CC BY
50
Оригинальные статьи
© 2004, СПб РО РААКИ
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННЫХ И ИММУНОГЕННЫХ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ - ФРАГМЕНТОВ БЕЛКА ВАС СТРЕПТОКОККА ГРУППЫ В
Мерингова Л.Ф., Леонтьева Г.Ф., Устинович И.А., Грабовская К.Б., Суворов А.Н., Тотолян Артем А.
ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия
Резюме. Проведено сравнительное изучение иммуногенных и антигенных свойств рекомбинантных полипептидов, созданных на основе поверхностного белка Вас стрептококков группы В, штамм 219 серотипа I Ьс. Полипептиды Р6, PI, Р5 с молекулярной массой 35, 22, 22 kDa сконструированы путем клонирования различных фрагментов ДНК 3’ части гена вас, с использованием экспрессионных векторов. Р5 отличался от Р1 за счет замены двух аминокислот в области потенциальной антигенной детерминанты. Изучение иммунного ответа на лабораторных мышах показало, что внутрибрюшинное введение всех исследуемых полипептидов вызывает у мышей синтез специфических антител класса G, однако количественные и качественные показатели иммунного ответа различались в зависимости от полипептида. Максимальные титры антител составляли 1:100 ООО; 1:50 ООО и 1:12 ООО для полипептидов Р6, Р1 и Р5, соответственно. Иммунный ответ был гетерогенен по аффинитету антител. Значения констант связывания (Кс) изменялись от 108 М'1 до 1013М'' для Р6 и от 106 М'1 до 1012 М'1 для Р1 и Р5. Изучение иммунохимических перекрестов полипептида Р6 с Р1 и Р5 и взаимное истощение антисывороток показало, что Р6 и Р1 имеют идентичные антигенные детерминанты, в отличие от полипептида Р5, который лишь частично повторял антигенную структуру Р6.
Сравнительный анализ антигенных и иммуногенных свойств рекомбинантных полипептидов белка Вас позволил заключить, что полипептид Р6 обладал наивысшей способностью стимулировать синтез длительно циркулирующих высокоаффинных специфических антител. Полипептид Р6 может рассматриваться как перспективный кандидат для включения в состав вакцины против СГВ, патогенных для человека.
Ключевые слова: стрептококк, белок Вас, рекомбинантные полипептиды, иммуногетюсть.
Meringova L.F., Leontieva G.F., Ustinovitch I.A., Grabovskaya K.B., Suvorov A.N., Totolian Artem A.
COMPARATIVE STUDY OF IMMUNOGENIC AND ANTIGENIC FEATURES
OF RECOMBINANT PEPTIDES - FRAGMENTS OF GROUP В STREPTOCOCCAL BA С PROTEIN
Abstract. A comparative study of immunogenic and antigenic features of recombinant polypeptides based on the surface expressed Group В streptococcal protein Вас was accomplished. Polypeptides P6, PI, P5 with molecular mass 35, 22, 22 kDa were constructed by cloning of different DNA fragments corresponding to 3’ part вас, using expression vectors. P5 was different from PI due to substitution of two amino acids in the potential antigenic domain region. The immune response on laboratory mice demonstrated that intraperitoneal injection of the polypeptides under study induces different levels of occurrence of specific IgG. Titers of immunoglobulines reached 1:100 000; 1:50 000 and 1:12 000 for P6, PI и P5, consequently. Immune response was different by affinity levels of antibodies. Binding constant (Kc) varied from 108 M1 to 1013M_1 for P6 and from 10° M1 to 1012 M'1 for PI and P5. Investigation of immunochemical cross reactions of polypeptides P6 with PI and P5 and mutual adsorption of antisera demonstrated that P6 and PI have identical antigenic domains. Polypeptide P5 was generating antibodies of two types one of which could not recognize P6.Comparative study of antigenic and immunogenic features of recombinant polypeptides based on Вас protein allowed concluding that polypeptide P6 expressed the highest
АдрвС для переписки • ^eve*of antibodies with high affinity with long period of
Мерингова Людмила Федоровна. circulation. Polypeptide P6 can be considered a good
197376, С.-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12, potential candidate for part of the complex peptide vac-
отдел молекулярной микробиологии. cme a§ainst GBS- (Med- Immunol, 2004, vol.6, № 6,
Факс: (812)234-94-77. E-mail: [email protected] PP 493-498)
Стрептококки группы В (СГВ) относятся к услов-но-патогенным микроорганизмам, вызывающим тяжелые заболевания человека, актуальные в акушеро-ги-некологической клинике, патологии плода и новорожденных. Они способны также вызывать летальные септические процессы и некротический фасцит [4]. Описано распространенное носительство СГВ в урогенитальной области и в прямой кишке [12]. Многообразие СГВ и вызываемых ими заболеваний, в том числе среди детей перинатального и раннего детского возраста и женщин детородного возраста, делает чрезвычайно актуальными исследования по созданию средств защиты, важнейшими из которых являются антибактериальные вакцины, сконструированные на основе белков микробного происхождения [10]. Основным в создании поливалентных вакцинных препаратов широкой специфичности, является выбор белков, обладающих высокой иммуногенностью и протективнос-тью. В настоящее время различными авторами изучаются свойства некоторых полноразмерных рекомбинантных белков стрептококков серогрупп В и А. Среди них С5а пептидаза, фибронектин связывающий белок, 81р-белок, М-белок и некоторые др. [6-8,11].
