты гена ЧСА-связывающего белка штамма DG13, кодирующие различные по размеру ЧСА-связывающие полипептиды:
1) фрагмент гена, кодирующий последовательность, состоящую из областей N, E1, E2, двух ЧСА-связывающих GA модулей и области W;
2) фрагмент гена, кодирующий последовательность двух ЧСА-связывающих GA модулей и области W;
3) фрагмент гена, кодирующий последовательность только двух ЧСА-связывающих GA модулей.
Получение фрагментов гена ЧСА-связывающего белка из штаммов DG13 стрептококка группы G и конструирование рекомбинантных плазмид. Для клонирования фрагментов гена 1, 2 и 3 были сконструированы соответствующие олигонуклеотиды РА1 и РА2, РАЗ и РА4, РАЗ и РА5. Они служили праймерами в ПЦР, где геномная ДНК штамма DG13 использовалась как матрица.
Амплифицированный первый фрагмент ДНК и плазмида pQE 32 были рестри-цированы эндонуклеазами BamHI и KpnI, второй фрагмент ДНК и плазмида pQE 30 — KpnI и PstI, третий фрагмент и плазмида pQE 30 — HindIII и KpnI. Полученные фрагменты лигировали и ими трансформировали E. coli М15. Из клонов, обнаруживших выраженную экспрессию ЧСА-связывающей активности, были выделены плазмиды. Наличие в них рекомбинантных ДНК подтверждали в ПЦР с исходными праймерами. Рекомбинантную плазмиду, обозначенную как pQE 32^а1, рестри-цировали KpnI и BamHI с получением фрагмента ДНК в 999 п. н. Рекомбинантную плазмиду, обозначенную как pQE 30-ра2, рестрицировали KpnI и PstI с получением фрагмента ДНК в 612 п. н. Рекомбинантную плазмиду, обозначенную как pQE 30-pa3, рестрицировали HindIII и KpnI с получением фрагмента ДНК в 363 п. н. Плаз-мидные ДНК pQE 32^а1, pQE 30-ра2 и pQE 30-pa3 использовали как матрицы в реакции ПЦР с праймерами pQE1 и pQE2. Амплификаты выделяли после электрофореза в 1% агарозном геле и секвенировали. Данные секвенирования нуклеотидных последовательностей полученных полипептидов совпали с известной нуклеотидной последовательностью, кодирующей ЧСА-связывающий полипептид [14].
На рисунке 1 представлена нуклеотидная последовательность плазмидной ДНК pQE 32-ра1 (1038 п. н.), кодирующая аминокислотную последовательность полипептида А1, состоящего из 346 аминокислотных остатков. Полипептид А1 содержит аминокислотную последовательность, соответствующую областям N, E1, E2, области с двумя ЧСА-связывающими GA модулями и области W (333 аминокислотных остатка), ковалентно связанную с 13 аминокислотными остатками, кодируемыми pQE 32.
На рисунке 2а представлена нуклеотидная последовательность плазмидной ДНК pQE 30-ра2 (669 п. н.), кодирующая аминокислотную последовательность полипептида А2, состоящего из 223 аминокислотных остатков. Полипептид А2 содержит аминокислотную последовательность, соответствующую области с двумя ЧСА-связывающими GA модулями и области W (204 аминокислотных остатков), ковалентно связанную с 19 аминокислотными остатками, кодируемыми pQE 30.
На рисунке 2б представлена нуклеотидная последовательность плазмидной ДНК pQE 30-pa3 (420 п. н.), кодирующая аминокислотную последовательность полипептида А3, состоящего из 140 аминокислотных остатков. Полипептид А3 содержит аминокислотную последовательность, соответствующую области с двумя ЧСА-связывающими GA модулями (121 аминокислотный остаток), ковалентно связанную с 19 аминокислотными остатками, кодируемыми pQE 30.
Выделение и очистка рекомбинантных полипептидов. Из штаммов, несущих рекомбинантные плазмиды, pQE 32^а1, pQE 30-ра2, pQE 30-ра3, были выделены и очищены полипептиды А1, А2, А3. Молекулярные массы полипептидов, определенные с помощью SDS-электрофореза в полиакриламидном геле, составили соответственно: А1 — 48 кДа, А2 — 27 кДа, А3 — 15 кДа (рис. 3), величины которых совпали с данными компьютерного анализа. Значения изоэлектрических точек полипептидов, рассчитанные по программе Compute Pi/Mw tool, составили соответственно: 5,4; 7,04; 7,02.
