CC BY
15
УДК 541.14; 539.233
ФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ АГРЕГИРОВАННОГО /3-КАРОТИНА
В ЛЕНГМЮРОВСКИХ ПЛЕНКАХ И В КОМПЛЕКСЕ С БЕЛКОМ В РАСТВОРЕ
И. А. Наговицын, Г. К. Чудинова, В. В. Савранский, Г. Г. Комиссаров5
Изучена флуоресценция /3-каротина (¡З-К) в однокомпо-нентных ленгмюровских пленках и в комплексе с белком - бычьим сывороточным альбумином (БСА) в растворе. Максимумы флуоресценции пленок ¡З-К расположены в области 576 и 690 нм, а максимумы флуоресценции комплекса БСА (¡З-К) - в области 622, 647 и 694 нм. Спектры флуоресценции комплексов хлорофилла а с БСА (максимум при 690 нм) и (З-К с БСА перекрываются в значительной степени. Это дает возможность предположить, что при изучении флуоресцентных характеристик природных фотосинтетических пигмент-белковых комплексов необходимо учитывать возможность присутствия собственной флуоресценции ¡З-каротина и родственных ему соединений.
Ключевые слова: ленгмюровские пленки, /3-каротин, флуоресценция, сывороточный альбумин.
Каротиноиды (КД) - Сад-соединения составляют один из наиболее важных классов природных пигментов и играют важную роль в процессе фотосинтеза. Флуоресцент ные методы чрезвычайно широко применяются для исследований фотосинтеза, однако
Институт химической физики им. Н. Н. Семенова РАН, 119991, ГСП-1, Москва, В-334, ул. Косыгина, д. 4.
флуоресценция /3-каротина (/3-К) и родственных ему пигментов - вопрос, не имеющий однозначного объяснения. До недавнего времени общепринятым считалось мнение об отсутствии флуоресценции у КД, а данные о ее наличии объясняли присутствием примесей [1]. Флуоресценция КД стала активно исследоваться только с появлением лазерных технологий, т.к. возможность ее регистрации лимитировалась чрезвычайно малым # квантовым выходом Ю-4) [2].
Результаты исследования флуоресценции КД в растворах в замороженном состоянии и при комнатной температуре позволили определить электронную природу флуоресценции каротиноидов и ее основные фотофизические характеристики. Так, у каротпноидов с полиеновой цепью N > 10 не наблюдается ¿>1 —> 5о флуоресценции (5о - основное состояние молекулы, а 5г и 5г - возбужденные синглетные состояния молекулы). При лазерном возбуждении время жизни ¿2 синглетного состояния /9-К, имеющего 11 сопряженных двойных связей, составляет 195 — 250 ф с [2, 3].
Использование методов фемтосекундной и лазерной двухфотонной спектроскопии инициировало большое количество работ, посвященных исследованию физико-химических свойств КД (например, [4 - 6]), но несмотря на большой объем информащ> : по этому вопросу, все же не существует однозначного представления о положении энер гетических уровней (особенно 5а уровня) КД и их участия в процессе миграции энергии в светособирающих пигмент-белковых комплексах [3, 7, 8].
Несмотря на то, что еще в 70-х годах была обнаружена флуоресценция КД на микропористом стекле при 77 К [9] и были исследованы оптические свойства смеси пигмеи ов ¡3-К и хлорофилла (ХЛ) в ленгмюровских пленках [10, 11] и в смешанных (/3-К/ХЛ) пигмент-белковых комплексах [12, 13], все же следует отметить, что в литературе о1; сутствуют планомерные исследования флуоресценции КД в конденсированных средах. При обсуждении результатов работ [10 - 13] наблюдаемая флуоресценция была отнесена к флуоресценции хлорофилла.
Методика приготовления ленгмюровских пленок эффективно используется для исследования физико-химических и фотофизических процессов, происходящих с участием природных фотосинтетических пигментов, в первую очередь для исследования миграции энергии в фотосинтезе. Также пленки КД могут быть использованы для создание эффективных преобразователей солнечной энергии со стабильным фотооткликом и вы, сокой эффективностью фотон-электронной конверсии (до 30%) [14].