Использование полноразмерных белков стрептококка в некоторых случаях может приводить к развитию у реципиента аллергических реакций, аутоиммунных процессов и других неблагоприятных побочных явлений. В связи с этим перспективным является получение укороченных фрагментов белков, сохраняющих способность стимулировать иммунный ответ с высоким титром специфических антител. Методы генной инженерии позволяют конструировать различные по величине и структуре полипептидные фрагменты полноразмерных белков микроба. В настоящей статье приводятся итоги сравнительного изучения иммуно-генных и антигенных свойств трех разных фрагментов поверхностного белка СГВ - т. н. белка Вас. Данный белок рассматривается в качестве существенного фактора вирулентности за счет его уникальной способности связывать ^А [3, 5].
Исследуемые фрагменты белка Вас имеют близкую по аминокислотному составу структуру, но различаются по уровню специфической активности и молекулярной массе [3]. Целью данного исследования было оценить характер иммунного ответа к этим полипептидам по уровню циркулирующих специфических антител, а также попытаться найти различия в их анти-генности, обусловленные различиями в аминокислотной структуре. Для этого изучались качественный и количественный состав антител (аффинитет и доля антител со сродством к конкретному антигену-поли-пептиду), а также иммунохимические перекрестные реакции между исследуемыми антигенами.
Материалы и методы
Штаммы бактерий, векторы и генно-инженерные процедуры. Штамм СГВ 219/4849 сероти-
па I Ьс (коллекция отдела молекулярной микробиологии ГУНИИЭМ РАМН) использовали в качестве источника хромосомной ДНК, служившей матрицей для полимеразной цепной реакции (ПЦР). Штамм кишечной палочки JM 109 служил реципиентом для создания плазмидных штаммов-продуцентов рекомбинантных белков. Конструирование штамма-про-дуцента описано ранее [3]. Суть метода состояла в том, что фрагмент гена Ьас, соответствующий его 3’ части, был сначала амплифицирован посредством ПЦР, затем клонирован в линейном векторе pGEM Т Easy (Promega, США), а на последнем этапе - в эк-спрессионном векторе pQE30 (Qiagen, США). В итоге последующей очистки лизата штамма-продуцен-та на His Tag колонках (Novagen, США) был получен препарат белка с молекулярной массой 35 kDa (полипептид Р6).
Полипептиды Р1 и Р5 с молекулярной массой 22 kDa были получены как описано [3].
Корректность созданных генетических конструкций проверялась в Микрохимической лаборатории Университета Оклахомы, США.
Иммунизация животных. Иммунный ответ к исследуемым полипептидам изучали на беспородных белых мышах-самцах, массой 16-18 г, полученных из питомника “Рапполово”, РАМН. Иммунизацию проводили двукратно и подкожно, причем первую инъекцию - с полным адъювантом Фрейнда. В эксперименте для каждого антигена использовали 3 группы животных, которым вводили полипептиды в дозах 0.3, 0.6 и 1.2 мг/кг массы (1-я инъекция) и
0.15, 0.3 и 0.6 мг /кг массы (2-я инъекция) на 0 и 30 дни, соответственно. Эксперимент по иммунизации был повторен трижды. Антитела (IgG) определяли с 22-го по 150-й дни от начала иммунизации, используя пул сывороток от 3-х животных.