Сравнение селективности взаимодействия полипептидов А1, А2, А3 с ЧСА. Избирательность взаимодействия полипептидов с ЧСА оценивали с помощью методов РФА. На планшет сорбировали одинаковое количество каждого полипептида в концентрации 1 мкг/мл. Анализ ЧСА-связывающей способности методом прямого РФА показал, что все исследуемые полипептиды обладали ею в отношении меченого ЧСА, причем количество ЧСА, связанного полипептидами А1, А2 и А3, было практически одинаковым. Все три рекомбинантных полипептида обладали высокой ЧСА-связывающей активностью и содержали область с двумя ЧСА-связывающими GA модулями, но отличались размером и структурой. В связи с этим было сделано предположение, что аффинность этих полипептидов по отношению к ЧСА может зависеть от их структуры и, соответственно, их размера.
Для проверки этого предположения на планшете было сорбировано одинаковое количество молекул каждого полипептида. В предварительном эксперименте было показано, что на планшет может сорбироваться не более 0,3 мкг/мл полипептида. В соответствии с молекулярным весом каждого полипептида на планшет сорбировали полипептида А1 — 0,3 мкг/мл, А2 — 0,2 мкг/мл, А3 — 0,1 мкг/мл. Далее анализ проводили, как в прямом методе РФА. В результате эксперимента оказалось, что молекула полипептида А2, имеющая в своем составе область W и область с двумя ЧСА-связывающими GA модулями и вследствие этого молекулярную массу
ATGAGAGGATCTCACCATCACCATCACCATGGGATCCCGTCTGTGCTAGTTGGTGCGAAT 60
XotArgGlySorHisHisHisHi3HisHisGlyIleProSorValLeuValGlyAlaAsn 20
actgtttctgc/Eaagttacgacaagagctcaagctaaggctgcacgagaaacagcatta 120
ThrValScrAlqGlnValThrThrArgAlaGlnAlaLysAlaAlaArgGluThrAlaLeu <0
GCAAGTATTGCTGAAACAGAATCATCTATCAAAGACAAAGCACAGTTAGATTCAGTAAAA 180
AlaSorlloAlaGluThrGluSorSerlloLysAspLysAlaGlnleuAspSorValLys 60
GAAAAAATTAAAGCTTCTGTTGATAGAGATGAGATTACAGAATTGTCGGCGCAAGCijsAC 240
GluLysIleLysAlaSerValAspArgAspGluIleThrGluLcuSorAlaGlnAlqAsp 80
CAGATTGTTTCTGCACAAGCAGATAACGAAGCTATTACTAAGGCAGAAGAAGATTCTTCC 300
GlnlleVaiSerAlaGinAlaAspAsnGluAlalieThrLysAiaGluGiuAspSorSer 100
AAGGCATGGGAAGCTGCTGCC^ATCAAGCAAATACTGCTAAAGCAGAAGCAGATGAACTT 360
LysAlaTrpGluAlaAlaAl^AspGlnAlaAsnThrAlaLysAlaGluAlaAspGluLou 120
gcaaaggcagaaaaagaatcatcagatgcttgggagaaggctgctgctbragatc^gct 420
AiaLysAiaGluLysGluSorSorAspAiaTrpGluLysAiaAlaAlap>uA3pGlnAia 140
AAGCAAGCTGCTCTAAAAGAATTCGATCGTTATGGTG7GAGCAACTACTA7AAAAATCTT 480
LysGlnAlaAlaLeuLysGluPheAspArgTyrGlyValSerAsnTyrTyrLysAsnLeu 160
ATTAATAAAGCTAAAACTGTTGAAGGAATTATGGAGCTTCAGGCACAAGTTGTTGAGTCA 540
IleAsnLysAlaLysTftrValGluGlyHeMetGluLeuGlnAlaGlnValValCluSer 180
GCC^AAAGCACGTATTTCAGAGGCAACAGATGGTTTATCTGATTTCTTGAAGTCTCAA 600
AlaLyqLysAlaArglleSerGluAlaThrAspGlyLeuSerAspPheLeuLysSerGln 200
acttcagcaE^gacacccttaaatcaattaaactttcagaagctaaggagatggctatt 660
TncSerAlabiuAspTnrLeuLysSerlleLysLeuSerGluAlaLysGluMeCAlalic 220
CGTGAGTTAGATGCTCAGGGTGTTAGTGACTTTTATAAGAACAAAATTAACAATGCTAAG 720