Анализ литературы, проведенный нами, показал, что, кроме работы [15], собственная флуоресценция КД в ленгмюровских пленках не исследовалась. Целью настоя ще <
работы является исследование флуоресценции /?-каротина в упорядоченных системах и ее сравнение с флуоресценцией хлорофилла в комплексе с БСА.
Упорядоченными системами, которые исследуются в нашей работе, являются ленг-мюровские пленки пигментов и их комплексы с белком - бычьим сывороточным альбумином (БСА). Именно упорядоченное окружение способствует увеличению эффективности флуоресценции, что дает возможность регистрировать возбуждаемую ксеноновой лампой флуоресценцию ß-K при комнатной температуре. Мы предполагаем, что образование комплексов (коньюгатов) ß-K и хлорофилла а с БСА происходит при встраивании пигментов в гидрофобную полость БСА, которая и создает упорядоченное окружение. Подобные результаты были получены нами при исследовании флуоресценции Yb комплекса тетрафенилпорфирина, усиливающейся при встраивании красителя в гидрофобную полость сывороточного альбумина [16]. В настоящей работе было обнаружено, что спектры флуоресценции однокомпонентных по пигментному составу комплексов ß-K и XJI с БСА в растворе в значительной степени перекрываются, что позволяет предположить наличие собственной флуоресценции КД в природных пигмент-белковых комплексах, замаскированной флуоресценцией XJ1. Отметим, что исследование структуры спектров ß-K в пленках и в пигмент-белковом комплексе (вычленение отдельных полос спектров поглощения и люминесценции) является самостоятельной задачей и в данной статье не рассматривается.
/3-каротин и хлорофилл а (Fluka Chemical Corp.) использовались без дополнительной очистки. Спектры поглощения ß-K соответствуют литературным данным [1]. Концентрация ß-K при спектральных измерениях - 10~5М. Комплексы ^-каротина и хлорофилла а с бычьим сывороточным альбумином (БСА) (Sigma) готовили перемешиванием при комнатной температуре водного раствора БСА (10~6М) и раствора пигмента в хлороформе (10_5М) до испарения последнего; выдерживали сутки при +4°С, отфильтровывали. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре HITACHI-330, спектры флуоресценции - на спектрофлуориметре SHIMADZU RF-5001 (размеры щелей возбуждения/регистрации составляли 10/10 мл*). Возбуждение флуоресценции проводили светом с длиной волны 420 нм (полоса Соре хлорофилла), 490 и 520 нм (максимумы поглощения /3-каротина). В последнем случае возбуждается в основном ß-K, т.к. поглощение XJ1 в области 520 нм минимально. Для отсечения рассеянного света при возбуждении светом 490 и 520 нм использовали оптические фильтры ЖС-16 и ПС-8, выреза ющие область до 550 нм. Для приготовления пленок использовали установку Joyce Loebl (Великобритания). Пленки переносили на кварцевые подложки (30x10x1 мм3) методом
Ленгмюра-Шефера. Скорость сжатия монослоя во всех случаях 0.3 см2/мин. Субфаза -0.05 М раствор KCl в тридистиллированной воде (20°С). Исходные растворы ХЛ и ß-K готовили в хлороформе в концентрациях 10_3М, хранили при —18°С и использовали для приготовления пленок в течение не более трех дней. Детальное описание установк: для приготовления пленок приведено в [17]. Подробное изложение методики приготовления ленгмкюовских пленок и ее применение лля (Ьизических. (Ьизико-химических и
X X ' • X t X
биофизических исследований приведено в обзорах [18-21].
