CC BY
190
УДК 577.345 О. Л. Власова
Вестник СПбГУ. Сер. 11. 2011. Вып. 1
ОПТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РАДАХЛОРИНА
КАК ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРА В ДИАГНОСТИКЕ И ТЕРАПИИ
ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный политехнический университет»
Краситель радахлорин, представляющий собой модифицированную природную смесь хлоринов из микроводоросли рода Spirulina, около 70-90% которых составляет хлорин е6, является фотосенсибилизатором для биообъектов-мишеней. Биологические объекты, характер собственного отражения, поглощения или флуоресценции которых существенно изменён окрашиванием, называют фотосенсибилизированными, так как их чувствительность к свету изменена [1]. РХ применяют в клинической медицине в ходе проведения сеансов флуориметрической диагностики (ФД) и фотодинамической терапии (ФДТ) злокачественных новообразований. ФДТ является сравнительно новой медицинской технологией, позволяющей добиваться селективного разрушения опухоли с помощью поглощения фотосенсибилизатором (ФС) световой энергии и использования её для образования синглетного кислорода (активного окислителя) с максимальным сохранением окружающей здоровой ткани [2-5].
Сеансы ФД и ФДТ проходят с лучшими результатами, если максимум поглощения комплексов фотосенсибилизатора с компонентами биологических тканей совпадает с максимумом излучения источника света. К сожалению, даже если in vitro желаемое совпадение достигнуто, то введение препарата in vivo часто изменяет (иногда непредсказуемо) положение максимума в спектре поглощения. Результативность ФДТ определяется концентрацией ФС в крови и тканях, а также его состоянием — соотношением мономерных форм (эффективные генераторы синглетного кислорода) и ассоциатов.
Поэтому целью исследования явилось изучение оптических свойств растворов ра-дахлорина, окрашенных радахлорином [6, 7] модельных и природных биологических объектов, а также оценка состояния свободного и связанного с компонентами биосистем РХ для более успешного применения этого ФС в медицинской диагностике и терапии.
В работе проведено систематическое исследование оптических свойств и состояния РХ различной концентрации в воде и 96% этиловом спирте, в модельных дисперсиях транспортного белка сывороточного альбумина (оптические свойства его комплексов с красителями активно исследуют [8,9]), в плазме крови крыс при введении ФС как in vitro, так и in vivo, в водных дисперсиях мышечных тканей крыс после введения красителя in vivo. Наряду с этим проведено сравнение оптических свойств модельных и природных биообъектов до и после добавления РХ.
При этом, кроме спектров поглощения D^X^), определяли и анализировали спектры интегрального рассеяния D^.^), которое для биодисперсий является источником дополнительной информации, а также спектры флуоресценции. Соотношение поглощения и интегрального рассеяния задаётся выбором определённого апертурного угла фотоприёмника, при необходимости минимизировать вклад рассеяния апертурный угол фотоприёмника увеличивают.
© О. Л. Власова, 2011
Материал и методы. Эксперименты проводили на белых беспородных крысах контрольных групп и на животных с перевитой в область бедра клеточной культурой лим-фосаркомы Плисса. РХ (0,35% водный раствор) вводили внутрибрюшинно (0,1 мл на 100 г массы тела). Кровь забирали из яремной вены находящихся под наркозом (эфир) животных.
Водные дисперсии тканей (опухоль и здоровая мышца) готовили по следующей методике: животное усыпляли эфиром, образец ткани массой около 1 г отмывали в физиологическом растворе, механически перетирали в фарфоровой ступке, добавляли физиологический раствор (10 мл), отстаивали в течение 1 часа для осаждения крупных частиц.
В качестве модельных систем использовали дисперсии бычьего сывороточного альбумина (БСА) производства «Реахим». Модельные биообъекты сенсибилизировали, окрашивая радахлорином (рис. 1).
Длина волны,нм
Рис. 1. Спектры оптической плотности (билогарифми-ческий масштаб):
• — водная дисперсия БСА (3 мг/мл); ▲ — водная дисперсия БСА (3 мг/мл), окрашенная радахлорином (0,0023%)
Определяли основные характеристики поглощения [10]: максимум поглощения (^тах), полуширину полосы поглощения (Д^1/2), оптическую плотность ^погл.). В области поглощения и рассеяния вводили волновой экспонент [11] (или отношение оптических плотностей). При прочих равных условиях, чем волновой экспонент больше, тем меньше эффективный диаметр рассеивающих свет частиц [11]. При исследовании окрашенных РХ модельных дисперсий БСА применяли подход [12], основанный на представлении их оптических свойств на фазовой плоскости параметров второго класса.