ArgGlubouAspAlaGlnGlyValSorAspPhcTyrLysAsnLysIlcAsnAsnAlaLys 240
ACTGTAGAAGGAGTTGTTGCGCTTAAAGACCTTATTCTTAACTCCTTifcciCAACCAGAG 780
TnrValGluGlyValValAlaLouLysAspLouIloLcuAsnSerLou^lojLysProGlu 260
GTTGAACCAGAAGCTAAACCAGAGGTTAAGCCAGAAGTTAAACCAGAAGCTAAGCCAGAG 840
ValGluProGluAlaLysProGluValLysProGluValLysProGluAlaLysPcoGlu 280
GTTAAACCAGAGGTTAAACCGGAAGTTAAACCAGAGGTTAAACCGGAAGTTAAACCAGAG 900
VaiLysProGiuVaiLysProGiuVaiLysProGluValLysProGiuVaiLysProGiu 300
GTTAAACCAGAGGTTAAACCAGAGGTTAAACCAGAGGTTAAACCTGAAAACAAACCAGCT 960
ValLysProGluValLysProGluValLysProGluValLysProGluAsnLysProAia 320
GAAGTTAAGAAAGATGAGAAGAAACTTCCATCGACAGGCGAATCTGTGGGGTACCCCGGG 1020
GluValLysLysAspGluLysLysLouProSorThrGlyGluScrValGlyTyrProGly 340
Рис. 1. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности полипептида А1, включающие в себя области N, E1, E2, область двух ЧСА-связывающих GA модулей и W область
AXGAGAGGAXCGCAXCACCAXCACCAXCACGGAXCCGCAXGCGAGCXCGGXACCCCljr™ 60
MetAzgGlySerHisHieHisHiaHiaHieGlySerAlaCyaGluLeuGlyThr PrcfLeu 20
GATCAAGCTAAGCAAGCTGCTCTAAAAGAATTCGATCGTTATGGTGTGAGCAACTACTAT 120
AepGlnAlaLyeGlnAlaAlaLeuLysGluPheAapArgXyrGlyValSerAsnXyrTyr 40
AAAAAXCTXAXXAAXAAAGCXAAAACXGXXGAAGGAAXXAXGGAGCXXCAGGCACAAGXX 130
LyaAanLeuIleAanLyaAlaLyaThrValGluGlylleMetGluLeuGlnAlaGlnVal 60
GTTGAGTCAGCCAAAkAAGCACGTATTTCAGAGGCAACAGATGGTTTATCTGATTTCTTG 240
ValGluSerAlaLya|LyaAlaArgIleSerGluAlaXhrAapGlyL.euSerAepPheLeu 80
AAGXCXCAAACXXCA^GAAGACACCCXXAAAXCAAXXAAACXXXCAGAAGCXAAGGAG 300
LyaSerGlnThrS®rAl^GluAapThrL«uLyaSerIleLyaLauS»rGluAlaI.yaGlu 100
ATGGCTATTCGTGAGTTAGATGCTCAGGGTGTTAGTGACTTTTATAAGAACAAAATTAAC 360
MetAlalleArgGluLeuAapAlaGlnGlyValSerAapPheTyrLyaAanLyalleAan 120
AATGCTAAGACTGTAGAAGGAGTXGTTGCGCTTAAAGACCTTATTCTTAACTCCTTAbcT 420
AenAlaLyaThrValGluGlyValValAlaLeuLyeAspLeuIleLeuAanSerLeufUa 140
EGuCCAGAGGXXGAACCAGAAGCXAAACCAGAGGXXAAGCCAGAAGXXAAACCAGAAGCX 4 S 0
F-yaProGluValGluProGluAlaLyaProGluValLyaProGluValLyaProGluAla 160
AAGCCAGAGGTTAAACCAGAGGTTAAACCGGAAGTTAAACCAGAGGTTAAACCGGAAGTT 540
LyaProGluValLyaProGluValLyaProGluValLyaProGluValLyaProGluVal ISO
AAACCAGAGGTTAAACCAGAGGTTAAACCAGAGGTTAAACCAGAGGTTAAACCTGAAAAC 600
LysProGluValLysProGluValLysProGluValLysProGluValLysProGluAsn 200
AAACCAGCTGAAGTTAAGAAAGATGAGAAGAAACTTCCATCGACAGGCGAATCTGCAGCC 660
LyaProAlaGluValLyaLysAapGluLyaLyaLeuProSerThrGlyGluSerAlaAla 220
atgagaggatcgcatcaccatcaccatcacggatccgcatgcgagctcggtacccctEta 60
MetArgGlySerHiaHisHiaHisHisHisGlySerAlaCysGluLeuGlyThrProLeu 20
GAXCAAGCXAAGCAAGCXGCXCXAAAAGAAXXCGAXCGXXAXGGXGXGAGCAACXACXAX 120
AspGlnAlaLysGlnAlaAlaLeuLysGluPheAspArgXyrGlyValSerAsnXyrXyr 40
AAAAAXCXXAXXAAXAAAGCXAAAACXGXXGAAGGAAXXAXGGAGCXXCAGGCACAAGXX 180
LysAsnLeuIleAsnLysAlaLysXhrValGluGlylleMecGluLeuGlnAlaGlnVal 60
GXXGAGXCAGCC^AtiAAGCACGXAXXXCAGAGGCAACAGAXGGXXXAXCXGAXXXCXXG 240
ValGluSerAlaLyatysAlaArglleSerGluAlaXhrAspGlyLeuSerAspPheLeu 80
