CC BY
24
И ог\ п то <%£"»! (з г^пп^т / сип а т> п гИпют (1)1/1 Л Н
Л. X *М $14 14 км иии V ису и- 14 игл I ОХУ у/ 1« I и и Л Л. А. Л Д XX
УДК 541.14
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ /3-КАРОТИНА И ХЛОРОФИЛЛА А С БЫЧЬИМ СЫВОРОТОЧНЫМ АЛЬБУМИНОМ
И. А. Наговицын, Г. К. Чудинова, В. В. Савранский, Г. Г. Комиссаров1
Изучена флуоресценция комплексов природных фотосинтетических пигментов /3-каротина (¡З-К), хлорофилла а (ХЛ) и их смесей в различных соотношениях с бычьим сывороточным альбумином (БСА) в водных растворах. Обнаружено увеличение интенсивности флуоресценции в комплексах смеси пигментов с БСА. Максимальное ('б 4 - 6 раз) увеличение интенсивности флуоресценции по сравнению с интенсивностью флуоресценции од-нокомпонентных комплексов БСА(/3-К) и БСА(ХЛ) достигается при соотношении 11 — 21% (З-К / 89 — 73% ХЛ в комплексе с БСА. Спектры флуоресценции комплексов хлорофилла а с БСА (максимум при 690 нм) и (3-К с БСА перекрываются в значительной степени. Это дает возможность предположить, что при изучении флуоресцентных характеристик природных фото синтетических пигмент-белковых комплексов необходимо учитывать возможность присутствия собственной флуоресценции (3-каротина и родственных ему соединений.
Ключёвые слова: /3-каротин, хлорофилл а, флуоресценция, сывороточный альбумин.
Изучение переноса энергии и взаимодействия основных пигментов фотосинтеза (хлорофилла а и /3-каротина) при поглощении света позволяет определить критерии оптимальной организации пигментов, обеспечивающей высокую квантовую эффективность
1 Институт химической физики им. Н. Н. Семенова РАН, 119991, ГСП-1, Москва, В-334, ул. Косыгина, д. 4.
ЫПЯЛРП // Эпи/. ?
преобразования световой энергии. Полученные на модельных системах результаты могут быть использованы для выяснения механизмов преобразования солнечной энергии в природных мембранных структурах, а также для создания на их основе преобразователей солнечной энергии с двумя и более слоями различных пигментов вплоть до образования гетероструктур.
Целью настоящей работы является исследование оптических свойств (флуоресценция, поглощение) основных пигментов фотосинтетического аппарата высших растений: каротина (/?-К) и хлорофилла а (ХЛ) при взаимодействии их смесей различного мольного соотношения с бычьим сывороточным альбумином.
В настоящее время публикуется большое количество работ по исследованию пигмент-белковых комплексов (ПБК) природных фотосинтетических мембран. С современным состоянием исследований природных фотосинтетических структур можно ознакомиться в обзорах, посвященных исследованию структуры фотосистемы II [1 - 5] и фотосистемы I [6-8], переноса электрона в фотосистеме II [9] и фотосистеме I [10 12], переноса энергии в ПБК [13, 14].
Для исследований природных ПБК часто используются ленгмюровские пленки. Методика приготовления ленгмюровских пленок позволяет создавать адекватные модель ные системы природных мембран. В одной из первых работ, посвященных исследованию ПБК в ленгмюровских пленках, были исследованы бактериальные реакционные центры и светособирающие комплексы [15]. Ряд обстоятельных работ выполнен по изучению структурной организации светособирающего комплекса II в ленгмюровских пленках [16 - 18].
В исследовании фотосинтеза можно выделить два взаимодополняющих подхода: детальное исследование процессов в природных системах и моделирование этих процессов в простых модельных системах с последующим их усложнением [19]. По нашему мнению, в последнее время с появлением новых методов исследований и общим прогрессом в понимании функционирования природных ПБК фотосинтетической мембраны недостаточно внимания уделяется моделированию процессов фотосинтеза с использованием простых модельных систем.
Основной объем работ по взаимодействию пигментов фотосинтеза с модельными белковыми системами был выполнен в 80 - 90 годы. Одной из таких систем, которая часто использовалась, является комплекс пигмент-сывороточный альбумин (см., например, [20 - 22]). Сывороточный альбумин содержит гидрофобные полости [23], в которых могут связываться неполярные соединения. Исследования физико-химических
свойств комплексов сывороточных альбуминов с хлорофиллом [24], каротиноидами [25], порфиринами и другими хромофорами [28 - 30] не потеряли своей актуальности и в настоящее время. В нашей группе порфирины и их металлокомплексы использовали для маркирования сывороточных альбуминов при создании сенсорных систем на основе ленгмюровских пленок для флуоресцентного иммуноанализа [31, 32].