400 500 600 700
А, ,нм
Рис. 1. Поглощение /3-каротина: 1 - раствор в бензоле 10~5М (сплошная линия); 2 водный раствор БСА(/3-К) 10~6М (- • -); 3 - пленка /З-К (3 слоя, перенесенных при поверхностном давлении (ПД) 15 мН/м) (сплошная линия); 4 - пленка, приготовленная из /З-К, содержащего продукты разложения (3 слоя при ПД = 15 мН/м) (- • ■ -); 5 - пленка (З-К через неделю хранения при -18° С (3 слоя при ПД = 15 мН/м) (сплошная линия); 6 - водный раствор БСА((3-К) 10~еМ через неделю хранения при +4° С (- -).
Спектры поглощения /З-К в растворе, ленгмюровских пленках и в комплексе с бы чьим сывороточным альбумином приведены на рис. 1. Из рис. 1 хорошо видно соот ветствие спектров поглощения /З-К в двух конденсированных системах: в пленках и в комплексе с белком в растворе (спектры 3 и 2 соответственно). Максимум длинноволно вой полосы, соответствующей образованию агрегатов /?-К в ленгмюровских пленках, в
спектре поглощения пленок находится при 516 нм [10], а в растворе комплекса БСА(/3-К) - при 518 нм (рис. 1). На основании этого можно предположить, что ß-K в комплексе с БСА в растворе также находится в агрегированном состоянии.
При хранении спектры пленок изменяются, по-видимому, за счет деструкции пигментов, что выражается в общем уменьшении оптической плотности, редукции длинноволновой полосы и ее смещении в коротковолновую область (рис. 1, спектры 5, 6). Форма спектра 5 на рис. 1 соответствует форме спектра пленки, полученной из ß-K, содержащего продукты разложения (рис. 1, спектр 4). Известно, что деструкция КД в присутствии кислорода воздуха приводит к образованию эпоксидов и производных /?-ионона [22], что, по нашему мнению, является причиной распада агрегатов ß-K.
В известной степени аналогичные по структуре /3-ионону соединения - ионол и его производные - часто используются в качестве антиоксидантов [22]. В нашей работе предварительные исследования показали, что приготовление пленок ß-K с добавлением ионола (2,6-ди-третбутил-4-метилфенола) приводило к увеличению молекулярной площади смеси /3-К-ионол, т.е. снижению степени агрегации ß-K, по сравнению с од-нокомпонентными пленками. Так, содержание 10-25 % v/v ионола (10~3М) в растворе для приготовления пленок приводило к увеличению молекулярной площади ß-K в пленке в среднем в 1.5 раза. Молекулярная площадь - одна из основных характеристик методики приготовления ленгмюровских пленок - площадь, которую занимает молекула вещества на поверхности водной субфазы. Молекулярная площадь является показателем пространственной ориентации вещества, степени его агрегации, отражает взаимодействие веществ в пленке смесей. При приготовлении пленок из образцов ß-К, содержащего продукты деструкции, его молекулярная площадь также возрастает по сравнению с пленками ß-K, хранившегося в темноте без доступа воздуха. Отметим, что детальное исследование влияния продуктов распада ß-K на его поведение на поверхности субфазы не являлось целью работы.
Флуоресценция пленок ß-K при возбуждении 420 нм имеет интенсивный максимум в области ~ 580 нм (рис. 2, спектр 2). Форма спектра и положение указанного максимума точно соответствует данным, полученным для —> So флуоресценции растворов ß-K в сероуглероде (СS2) при комнатной температуре [2, 23]. Подобное совпадение данных для растворов и ленгмюровских пленок позволяет предположить, что наблюдаемая нами флуоресценция относится к собственной флуоресценции ß-K, обусловленной S2 —► So переходом. По аналогии с работой [23] незначительный по интенсивности максимум в спектре 2 (рис. 2) в области ~ 740 нм можно отнести к Si —> So переходу.