AAGXCXCAAACTXCAGCi|3AAGACACCCTXAAAXCAAXXAAACTTXCAGAAGCXAAGGAG 300
LysSerGlnXhrSerAlapluAspXhrLeuLysSerlleLysLeuSerGluAlaLysGlu 100
AXGGCXAXICGXGAGXXAGAXGCICAGGGIGXXAGXGACXIXIAXAAGAACAAAAXXAAC 360
MetAlalleArgGluLeuAspAlaGlnGlyValSerAspPheXyrLysAsnLysIleAsn 120
AAXGCTAAGACTGXAGAAGGAGXXGIXGCGCXXAAAGACCXXAXXCXXAACXCCTTskcX 420
AanAlaLysXhrValGluGlyValValAlaLeuLysAspLeuIleLeuAsnSerLeufVla 140
Рис. 2. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности полипептида: а — А2, включающие в себя область двух ЧСА-связывающих GA модулей и W область, б — А3, включающие в себя область двух ЧСА-связывающих GA модулей
Рис. 3. Электрофореграмма рекомбинантных полипептидов А1, А2 и А3:
1 — препарат очищенного полипептида А3; 2 — препарат очищенного полипептида А2; 3 — препарат очищенного полипептида А1; 4 — маркер молекулярной массы (сверху вниз: 170; 130; 95; 72; 55; 43; 34; 26; 17; 10 кДа).
больше, чем молекула полипептида А3, обладает большей аффиностью к ЧСА, чем полипептид А3. А молекула полипептида А1, включающая в себя области N Е1, Е2, область двух ЧСА-связывающих вА модулей и W область и имеющая самый большой молекулярный вес, обладает и самой высокой аффинностью по отношению к ЧСА (рис. 4). На гистограмме приведены средние значения оптической плотности по данным нескольких опытов.
Рис. 4. Сравнение эффективности связывания полипептидов А1, А2 и А3 с ЧСА:
черный столбик — полипептид А1; серый столбик — полипептид А2; белый столбик — полипептид А3; по оси абсцисс — разведения меченого ЧСА; по оси ординат — оптическая плотность (OD45o).
Изменение структуры полипептидов А2 и А3 в результате укорачивания их аминокислотных последовательностей могло повлиять на функциональные различия этих полипептидов. Чтобы это подтвердить, был проведен РФА методом конкурентного связывания между различными ЧСА-связывающими полипептидами и ЧСА. Взаимодействие меченного пероксидазой ЧСА-связывающего полипептида с ЧСА, сорбированным на планшете, было блокировано различными количествами немеченых полипептидов А1, А2 и А3. Подобная форма полученных кривых ингибирова-ния доказала, что ЧСА-связывающий сайт на молекуле ЧСА для всех полипептидов один и тот же. Однако для эффективного ингибирования требовались более высокие концентрации полипептидов А2 и А3 по сравнению с полипептидом А1. Для 50% ингибирования взаимодействия меченого ЧСА-связывающего полипептида с ЧСА требовалось полипептида А1 — 3 рто1, полипептида А2 — 6 рто1, а полипептида А3 — 8 рто1. Эти результаты также показали, что у полипептида А1 аффинность для ЧСА выше, чем у полипептидов А2 и А3 (рис. 5).
0- 1 I I I I 1 I 11 I I 1 I 1 I I I |
1 10 100
Концентрация ингибитора (log pmol)
Рис. 5. Конкурентное ингибирование между полипептидами А1, А2 и A3 и ЧСА:
1, 2 и 3 — кривые ингибирования для полипептидов А1, А2 и A3 соответственно; по оси абсцисс — концентрация ингибитора (log pmol); по оси ординат — % ингибирования.