Определение титра антител. Титр антител регистрировали методом иммуно ферментного анализа (сэндвич ИФА) [2], используя планшеты высокой сорбционной емкости “Costar” (США). Каждая сыворотка исследовалась в 3-х повторах, контролем служила сыворотка интактных животных.
Определение константы связывания. Для оценки аффинитета IgG антител исследуемую сыворотку в разведении 1/100 инкубировали в растворе с возрастающим количеством соответствующего антигена (0.12-30 мкг/мл), не связавшиеся антитела регистрировали в ИФА [2,9]. Определение каждой точки кривой титрования было продублировано трижды. Расчет значений констант связывания (Кс) и доли антител с данной величиной Кс выполняли с помощью компьютерной программы пакета «Poly const» [1].
Изучение перекрестных взаимодействий. Сорбированный на планшете полипептид Р6 инкубировали с сыворотками к Р1 и Р5, полученными после введения препаратов в дозе 1,2 мг/кг. Титр антител определяли, как описано в [2].
Абсорбция иммунных сывороток. Для истощения исследуемые сыворотки в разведении от 1:100 до 1: 400 инкубировали с исследуемым пептидом в концентрациях 0,1-60 мкг/мл в течение 30 минут, затем не связавшиеся антитела титровали в ИФА [2].
Результаты
Получена сравнительная характеристика иммуно-генных свойств трех рекомбинантных полипептидов -Р6, Р1, Р5 [3], созданных на основе гена бас, кодирующего поверхностный Бас-белок СГВ. Известно, что белок Вас имеет молекулярную массу 130 кВа и способен связывать человека [3,5]. Полипептид Р6 является частью полноразмерного белка Вас, обладает ^А-связывающей активностью и имеет массу 35 кОа. Полипептиды Р1 и Р5 являются фрагментами Р6 с молекулярной массой 22 кОа и практически идентичны по аминокислотной последовательности за исключением двух аминокислотных замен в структуре Р5. Аминокислотные замены могут служить причиной некоторых отличий в свойствах изучаемых полипептидов. Так в отличие от Р6 и Р1, которые имеют в своей структуре сверх-спирализованный участок, полипептид Р5 является исключительно линейным [3], хотя и обладает ^А-связывающей активностью.
Изучение иммунного ответа на полипептид Р6. Для оценки иммуногенности исследуемого препарата животных иммунизировали полипептидом Р6 по схеме, описанной в «Материалы и методы». Во всех группах экспериментальных животных, отличающихся дозой вводимого антигена, через 3 недели от начала опыта отмечено появление в крови специфических антител класса С (рис. 1). К 4-й неделе титр антител в каждой исследуемой группе составил 1:6 400. После повторной иммунизации наблюдали дальнейшее повышение содержания специфических антител. Наибольшие дозы вводимого антигена стимулировали и более высокий иммунный ответ. Так, в крови животных, иммунизированных минимальной дозой, наивысший титр антител был зарегистрирован на 48 день и составил 1: 25 000, а в двух других группах максимальный титр антител составил 1: 100 000 на 48 и 69 дни от начала иммунизации, соответственно. В дальнейшем количество циркулирующих антител не менялось. Общий срок наблюдения составил 5 месяцев от начала иммунизации.
Антитела, циркулирующие в крови животных в течение первого месяца, независимо от дозы введенного антигена были фактически однородны и не отличались по аффинитету. Значение констант связывания (Кс) составляло 107М ', что свидетельствовало о низком уровне аффинитета.
В течение 10 дней после повторной инъекции Р6 аффинитет антител, циркулирующих в крови животных всех исследуемых групп, не менялся (рис.2). На 18 день после второй иммунизации (48 день от нача-
ла эксперимента) иммунный ответ стал неоднородным по аффинитету антител. Таку мышей, иммунизированных наименьшей и средней дозой антигена, было зафиксировано появление в крови антител с высокими значениями Кс, а именно Ю10М'1 и 109М'\ соответственно (рис. 2). Доля высоко аффинных антител достигала 50% от их общего количества. В крови животных, иммунизированных наибольшей дозой полипептида Р6, высоко аффинные антитела отсутствовали, но были выявлены антитела с Кс, равной 108М‘|. В дальнейшем увеличение аффинитета антител было отмечено только у животных, иммунизированных наименьшей дозой антигена. Значение Кс при этом достигало 1013М ‘.
Изучение иммунного ответа на полипептиды Р1 иР5. Иммунизация животных полипептидами Р1 и Р5, была проведена по той же схеме, что и полипеп-
Рис.1. Иммунный ответ к полипептидам Р6, Р1 и Р5.