Сопоставление спектров флуоресценции в пленках, представленных на рис. 2, показывает, что интенсивность флуоресценции при использовании образцов, содержащих продукты разложения (спектры 1,4), в 10 раз по сравнению с образцами, в
которых продукты деструкции отсутствуют (спектры 2, 3). Все пленки, спектры которых приведены на рис. 2, приготовлены из растворов, содержащих одинаковую навеску /?-К, причем наличие примесей приводит к снижению оптической плотности растворов в области поглощения /3-К в 4 раза (спектры не приводятся). Таким образом, наличие продуктов разложения является причиной снижения флуоресценции /3-К в пленках.
А, нм А, нм
Рис. 2. Флуоресценция пленок ß-каротина. 1, 2 - Хех = 420 нм; 3, 4 ~ Аех = 520 мл«. 1, 4 пленки, приготовленные из ß-K, содержащего продукты разложения; 2, 3 - спектры пленок сразу после приготовления.
Рис. 3. Флуоресценция 10~6Af раствора ß-каротина (1, 2, 3) и хлорофилла а (4) в комплексе с бычьим сывороточным альбумином (БСА). 1 - Хех = 420 нм; 2 - Аех = 490 »¡.к; 3 - \ех = 520 нм; 4 ~ Аех = 420 нм; 5 - фоновая флуоресценция - флуоресценция раствора немаркированного БСА 10~6М, Аех = 420 нм.
При возбуждении светом 420 нм спектр флуоресценции комплекса /3-К-белок имеет максимумы при 513 и 684 нм\ комплекс XJl-белок - 507 и 690 нм (рис. 3). Коротковолновый максимум (ss 500 нм) можно объяснить светорассеянием раствора альбумина. При возбуждении в полосу поглощения /3-каротина хорошо разрешается полоса с максимумом в области « 690 нм (рис. 3), а также четко выражены максимумы при 622 и 647 нм (\ех = 490 и 520 нм соответственно). Наблюдаемая в пленках флуоресценция ß-K в области 580 нм, в случае белкового раствора, видимо, маскируется фоновой флуорес-
ценцией белка (рис. 3, спектр 5). В спектре флуоресценции раствора БСА без пигментов (рис. 3, спектр 5) отсутствует длинноволновый максимум (« 690 нм), таким образом, полоса флуоресценции с максимумом 684 нм (спектр 1, рис. 3) и 690 нм (спектр 4, рис. 3) принадлежит /3-К и XJI, сорбированным на БСА, соответственно.
Отметим, что спектры флуоресценции белковых комплексов БСА(/?-К) и БСА(ХЛ) перекрываются в значительной степени (рис. 3, спектры 1, 4). Таким образом, логично предположить,-что флуоресценция каротиноидов присутствует также и в природных пигмент-белковых комплексах, но маскируется флуоресценцией XJI, что может быть важно для биофизических исследований фотосинтеза. До сих пор собственная флуоресценция КД исследовалась в простых модельных системах и ее наличие не учитывали при интерпретации флуоресцентных характеристик in vivo. Вопрос о правомерности сравнения предложенной нами модельной системы и природных пигмент-белковых комплексов фотосинтетических мембран дискуссионный и требует дальнейшего исследова ния.
Из соответствия спектров поглощения (рис. 1, спектры 2, 3) и флуоресценции (рис. 2, 3) /3-К в пленках и на белке в растворе следует, что свойства агрегатов /3-К, в первую очередь, определяются его молекулярной структурой, а не взаимодействием с белком. Соответствие спектров флуоресценции /3-К в пленках (рис. 2, спектр 2) с литературными данными для разбавленных растворов [2, 23] позволяет предположить, что наблюдаемую флуоресценцию можно отнести к собственной флуоресценции /3-К. Проведенные исследования не позволяют сделать однозначного вывода о влиянии агрегации на природу флуоресценции /3-К. Уменьшение степени агрегации /3-К выражается в редукции полосы поглощения агрегата при хранении, что обусловлено образованием продуктов деструкции (рис. 1). В то же время форма спектров флуоресценции не претерпевает качественных изменений, однако наблюдается сдвиг максимума флуоресценции в коротковолновую область на 28 нм (рис. 2, спектры 1, 2).