В качестве чувствительных оптических параметров второго класса (безразмерных, не зависящих от концентрации, полученных путём математической обработки экспериментально измеренных параметров первого класса) были выбраны отношения Д^1/2/^тах (Р1) и D(600)/D(700)(P2). Эти параметры характеризуют состояние РХ, поскольку образование ассоциатов проявляется в смещении максимума поглощения в коротковолновую область, уширении полос поглощения [13] и изменении эффективного диаметра частиц.
В работе использовали однолучевой спектрофотометр СФ-46 (ЛОМО). Оптическую плотность измеряли в спектральной области 600-800 нм, для которой характерно незначительное собственное поглощение исследуемых биологических объектов и нали-
чие интенсивного максимума поглощения радахлорина [14]. В экспериментах, связанных с анализом, как поглощения, так и рассеяния света окрашенными РХ биодисперсиями, апертурный угол фотоприёмника составлял 20' (перед ним устанавливали соответствующую диафрагму). Для минимизации вклада рассеянного света в ослабление падающего излучения при исследовании водных дисперсий тканей крыс апертурный угол увеличивали до 4° (измерения проводили без диафрагмы, кюветы придвигали к фотоприёмнику).
Спектры флуоресценции регистрировали с помощью флуориметра «Флюорат-пано-рама» (ЛЮМЭКС).
Результаты и обсуждение. Результаты измерений представлены в табл. 1 и на рис. 2-6.
Таблица 1. Оптические свойства радахлорина в свободном и связанном с биообъектами состоянии
№ Исследуемый объект Xmax, нм AX-1/2 нм Dпoгл. D(600)/ D(700)
1 0,0035% водный раствор PX 650 29 0,20 2,4
2 0,0035% раствор PX в 96% этиловом спирте 662 20 0,73 4,5
3 Дисперсия БСА(1мг/мл) в физиологическом раство-рє - - - 1,4
4 Дисперсия БСА (1мг/мл), окрашенная PX (0,0023%) 662 15 0,13 1,2
5 Дисперсия БСА (1мг/мл), окрашенная PX (0,0035%) 664 18 0,29 1,5
6 Дисперсия БСА (1мг/мл), окрашенная PX (0,0088%) 1й max — 645 2й max — 665 Точка перегиба — 655 40 0,45 0,85 2,1
7 Дисперсия БСА (1 мг/мл), окрашенная PX (0,0088%), белок предварительно облучён лазером (X = 650 нм, P = 3 мВт, ^бл. = 8 мин.) 1й max — 645 2й max — 665 Точка перегиба — 655 25 0,34 1,37 1,6
8 Плазма крови при добавлении PX in vitro с концентрацией 0,0088% 663 30 0,63 1,9
9 Плазма крови, предварительно облучённая лазером (X = 650 нм, P = 3 мВт, ^бл. = 8 мин.), при добавлении PX in vitro с концентрацией 0,0088% 662 25 0,80 1,9
10 Плазма крови здоровой крысы через 1 час 30 минут после введения PX in vivo с концентрацией 0,0050% (забор крови на гепарин, расчёт на объём крови — 16 мл) 660 20 0,31 2,1
11 Плазма крови крысы с привитой лимфосаркомой через 1 час 30 минут после введения PX in vivo с концентрацией 0,0050% (забор крови на гепарин) 660 20 0,15 1,3
12 Дисперсия опухоли через 1 час 30 минут после введения PX in vivo с концентрацией 0,0050% 1й max — 650 2й max — 660 Точка перегиба — 655 6 6 0,35 0,40 1,0
550
600
650
700 750
Длина волны, нм
Рис. 2. Спектры поглощения РХ различной концентрации в растворителях:
0,0088% (▲ — в воде, • — в 96% этиловом спирте); 0,0044% (■ — в воде, * — в 96% этиловом спирте), 0,0022% (♦ — в воде, X — в 96% этиловом спирте)
Ранее для хлорина е6, производным которого является РХ, было показано [13], что он плохо растворяется в воде (в растворе присутствуют как его мономеры, так и ассоциаты) и имеет различные максимумы поглощения в воде и в органических растворителях, причём активными производителями синглетного кислорода являются только мономеры.
Из анализа строк 1, 2 табл. 1 следует, что полуширина пика поглощения для раствора РХ в 96% этиловом спирте меньше в 1,5 раза, оптическая плотность в максимуме поглощения в 3,5 раза больше, отношение D(600)/D(700) в 1,8 раза больше, чем для водного раствора. Длина волны, соответствующая максимуму поглощения в спиртовых растворах с различной концентрацией РХ (662 нм), на 12 нм больше, чем в водных (650 нм), оптическая плотность также существенно выше (рис. 2). Все эти факты свидетельствуют в пользу того, что в спиртовых растворах содержатся в основном мономеры радахлорина.