Нами были проведены исследования фотовольтаических характеристик пленок смеси ХЛ//3-К и было показано увеличение фотопотенциала пленок при содержании ß-K 80 - 90% по сравнению с однокомпонентными пленками [33, 34]. Было проведено исследование переноса энергии между ß-K и XJT, при этом была обнаружена собственная флуоресценция ß-K в ленгмюровских пленках [33, 35]. В качестве первого шага усложнения модельной системы и доведения ее до соответствия с ПБК фотосинтетического аппарата логично было бы исследовать взаимодействие ß-K и XJI с участием белка. Для этой цели был выбран бычий сывороточный альбумин (БСА). Результаты кратко представлены в работах [35, 36]. Результаты исследования трехкомпонентной модельной системы БСА(/3-К/ХЛ) методами флуоресцентной и абсорбционной спектроскопии представлены в данной статье.
/3-каротин и хлорофилл а (Fluka Chemical Corp.) использовали без дополнительной очистки. Спектры поглощения ß-K и XJ1 соответствуют литературным данным [37]. Исходные растворы XJI и ß-K готовили в хлороформе в концентрациях Ю-3 М, хранили при — 18°С. Комплексы /3-каротина и хлорофилла а с бычьим сывороточным альбумином (Sigma) готовили перемешиванием при комнатной температуре водного раствора БСА (10~6 М) и раствора пигмента в хлороформе (Ю-5 М) до испарения последнего; вы держивали сутки при +4°С, отфильтровывали. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре HITACHI-330, спектры флуоресценции - на спектрофлуориметре SHIMADZU RF-5001 (размеры щелей возбуждения/регистрации составляли 10/10 нм). Возбуждение флуоресценции проводили светом с длиной волны 420 нм (полоса Соре хлорофилла) и 490 нм (максимум поглощения /9-каротина). В последнем случае возбуждается в основном ß-K, т.к. поглощение XJI в области 490 нм незначительно. Для отсечения рассеянного света при возбуждении светом 490 нм использовали оптические фильтры ЖС-16 и ПС-8, вырезающие область до 550 нм. Для приготовления рисунков и расчета интегральной интенсивности флуоресценции (площади под кривой спектра fhjTVnnecneHTTWH^ игттппт^'чоия ттт* ттппгпамл/fv Mirrnral Orisill V. 5.0.
i J - ir - ^ " —/----------------—jr Г J о
На рис. 1 приведены спектры поглощения комплексов бычьего сывороточного альбумина (БСА) с ^-каротином (ß-K) и хлорофиллом а (ХЛ). Максимумы полос поглоще-
нм
Рис. 1. Приведенные к единице спектры поглощения комплексов БСА(ХЛ) - I, БСА(/3-К) -2 и спектр поглощения хлорофилла a (XJI) в растворе хлороформа (10~5 М) - 3. Спектр XJI в растворе хлороформа в целях наглядности приведен к величине 0.9.
ния XJI в комплексе с белком практически не сдвинуты относительно положения полос поглощения XJI в растворе хлороформа (рис. 1, спектры 1, 3). Появление максимума поглощения в области 740 нм в спектре БСА(ХЛ) (рис. 1, спектр 1) может быть объяснено светорассеянием ассоциатами XJI, которое уменьшается при уменьшении количества ХЛ [38].
При образовании комплекса fi-К с БСА в спектре поглощения образуется длинноволновый максимум в области 518 нм (рис. 1, спектр 2). При исследовании однокомпонент ных ленгмюровских пленок /3-К мы наблюдали образование аналогичного максимума (при 516 нм) [35]. Наличие такого максимума объясняется образованием агрегатов /3-К в ленгмюровских пленках [39]. На основании этого мы полагаем, что /3-К образует агрегаты при встраивании в гидрофобные полости БСА.