Итак, в работе впервые исследована флуоресценция /3-каротина в пленках Ленгмюра Шефера и в комплексе с бычьим сывороточным альбумином в растворе. При сравнении спектров флуоресценции водных растворов БСА(/3-каротин) и БСА(хлорофилл а) установлено, что спектры в обоих случаях значительно перекрываются, положение макси мумов полос флуоресценции различаются на несколько нанометров. Такое совпадение позволяет предположить наличие собственной флуоресценции каротиноидов в природных пигмент-белковых фотосинтетических структурах, которая маскируется флуоресценцией хлорофилла.
Авторы благодарят д.х.н. О.Т. Касаикину за предоставленный /3-каротин. Работа поддержана грантами ведущих научных школ N 00-15-97404 и N НШ-1788.2003.2.
ЛИТЕРАТУРА
[1] Бенсассон Р., Лэнд Э., Траскот Т. Флэш-фотолиз и импульсный радиолиз. Применение в биохимии и медицинской химии. М., Мир, 1987, с. 398.
[2] Б о н д а р е в С. Л. Журнал прикладной спектроскопии, 64, N 1,5 (1997).
[3] Young A. J., Frank Н. A. J. Photochem. Photobiol. В: Biol., 36, 3 (1996).
[4] W а 11 а P. J., Linden P. A. Hsu С.-Р., Scholes G. D., Fleming G. R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, N 20, 10808 (2000).
[5] G r a d i n a r u С. С., К e n n i s J. Т. M., P a p a g i a n n a k i s E., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, N 5, 2364 (2001).
[6] F a 1 1 e r P., Pascal A., Rutherford A. W. Biochemistry, 40, 6431 (2001).
[7] P о 1 i v k а Т., Herek J. L., Zigmantas D., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 4914 (1999).
[8] J о s u e J. S., F r a n k H. A. J. Phys. Chem. A., 106, 4815 (2002).
[9] Лялин Г. H., Кобы ш ев Г. И., Теренин А. Н. ДАН СССР, 150, N 2, 407 (1963).
[10] Литвин Ф. Ф., Гуляев Б. А., Синещеков В. А. ДАН СССР, 162, N 5, 1184 (1965).
[11] Sineshchekov V. A., L i t v i n F. F. and Das M. Photochem. Photobiol.. 15, 187 (1972).
[12] Г и л л е р Ю. Е. Биофизика, 13, N 6, 1006 (1968).
[13] Г и л л е р Ю. Е., Красичкова Г. В., Сапожников Д. И. Биофизика, 15, N 1, 38 (1970).
[14] G а о F. G., Bard A. J., Kispert L. D. J. Photocem. Photobiol. A: Chemistry, 130, 49 (2000).
[15] Ray К., M i s r a T. N. J. Photochem. Photobiol. A: Chem., 107, 201 (1997).
[16] Наговицын И. А., Чудинова Г. К. ДАН, 382, N 2, 267 (2002).
[17] Наговицын И. А., Чудинова Г. К., Румянцева В. Д. и др. Биофизика, 47, N 4, 625 (2002).
[18] Блинов Л. М. Успехи химии, 52, N 8, 1263 (1983).
[19] "Micelles, membranes, microemulsions, and monolayers" W.M. Gelbart, A. Ben-Shaul, D. Roux, eds. Springer-Verlag New-York, Inc., 1994.
[20] V i n с e t t P.S, Roberts G. G. Thin Solid Films, 68, 135 (1980).
[21] Schwartz D. K. Surface Science Reports, 27, 241 (1997).
[22] Химическая энциклопедия, т. 2, под ред. И.Л. Кнунянтта. М., Советская энциклопедия, 1990, с. 671.
[23] Бондарев С. Л., Кнюкшто В. Н. Оптика и спектроскопия, 74, N 4, 591 (1994).
Институт общей физики
им. A.M. Прохорова РАН Поступила в редакцию 13 октября 2003 г.