Б
1,2
1,0 0,8 0,6
0,4 0,2 0
600 620 640 660 680 700 720 740
Длина волны, нм
Рис. 3. Спектры поглощения РХ (0,0035%), растворённого в водной дисперсии БСА с концентрацией белка:
▲ — 0,14 мг/мл; ■ — 0,35 мг/мл; • — 0,7 мг/мл
Строки 3-7 табл. 1 обобщают результаты исследования модельных дисперсий БСА, в строках 8-12 приведены результаты исследования плазмы крови и опухолевой ткани животных.
Известно, что хлорин е6 связывается с белками плазмы, главным образом с альбумином, и это приводит к дезагрегации ассоциатов (только мономерные формы образуют комплексы с белком) [13].
В модельных водных дисперсиях БСА с фиксированной концентрацией РХ при увеличении концентрации белка максимум поглощения в спектрах оптической плотности постепенно сдвигается в длинноволновую область — от 650 нм до 662 нм [15], что соответствует максимуму поглощения мономеров радахлорина в спирте. При этом в спектрах поглощения наблюдается изобестическая точка (рис. 3).
На рис. 4 представлены результаты многопараметрического анализа оптических свойств дисперсий с фиксированной концентрацией белка и изменяющейся концентрацией ФС, полученные с помощью математической обработки данных табл. 1. При низких концентрациях (строка 4 табл. 1) весь РХ взаимодействует с белком, средний эффективный эквивалентный диаметр частиц увеличивается ^(600)Ш(700) в 1,2 раза меньше) — строка 3. По мере увеличения концентрации радахлорина (строки 5-6, рис. 3) полуширина пика поглощения увеличивается, оптическая плотность увеличивается пропорционально концентрации, отношение D(600)/D(700) увеличивается. При избытке радахло-рина в растворе (строка 6) регистрируются два максимума поглощения (645 и 665 нм) и точка перегиба (655 нм), когда в дисперсии появляются не связанные с белком ассоциаты (рис. 4).
Рис. 4. Представление оптических свойств дисперсий в двухмерном пространстве оптических параметров второго класса:
■ — 0,035 % РХ в дистиллированной воде (преимущественно ассоциаты),^ — 0,035 % РХ в 96 % этиловом спирте (преимущественно мономеры), ♦ — дисперсии БСА (1 мг/мл), окрашенные РХ (концентрация в % указана в надписях над точками, надпись обл. соответствует облучению дисперсии лазером малой мощности).
Предварительное облучение раствора белка лазером (X = 650 нм, Р = 3 мВт, ^бл. = 8 мин.) способствует более активному взаимодействию БСА с мономерами РХ (строка 7, рис. 4). Возможно, этот эффект объясняется тем, что под действием облучения
открывается доступ к гидрофобным участкам [16], с которыми могут связываться неполярные соединения. Таким образом, мономеры радахлорина также образуют комплексы с молекулами БСА. Положение максимумов поглощения и их величины зависят от концентрационных и конформационных соотношений белка и сенсибилизатора.
В плазме крови (многокомпонентная система) при добавлении РХ in vitro (строка 8 табл. 1) поглощение в 1,3 раза меньше (взаимодействие белка и ФС слабее), чем в модельной дисперсии БСА (строка 6). После облучения (строка 9) поглощение увеличивается.
Через полтора часа после введения РХ in vivo (строки 10 и 11) в плазме крови больных животных препарата содержится в два раза меньше, чем в плазме здоровых. По-видимому, он активно накапливается в опухоли (строка 12, рис. 5). В дисперсии опухолевой ткани обнаружены два максимума поглощения, соответствующие свободным ассоциатам (650 нм) и связанным мономерам (660 нм) радахлорина. Оптическая плотность окрашенной дисперсии опухолевой ткани существенно выше, чем здоровой. Данные флуориметрии подтверждают наличие двух максимумов в спектре (рис. 6).
D
Длина волны, нм
Рис. 5. Спектры поглощения водных дисперсий тканей:
▲ — здоровая мышечная ткань (через 7 дней после введения животному радахлорина); ■ — здоровая мышечная ткань (через 1 час 30 мин. после введения животному радахлорина); ♦ — опухоль (через 1 час 30 мин после введения радахлорина).