Оптические свойства смеси ХЛ и /3-К были исследованы в ленгмюровских пленках [39, 40] и в смешанных (/3-К/ХЛ) пигмент-белковых комплексах [41, 42], но при обсуждении результатов работ [39 - 42] наблюдаемая флуоресценция была отнесена к флуоресценции хлорофилла. Как нами было показано ранее [35], спектры флуоресценции однокомпонентных по пигментному составу комплексов /3-К и ХЛ с БСА в растворе в значительной степени перекрываются, что не исключает наличия собственной флуорес-
,,,, 7 J иУПП / о f/ тл AVi ллч # /1 лл л^лиошл! <r « » ----- rf\JA Л LJ
p ilJ ¿\J\Jjf Z. ±\ jju.1 isWU щыгил itu yjUxJUTbC f'/inii
27% ХЛ 11% ХЛ
500
600
700 800 S нм
750 800
HM
Рис. 2. Спектры флуоресценции комплексов (3-каротина ((3-К), хлорофилла а (ХЛ) и их смесей с бычьим сывороточным альбумином (БСА). а — Аех — 420 нм; Ь — Хех — 490 нм.
ценции каротиноидов в природных пигмент-белковых комплексах (рис. 2). Наблюдаемая флуоресценция не является собственной флуоресценцией БСА [35].
На рис. 2а приведены спектры флуоресценции (Аег = 420 нм) однокомпонентных пигмент-белковых комплексов и комплексов смеси пигментов с БСА. При возбуждении светом 420 нм спектр флуоресценции комплекса /З-К-белок имеет максимумы при 513 и 684 нм; комплекс XJI-белок 507 и 690 нм. Коротковолновый максимум (« 500 нм) можно объяснить светорассеянием раствора альбумина. Максимумы флуоресценции комплексов БСА с 11, 27, 50, 66% ХЛ располагаются при 694, 696, 696, 699 нм соответственно. Отметим, что интенсивность флуоресценции однокомпонентных пигмент-белковых комплексов существенно ниже, чем белковых комплексов смеси пигментов, причем максимальное увеличение интенсивности наблюдается при избытке /3-К (11 и 27% ХЛ). В спектрах флуоресценции комплексов, содержащих 50 и 66% ХЛ, образуется плечо в области яз 730 нм. Отметим, что исследование структуры спектров /3-К в пленках и в пигмент-белковом комплексе (вычленение отдельных полос спектров поглощения и люминесценции) является самостоятельной задачей и в данной статье не рассматривается.
При возбуждении флуоресценции светом с длиной волны 490 нм картина принципиально не изменяется (рис. 2Ь). В этом случае можно ожидать, что возбуждается в основном /3-К, т.к. поглощение ХЛ максимально в более коротковолновой области полосы Соре, т.е. 390 - 460 нм (рис. 1). Максимальная интенсивность флуоресценции наЬлюдается при избытке /3-К (11, 27% XJ1). Максимумы флуоресценции комплексов БСА(/3-К), БСА с 11, 27, 50, 66% ХЛ и комплексов БСА(ХЛ) располагаются при 680, 694, 697, 701, 700, 682 нм соответственно.
•а
б §
2000 -
. о 1 о
I 1500 -
„ ^ 4>
а 8.5
1000 1
»о.
4>
500 -
0 20 40 60 100% В-К соотношение пигментов в комплексах БСАф-К/ХЛ)
100 100% ХЛ
Рис. 3. Зависимость интегральной интенсивности флуоресценции (Ае1 = 420 нм) (1) и поглощения при 667 нм (2) от мольного соотношения хлорофилла а и (3-каротина в комплексе с бычьим сывороточным альбумином.
На рис. 3 представлены зависимости интегральной интенсивности флуоресценции (Аех = 420 иле) комплексов БСА(ХЛ//?-К) и оптической плотности в области длинноволновой полосы поглощения ХЛ (для комплексов БСА(ХЛ) 667 нм, см. рис. 1) в зависимости от мольного соотношения пигментов в комплексе с БСА. Интенсивность флуоресценции при содержании 27% ХЛ/73% /3-К в комплексе с БСА возрастает в 4 ра за по сравнению с флуоресценцией БСА(/3-К) и в 6 раз по сравнению с флуоресценцией БСА(ХЛ) (рис. 3, кривая 1).
Как уже упоминалось, нами было обнаружено увеличение фотопотенциала ленгмю-ровских пленок смеси /3-К и ХЛ по сравнению с фотопотенциалом однокомпонентных пленок пигментов при прочих равных условиях приготовления пленок и проведения измерений [33, 34]. Увеличение значений фотопотенциала наблюдали именно при избытке /?-К (при содержании 10 - 20% ХЛ), подобно тому как в настоящей работе при избытке /3-К увеличивается интенсивность флуоресценции смеси пигментов в комплексе с БСА. Можно предположить, что в этом случае происходит образование комплексов с синерге тическим взаимодействием пигментов, что приводит к сенсибилизации флуоресценции комплексов и к увеличению эффективности фотон-электронной конверсии в процессе фотовольтаических измерений.