По оси абсцисс - срок от начала иммунизации (дни).
По оси ординат - титр антител в ИФА.
Условные обозначения:
■ - доза антигена 0,3 мг/кг в - доза антигена 0,6 мг/кг 11 - доза антигена 1,2 мг/кг Стрелками обозначены сроки введения антигенов.
тидом Р6. Иммунный ответ на них имел количественные и качественные отличия по сравнению с ответом на Р6. Титр специфических антител к полипептидам Р1 и Р5 хотя и возрастал с увеличением дозы антигена, однако количество антител на аналогичных сроках регистрации было в среднем в 2-10 раз меньше, чем при иммунизации Р6. Так, титры циркулирующих антител в процессе иммунного ответа к Р1 изменялись от 1:200 до 1:50 ООО, а при введении препарата Р5 они увеличивались от 1: 800 до 1:12 000.
Некоторые отличия наблюдались также и в динамике накопления специфических антител. При иммунизации препаратами Р1 и Р5 титр антител достигал максимального значения к 41 и 48 дню после первого введения антигена соответственно, а затем уменьшался. Как указывалось ранее, при введении Р6 уменьшения титра антител мы не зарегистрировали; достигнув максимума, он оставался неизменным до 150 дня от начала иммунизации.
юо 1 80 -60 -40 -20 -0 -
48 день
Вводимая доза 0,3 мг/кг
11
Аффинитет циркулирующих антител после введения полипептидов Р1 и Р5 в дозах 0.3 и 0.6 мг/кг на всех сроках наблюдения не изменялся. Значения Кс составляли 108М_1 (на рис. 2 не приводится). Гетерогенность иммунного ответа по аффинитету антител была отмечена только для максимальной дозы антигенов (1.2 мг/кг) (рис.2). В крови животных присутствовали антитела с различным аффинитетом
- значения Кс колебались в диапазоне от 106 М'1 до 1012 М'1. Доля высоко аффинных антител составляла 10-30% от их общего количества.
Изучение специфичности антител к полипептидам. Поскольку полученные данные по характеристике иммуногенных свойств полипептидов показали, что сила иммунного ответа и динамика накопления антител не одинаковы, представлялось интересным провести сравнительный анализ специфичности антител к этим препаратам (табл.). Титрование сывороток, полученных в процессе иммунизации животных
Р6
Вводимая доза 0,6 мг/кг
11
Вводимая доза 1,2 мг/кг
6 7 8 9 10 11 12 13
6 7 8 9 10 11 12 13
6 7 8 9 10 И 12 13
69 день
100 80 60 -40 -20 • 0
6 7 8 9 10 11 12 13
6 7 8 9 10 11 12 13
И
6 7 8 9 10 11 12 13
100 80 і 60 40 20 0
Р1 Р5
48 день
Вводимая доза Вводимая доза
1,2 мг/кг ] 1,2 мг/кг
и
6 7 8 9 10 11 12 13 6 7 8 9 10 11 12 13
69 день
100
80
60
40
20
0
I
6 7 8 9 10 11 12 13 6 7 8 9 10 11 12 13
Рис.2. Аффинитет антител к полипептидам Р6, Р1 и Р5. По оси абсцисс-1д Кс. По оси ординат - доля антител с данным аффинитетом.
препаратом Р1 на планшетах, с сорбированным Р6, показало, что их титр при замене антигена не изменился. Аналогичный результат получили и при исследовании взаимодействия антител к препарату Рб с полипептидом Р1. Кроме того, в исследуемых сыворотках при замене антигенов не наблюдалось изменения значений Кс для связывания полипептидов с гетерогенными антителами или нарушения количественного соотношения антител различного аффинитета, которое было выявлено ранее. Истощение антисывороток препаратами гомологичного и гетерологич-ного полипептида показало, что антитела, содержащиеся в исследуемых сыворотках, практически полностью связываются как гомо-, так и гетерологичным антигеном, что свидетельствует о том, что домены, обеспечивающие гуморальный иммунный ответ на эти полипептиды идентичны. Более высокая имму-ногенность полипептида Рб по сравнению с Р1 может быть обусловлена большей стабильностью Рб к воздействию протеолитических ферментов.