Рис. 6. ^е^р флуоресценции водной дисперсии опухоли через 1 час З0 мин после введения РХ in vivo с концентрацией 0,0050%
По результатам проведённых исследований можно сделать следующие выводы, а именно:
• в водном растворе радахлорина присутствуют в основном его ассоциаты (максимум поглощения 650 нм), а в спиртовом — мономеры (максимум поглощения 662 нм);
• мономеры радахлорина активно связываются с сывороточным альбумином. Связывание его с альбумином приводит к дезагрегации ассоциатов красителя, поэтому в плазме крови (при используемых в терапии концентрациях) РХ присутствует в основном в виде мономеров, способных активно производить синглетный кислород;
• лимфосаркома насыщается фотосенсибилизатором на порядок активнее здоровой мышечной ткани, причём в спектрах оптической плотности присутствуют максимумы поглощения, характерные как для свободных ассоциатов (650 нм), так и для связанных мономеров РХ (660 нм);
• оптимальная длина волны источника излучения, запускающего фотохимические реакции, должна быть порядка 660 нм.
Полученные результаты могут быть использованы в практической медицине для повышения чувствительности ФД и эффективности ФДТ злокачественных новообразований.
Литература
1. Приезжев А. В., Тучин В. В., Шубочкин Л. П. Лазерная диагностика в биологии и медицине. М.: Наука. 1989. 237 с.
2. Гамалея Н. Ф., Михалкин И. А. Световая терапия опухолей с применением фотосенсибилизатора // Экспериментальная онкология. 1988. Т. 10, № 1. С. 9-16.
3. КуценокВ. В., Гамалея Н. Ф. Фотодинамическая терапия злокачественных опухолей // Онкология. 2003. Т. 5, № 1. С. 69-73.
4. Luksiene Z. Photodynamic therapy: mechanism of action and ways to improve the efficiency of treatment // Medicina. 2003. Vol. 39, N 12. P. 1137-1145.
5. Гельфонд М.Л. Возможности фотодинамической терапии в онкологической практике // Физическая медицина. 2005. Т. 15, № 2. С. 12-17.
6. Вакуловская Е. Г., Решетников А. В., Залевский И. Д. и др. Фотодинамическая терапия и флюоресцентная диагностика с фотосенсибилизатором Радахлорин у больных раком кожи // Онкология. 2004. Т. 3, № 1. С. 77-82.
7. Маркичев Н. А., Елисеенко В. И., Алексеев Ю. В. и др. Фотодинамическая терапия базальноклеточного рака кожи с применением фотосенсибилизатора хлоринового ряда // Лазерная медицина. 2005. Т. 9, № 1. С. 16-20.
8. Наговицын И.А., Чудинова Г. К., Савранский В. В. и др. Оптические свойства смесей b-каротина и хлорофилла а, адсорбированных на бычий сывороточный альбумин // Биофизика. 2007. Т. 52, № 4. С. 643-647.
9. Сенчук В. В., Бондарюк Е. В. Флуоресцентный анализ взаимодействия флавонолов с гемоглобином и бычьим сывороточным альбумином // Журнал прикладной спектроскопии. 2007. Т. 74, № 5. С. 659-664.
10. Артюхов В. Г., Путинцева О. В. Оптические методы анализа интактных и модифицированных биологических систем. Воронеж: Изд-во Воронеж. ун-та. 1996. 240 с.
11. Кленин В. И., Щеголев С. Ю., Лаврушин В. И. Характеристические функции светорассеяния дисперсных систем. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та. 1977. 177 с.
12. Власова О.Л. Многопараметрический подход к оптическому анализу модельных дисперсий бычьего сывороточного альбумина // Научно-технические ведомости СПбГПУ. 2009. Т. 77, № 2. С. 39-45.
13. Хайруллина А. Я., Пархоц М. В., Олейник Т. В. и др. Измерение спектров поглощения фотосенсибилизатора хлорина е6 и гемоглобина в цельной крови методом, основанным на многократном рассеянии света // Оптика и спектроскопия. 2001. Т. 91, № 1. С. 54-60.
14. Власова О. Л., Килимник В. А., Любинский А. И. и др. Разработка новой наукоемкой инновационной технологии фотодинамической диагностики рака // Формирование технической политики инновационных наукоемких технологий. СПб.: Изд-во Политехнич. ун-та. 2004. С. 389-397.
15. Сизова О. В., Власова О.Л. Оптические свойства растворов бычьего сывороточного альбумина и плазмы крови животных, фотосенсибилизированных радахлорином // Научные исследования и инновационная деятельность. СПб.: Изд-во Политехнич. ун-та. 2007. С. 262-269.
16. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э. и др. Основы биохимии. Т. 3. М.: Мир. 1981. 534 с.
Статья поступила в редакцию 10 февраля 2011 г.