Зависимость оптической плотности в области длинноволновой полосы поглощения XJ1 (667 нм) от соотношения ß-K и XJI в исходном растворе, использованном для приготовления комплекса с БСА, имеет максимум, соответствующий 50% мольному соотношению пигментов, при котором оптическая плотность раствора в 2.7 раза больше, чем в растворе комплекса БСА(ХЛ) той же молярности (рис. 3, кривая 2). В области 667 нм поглощение ß-K незначительно (рис. 1) и можно говорить о том, что наблюдае мое поглощение соответствует поглощению ХЛ. Подобная зависимость (рис. 3, кривая 2), на наш взгляд, говорит о том, что при соотношении /3-К:ХЛ ~ 1:1 образуются наиболее компактные комплексы пигментов, в результате чего количество сорбированного ХЛ на белке возрастает по сравнению с однокомпонентными комплексами БСА(ХЛ). Спектрально этому факту соответствует образование плеч (яз 730 нм) в спектрах флуоресценции пигмент-белковых комплексов (рис. 2, 50%, 66% ХЛ).
Итак, в работе исследованы в водных растворах оптические свойства (флуоресценция, поглощение) /3-каротина и хлорофилла а в комплексе с бычьим сывороточным альбумином. При сравнении спектров флуоресценции водных растворов БСА(/3-каротин) и БСА(хлорофилл а) установлено, что спектры в обоих случаях значительно перекрыва ются, положение максимумов полос флуоресценции различаются на несколько нанометров. Такое совпадение позволяет предположить наличие собственной флуоресценции каротиноидов в природных пигмент-белковых фотосинтетических структурах, которая маскируется флуоресценцией хлорофилла. До сих пор собственная флуоресценция каротиноидов исследовалась в простых модельных системах и ее наличие не учитывали при интерпретации флуоресцентных характеристик in vivo. Показано значительное увеличение (в 4 - 6 раз) интенсивности флуоресценции комплексов смеси /3-каротина и хлорофилла а с бычьим сывороточным альбумином по сравнению с однокомпонентными пигмент-белковыми комплексами. Показано, что количество хлорофилла а в растворе его комплекса с бычьим сывороточным альбумином максимально при мольном соотно шении ХЛ-/?-каротином = 1:1 в исходном растворе.
Авторы благодарят д.х.н. О. Т. Касаикину за предоставленный /?-каротин.
Работа поддержана грантом РФФИ N 0403-32890а и грантом ведущих научных школ НШ 1221.2003.3.
ЛИТЕРАТУРА
[1] В и ш Ъ a L. and V á с h a F. Photosynth. Res., 77, 1 (2003).
[2] T e т e н ь к и н В. Л. Биохимия, 68, N 6, 810 (2003).
К пят«*1»« />ллЬ1М<31/1/(Т 77 Л /fl" 11 пост (Q й Л н нГйлАРТЙ 11 &f)f} J.
л.л.£**лл! v$vuu\s ю vis ubfJ ll ibLy f/I/lII rt L/JvL C- LJ 1 1 « 61/L/^
[3] В а г b e г J., N i e 1 d J., M о г г i s E. P., et al. Physiol. Plantarum, 100, 817 (1997).
[4] В а г b e г J., M о г г i s E. P., and В u с h e 1 C. Biochim. Biophys. Acta, 1459, 239 (2000).
[5] В r i с к e г Т. M. and F r a n к e 1 L. K. Photosynth. Res., 72, 131 (2002).
[6] F г о m m e P., J о r d a n P., and К г a u (3 N. Biochim. Biophys. Acta, 1507, 5 (2001).
[7] S с h e 1 1 e г H. V., Jensen P. E., Haldrup A., et al. Biochim. Biophys. Acta, 1507, 41 (2001).
[8] E v a n s M. C. W. and В r e d e n к a m p G. Physiol. Plantarum, 79, 415 (1990).
[9] G i а г d i M. Т., С о n a A., and G e i к e n B. Bioelectrochem. Bioenerg., 38, 67 (1995).
[10] В г e t t e 1 K. Biochim. Biophys. Acta, 1318, 322 (1997).
[11] H о p e A. B. Biochim. Biophys. Acta, 1456, 5 (2000).