Титрование сывороток, специфичных к полипе-тиду Р5, на планшетах, с сорбированным Рб, показало снижение их титра в 10 раз при использовании гетерологичного пептида (табл.). Как упоминалось выше, сыворотки к Р5 содержали антитела низкого, среднего и высокого аффинитета (рис.2), однако с Рб взаимодействовали только высокоаффинные антитела со значением Кс равным 109М'' (табл.). Полученные результаты подсказывают, что замена двух аминокислот, а именно, лизина на аргинин и глутамина на глицин, привела к изменению антигенной структуры полипептида Р5, а область, в которой произведены эти замены участвует в формировании гуморального иммунитета. Можно предположить,
что полипептид Р5 имеет общие антигенные детерминанты с полипептидом Рб, а также дополнительные, которые у Рб отсутствуют.
Обсуждение
В литературе описаны иммуногенные свойства различных рекомбинантных белков стрептококков (М-белок, С5а пептидаза, Б1р-белок и др.) и показано, что разнообразные схемы иммунизации животных приводят к иммунному ответу различной силы. При этом титры циркулирующих антител в крови варьируют от 1:16 ООО до 1:1 ООО ООО. Величина титров коррелирует с развитием устойчивости иммунизированных животных к заражению гомологичными микробами [6-8,11]. Описаны также иммуногенные свойства белка Вас, которые связывают с его С-концевой частью [10]. Выше проведены сравнительные данные по изучению иммунного ответа на фрагменты Белка Вас, соответствующие его консервативной 1Ч-терминальной области и различающиеся по молекулярной массе. Эти результаты показали, что введение животным исследуемых полипептидов с молекулярной массой от 22 кБа до 35 кБа стимулирует синтез специфических антител класса и сила иммунного ответа увеличивается с возрастанием дозы вводимого антигена, что свидетельствует в пользу существования антигенных детерминант на молекуле белка Вас не только в области С-конца, но и его Ы-конца. Степень иммуногенности исследуемых полипептидов зависела от размера фрагмента. При введении животным препарата Рб, молекулярная масса которого в 4 раза меньше таковой для полноразмерного белка Вас, значимыми были титры
Табл.1. ИММУНОХИМИЧЕСКИЙ ПЕРЕКРЕСТ РЕКОМБИНАНТНЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ Рб, Р1 И Р5.
Время от начала иммунизации (дни) Сыворотка к Рб Сыворотка к Р5
Антиген Рб Антиген Р1 Антиген Рб Антиген Р5
Титр Кс* (м-1) Титр Кс* (м-1) Титр Кс* (м-1) Титр 2 ? • о
22 6000 не опр. 6000 не опр. 250 не опр. 6000 не опр.
32 6000 не опр. 6000 не опр. 600 не опр. 6000 не опр.
41 50000 не опр. 50000 не опр. 1000 не опр. 12000 не опр.
48 10000 107 (30) 10000 107 (30) 1200 ю9 12000 О* со О
0 Ю8 (70) 0 108 (70) Ю8 (40) 1010 (20)
69 10000 Ю7 (55) 10000 107 (55) 500 о со 6000 106 (70)
0 Ю8 (45) 0 Ю8 (45) 108 (20) 1010 (10)
В скобках указана доля антител с данным аффинитетом в(
антител даже при наименьшей дозе введенного полипептида. При иммунизации полипептидами Р1 и Р5, уменьшенными по сравнению с Р6 на 13 кБа, небольшими дозами, титры циркулирующих антител были достаточно низкими. Значимый иммунный ответ на эти полипептиды удалось получить только при увеличении вводимой дозы до 1.2 мг/кг (рис.1). Снижение иммунного ответа с уменьшением молекулярной массы антигена совпадает с классическими представлениями о роли молекулярной массы в реализации антигенных свойств. Результаты этих исследований показали, что уменьшение молекулярной массы полипептидов повлияло на динамику накопления и продолжительность циркуляции специфических антител (рис.1), но не оказало существенного влияния на их аффинитет (рис.2). Однако содержание высоко аффинных антител в общем пуле уменьшалось при снижении молекулярной массы исследуемых фрагментов. Наличие в крови иммунизированных животных антител с различным аффинитетом позволяют предположить, что все изучаемые нами фрагменты белка Вас содержат более, чем одну антигенную детерминанту. Изучение антиген-ности показало, что полипептиды Р6 и Р1 обладают антигенной идентичностью. Снижение молекулярной массы Р1 на 13 кБа не изменило его антигенной структуры, но снизило иммуногенность. Антигенная структура полипептида Р5 была изменена заменой двух аминокислот. Вследствие этого в крови иммунных животных появились антитела новой специфичности, но сохранились и антитела, гомологичные Р6.