Таким образом, было показано, что аффинность полипептида по отношению к ЧСА зависит от структуры и размера всего полипептида.
Каждый из полипептидов может быть использован для разных целей в биотехнологии, лабораторной диагностике и протеомике. Так, например, полипептид, содержащий только два ЧСА-связывающих GA модуля и имеющий маленький молекулярный вес (15 кДа), может использоваться как партнер при создании гибридов с рекомбинантыми белками для облегчения их аффинной очистки. Все полученные
полипептиды могут быть использованы в клинической диагностике для определения микроальбуминурии, при создании сорбентов в аффинной хроматографии для удаления альбумина из сыворотки крови человека, а также для получения высоко-очищенных препаратов ЧСА.
Литература
1. De Chateau М., Bjork L. Protein PAB, a mosaic Albumin-binding Bacterial Protein Representing the First Contemporary Example of Module Shuffing // The Journal of Biological Chemistry. 1994. Vol. 269. P. 12147-12151.
2. Johansson M. U., Nilsson H., Evenas J. et al. Differences in Backbone Dynamics of Two Homologous Bacterial Albumin-binding Modules: Implications for Binding Specifity and Bacterial Adaptation // J. Mol. Biol. 2002. Vol. 316. P. 1083-1099.
3. Lejon S., Frick I.-M., Bjorck L. et al. Crystal Structure and Biological Implications of a Bacterial Albumin Binding Module in Complex with Human Serum Albumin // The Journal of Biological Chemistry. 2004. Vol. 279. P. 2924-42928.
4. He Y., Ropak D. A., Sari N. et al. Structure, Dynamics, and Stability Variation in Bacterial Albumin Binding Modules: Implications for Species Specificity // Biochemistry. 2006. Vol. 45. P. 10102-10109.
5. Cramer J. F., Nordberg P. A., Hajdu J., Lejon S. Crystal structure of a bacterial albumin-binding domain at 1.4 A° resolution // FEBS Letters. 2007. Vol. 581. P. 3178-3182.
6. Johansson M. U., Frick I.-M., Nilsson H. et al. Forsent and M. Wikstrom. Structure, Specificity, and Mode of Intraction for Bacterial Albumin-binding Modules // The Journal of Biological Chemistry. 2002. Vol. 277. P. 8114-8120.
7. Alm T., Yderland L., Nilvebrant J. et al. A small bispecific protein selected for orthogonal affinity Purification // Biotechnol. J. 2010. Vol. 5. P. 605-617.
8. Linhult M., Gulich S., Hober S. Affinity Ligands for Industrial Protein Purification // Protein and Peptide Letters. 2005. Vol. 12. P. 305-310.
9. Гупалова Т. В., Бормотова Е. А., Гладилина М. М., Тотолян А. А. Получение и характеристика рекомбинантного альбумин-связывающего полипептида стрептококка группы G для диагностики диабетической нефропатии // Биотехнология. 2012. T. 3. С. 75-84.
10. Маниатис Т., Фрич Э., Самбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир. 1984.
11. Lowry O. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // The Journal of Biological Chemistry. 1957. Vol. 193. P. 265-275.
12. Программа ExPASy translate tool; www.expasy.org/tools/dna.html
13. Compute pI/Mw tool; http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html
14. Sjobring U. Isolation and Molecular Characterization of a Novel Albumin-Binding Protein from Group G Streptococci // Infection and Immunity. 1992. Vol. 62. P. 3601-3608.
Статья поступила в редакцию 20 июня 2014 г.
Контактная информация
Бормотова Елена Алексеевна — научный сотрудник; bormotovae@rambler.ru
Суворов Александр Николаевич — доктор медицинских наук, профессор, руководитель отдела
молекулярной микробиологии; заведующий кафедрой; alexander_suvorov1@hotmail.com
Гупалова Татьяна Виталиевна — доктор биологических наук, старший научный сотрудник, ведущий научный сотрудник; tvgupalova@rambler.ru
Bormotova Elena A. — researcher; bormotovae@rambler.ru
Suvorov Alexandr N. — Doctor of Medicine, Professor, Head of department of molecular microbiology, Head of the department; alexander_suvorov1@hotmail.com
Gupalova Tatyana V. — Doctor of Biology, senior researcher, leading researcher; tvgupalova@rambler.ru