[12] В r e t t e 1 K. and L e i b 1 W. Biochim. Biophys. Acta, 1507, 100 (2001).
[13] Melkozernov A. N. Photosynth. Res., 70, 129 (2001).
[14] R e n g e г Т., M а у V., and К u h n O. Phys. Reports, 343, 137 (2001).
[15] Heckl W. M,Losche M, and M 6 h w a 1 d H. Thin Solid Films, 133, 73 (1985).
[16] Kernen P., Gruszecki W. I., M a t u t a M., et al. Biochim. Biophys. Acta, 1373, N2, 289 (1998).
[17] Gruszecki W. I., Grudzinski W., Banaszek-Glos A., et al. Biochim. Biophys. Acta, 1412, N2, 173 (1999).
[18] Grudzinski W., M a t u 1 a M., S i e 1 e w i e s i u к J. et al. Biochim. Biophys. Acta, 1503, N3, 291 (2001).
[19] Энергетические ресурсы сквозь призму фотохимии и катализа, под ред. М. Грет-целя, М., Мир, 1986.
[20] Семичаевский В. Д. Биофизика, 17, N 3, 530 (1972).
[21] Зенькевич Э. И., Кочубеев Г. А., Салохиддинов К. И. Журнал прикладной спектроскопии, 29, N 4, 639 (1978).
[22] S h i b a t а Н., О с h i a i Н., Kawashima Т., et al. Biochim. Biophys. Acta, 852, N 2 - 3, 175 (1986).
[23] Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., и др. Основы биохимии, 3, М., Мир, 1981.
[24] С h i b i s o v A. K., Slavnova T. D., and G o r n e г H. J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 72, 11 (2003).
[25] Zsila F., Simonyi M., and Lockwood S. F. Bioorg. Med. Chem. Lett., 13, 4093 (2003).
[26] Sowell J., Agrew-Heard K. A., Mason J. C., et al. J. Chromatogr., B, 755, 91 (2001).
[27] Borissevitch I. E., Tominaga Т. Т., and Schmitt С. С. J. Photochem. Photobiol. A: Chem., 114, 201 (1998).
[28] Harvey M. D., В a b 1 e к i s V., В a n к s P. R., and S к i n n e r C. D. J. Chromatogr., B, 754, 345 (2001).
[29] Borissevitch I. E., Tominaga Т. Т., I s a m o t о H., and Tabak M. J. Luminescence, 69, 65 (1996).
[30] Borissevitch I. E., Tominaga Т. Т., I s a m o t о H., and Tabak M. Anal. Chim. Acta, 343, 281 (1997).
[31] H а г о в и ц ы н И. А., Ч у д и н о в а Г. К. ДАН, 382, N 2, 267 (2002).
[32] Чудинова Г. К., Наговицын И. А., Карпов Р. Е., Савранский В. В. Квантовая электроника, 33, N 9, 765 (2003).
[33] Наговицын И. А., Чудинова Г. К., Комиссаров Г. Г. ДАН, 382, N 1, 115 (2002).
[34] Наговицын И. А., Чудинова Г. К., Савранский В. В., Комиссаров Г. Г. Биофизика, 49, N 4, 646 (2004).
[35] Наговицын И. А., Чудинова Г. К., Савранский В. В., Комиссаров Г. Г. Краткие сообщения по физике ФИАН, N 11, 19 (2003).
[36] Наговицын И. А., Чудинова Г. К., Комиссаров Г. Г. Девятая научная конференция ИХФ РАН, ноябрь, 2003 г.
[37] Бенсассон Р., Лэнд Э., Траскот Т. "Флэш-фотолиз и импульсный радиолиз. Применение в биохимии и медицинской химии", М., Мир, 1987.
[38] Семичаевский В. Д. Молекулярная биология, 9, N 3, 351 (1975).
[39] Литвин Ф. Ф., Гуляев Б. А., С и н е щ е к о в В. А. ДАН СССР, 162, N 5, 1184 (1965).
[40] Sineshchekov V. A., L i t v i n F. F., and Das M. Photochem. Photobiol., 15, 187 (1972).
[41] Г и л л e p Ю. Е. Биофизика, 13, N 6, 1006 (1968).
[42] Г и л л е р Ю. Е., Красичкова 15, N 1, 38 (1970).
ЦЕНИ Института общей физики им. А. М. Прохорова РАН
Г. В., С а п о ж н и к о в Д. И. Биофизика,
Поступила в редакцию 13 мая 2004 г.