Таким образом, результаты экспериментов позволяют допустить, что, несмотря на 4-х кратное уменьшение молекулярной массы по сравнению с полноразмерным белком Вас полипептид Р6 обладает достаточно высокой иммуногенностью сравнимой с таковой для полноразмерных белков стрептококка и может быть рекомендован для исследования с целью включения в состав поливалентной вакцины. Уменьшение молекулярной массы полипептидов более чем в 4 раза по сравнению с полноразмерным белком приводит к снижению интенсивности синтеза и продолжительности циркуляции специфических антител, но не оказывает существенного влияния на их аффинитет. Изменения структуры полипептида приводит к изменению его свойств и соответственно к синтезу антител неспецифичных к исходному белку.
Работа выполнена при поддержке грантов НШ-2206.2003.4, РФФИ 03-04.47960 и Фонда содействия отечественной медицине.
Список литературы
1. Агафонова И.И. Особенности математического описания экспериментальных данных при анали-
зе распределения сывороточных IgG, специфичных в отношении вируса гриппа // Вестник АМН СССР. -1991,- N11.-C.11-14.
2. Мерингова Л.Ф., Войцеховский Б.Л., Духин А.И., Крамская Т.А., Поляк Р.Я. Применение методов химической кинетики для оценки аффинитета циркулирующих свободных и связанных с антигеном антител (модель-экспериментальный грипп) // Иммунология. - 1986,- N6.- С. 48-51.
3. Устинович И. А., Гупалова Т.В., Тотолян А. А., Суворов А.Н. Изучение IgA-рецепторного белка стрептококка группы В //Биотехнология,- 2002.-N 1,- С. 3-10.
4. Baker C.J. Group В streptococcal infections// Clin. Perinatal.- 1997,- Vol.-.24.- P.59-70.
5. Brodeur B.R., Boyer М., Charlebois I., Hambel J., Couture F., Rioux C., Martin D. Identification of group В streptococcal Sip protein, which elicits cross-protective immunity// Infect. Immune.- 2000,- Vol. 68.-N10.
- P. 5610-5615.
6. Brady L.J., Boyle M.D. Identification of non-im-munoglobulin A-Fc-binding forms and low-molecular-weight secreted forms of the group В streptococcal ? antigen // Infect. Immun.- 1989,- Vol. 57,- P. 1573-1581.
7. Cleary P., Stafslien D.,Carlson B., Pillai S., Omst-ed S. Streptococci and streptococcal diseases// Proc. XIV Lancefield Intern. Symp on Streptococci Diseases/ ed. Martin D.R., Tagg J.R., 2000.- P.437-440.
8. Dunn LA, McMillan DJ, Batzloff М., Zeng W„ Jackson D.S., Upsroft J.A., Upsroft P., Olive C. Parenteral and mucosal delivery of a novel multi-epitope M pro-tein-based group A streptococcal vaccine construct: investigation of immunogenicity in mice// Vaccine.- 2002 .- Vol. 20.- N21-22,- P.2635-2640.
9. Friquet B„ Charfotte A.F., Djavadi-Ohaniance L., Goldberg M.E. Measurements of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complexes by enzyme-linked immunosorbent assay // J. Immunol. Meth.-1985.- Vol. 77,- P. 305-319.
10. Heden L.O., Frithz E., Lindahl G. Molecular characterization of an IgA receptor from Group В streptococci: sequence of the gene. Identification of prolin-rich region with the unique structure and isolation of N-terminal fragments with IgA-binding capacity // Eur.J.Immunol.-1991.- Vol.-21.- P. 1481-1490.
11. Kawabata S., Kunitomo E., Terao Y,. Nakagawa I., Kikuchi K., Totsuka K., Hamada S. Systemic and mucosal immunizations with fibronectin-binding protein FBP54 induce protective immune responses against Streptococcus pyogenes challenge in mice. //Infect.Immun.-2001.-Vol.69.-N 2,- P. 924-930.
12. Regan J.A., Klebanoff M.A., Nugent R.P. et al. // Colonization with group В streptococci in pregnancy adverse outcome. VIP Study Group. Am. J. Obstet. Gynecol. - 1996,- Vol.174.-P. 1354-1360.
поступила в редакцию 05.03.2004 принята к печати 25.03.2004
