CC BY
14
© Коллектив авторов, 2012 г. УДК 616.15:543.42
Л. В. Галебская, И. Л. Соловцова, В. П. Фаенкова, М. А. Соловьева, Д. А. Овчинников
ВЛИЯНИЕ ПЛАЗМЫ КРОВИ НА СПЕКТРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА КОПРОПОРФИРИНА III
Кафедра биологической химии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И. П. Павлова
ВВЕДЕНИЕ
Способность порфиринов под действием света генерировать синглетный кислород, оказывающий разрушительное действие на клетки, помогла утвердиться им в качестве эффективных фотосенсибилизаторов, широко применяемых в фотодинамической терапии ряда заболеваний [1, 6].
Рис. 1. Спектры копропорфирина в водной среде (pH 7,4). Концентрация копропорфирина: 1 - 5,14 нмоль/мл; 2 - 11,02 нмоль/мл
ЕС
я щ * iw h vi т fc i»
тшн
Рис. 2. Влияние плазмы крови человека на спектр поглощения КП III: 1 - плазма, разведенная в 5 раз; 2 - КП III (11,02 нмоль/мл); 3 - КП III (5,14 нмоль /мл); 4 - плазма, разведенная 1:5 с КП III (11,02 нмоль /мл); 5 - плазма, разведенная 1:5 с КП III (5,14 нмоль /мл)
Спектр копропорфирина Ш (КП Ш)в водной среде при нейтральном значении pH характеризуется единичным пиком в области 300-430нм с максимумом при 372-373 нм. На правом склоне пика выявляется «плечо», соответствующее длине волны 392 нм. По данным литературы, коп-ропорфирин III, как и другие порфирины, в водной среде подвергается олигомеризации [3]. При этом полагают, что длина волны 392 нм соответствует максимуму поглощения мономера, а максимум 373 нм приходится на преобладающую димерную форму порфирина. В цитируемой работе спектры порфиринов регистрировали в изотоническом фосфатном буфере при pH 6,98, здесь же показано, что варьирование температуры в диапазоне 8,5-50 оС и ионной силы в диапазоне 0,1-0,4 М существенно не влияло на константу диссоциации димера, а увеличение pH способствовало некоторому сдвигу равновесия в пользу мономерной формы.
Установлено, что димеры КП обладают большей фотосенсибилизирующей активностью по сравнению с мономерами [5]. Имеются сообщения о том, что в присутствии высоких концентраций сыворотки крови и сывороточного альбумина фотосенсибилизация клеток гематопорфириновыми производными заметно снижается. По мнению авторов, это является следствием уменьшения захвата молекул порфирина клетками [6].
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовался препарат КП Ш производства фирмы ООО «Элест» (Санкт-Петербург), бычий сывороточный альбумин (БСА) (Sigma), аргинин (Reanal). Плазма крови была получена от здоровых доноров в возрасте 20-25 лет. Забор крови производился из локтевой вены в изотонический раствор цитрата натрия. Цитратную кровь центрифугировали в течение 20 минут при 3000 об./мин, плазму отделяли декантацией.
КП разводили мединаловым буфером (pH=7,2), снимали спектры на спектрофотометре СФ 2000 в кюветах с толщиной оптического слоя 1 см.
При исследовании влияния различных компонентов на спектральные характеристики КП Ш разведенный препарат КП предварительно инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре либо с плазмой (разведение в инкубационной смеси 1:5), либо с альбумином или аргинином, а затем снимали спектры.
Электрофорез проводился на приборе для вертикального электрофореза фирмы «Helikon» (Москва, Россия) в 10 % ПААГ, 0,025 М трис - HCl-буфере (рН = 8,3). Альбумин и копропорфирин в наносимых на гель пробах содержались в количестве 4 мкг. Электрофорез проводился в течение 2 часов при комнатной температуре. Пластинки геля окрашивались в растворе Кумасси ярко голубом в течение четырех часов.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В наших условиях эксперимента, т. е. в изотоническом веронало-мединаловом буфере и при более высоком зна-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
чении рН (7,2), спектры КП, показанные на рис. 1 практически не отличаются от приведенных в работе [2] . Необходимо отметить, что пик, соответствующий мономеру (392 нм), отчетливее виден в более разбавленном растворе КП Ш. Введение КП в плазму крови приводило к сильной деформации пика КП (рис. 2): наблюдалось его батохромное смещение в область 360-450 нм с расширением вершины пика. Максимум, характерный для водного раствора КП, при 373 нм исчезает, а на вершине пика различались три максимума - 392, 410 и 419 нм. Этот факт следует учесть при необходимости мониторировать концентрацию фотосенсибилизатора (ФС) в крови пациентов при проведении сеансов фотодинамической терапии.
Очевидно, что изменение спектра КП при введении его в плазму крови обусловлено взаимодействием ФС с компонентами крови и/или воздействием компонентов плазмы на соотношение мономерной и олигомерных форм КП. Отсутствие пика при 373 нм (максимум димер-ной формы ФС) и появление выраженного максимума при 392 нм свидетельствует о сдвиге равновесия в пользу мономера. Действительно, отношение величин оптической плотности ОВ373/392, которое отражает соотношение олигомерной и мономерной форм КП, для водного раствора было значительно больше единицы и составляло 1,5±0,2 (п=11), а для плазмы крови оказалось меньше единицы и равнялось 0,75±0,1.
Преобладающим компонентом плазмы крови является альбумин, его концентрация составляет в среднем 700 мкМ. Исследование влияния альбумина на спектр КП показало его участие в изменении характеристик пика КП. На рис. 3 показаны спектры КП в присутствии трех концентраций альбумина: 14, 28 и 56 мкМ. Как и плазма, альбумин вызывал батохромный сдвиг пика КП в область 340- 450 нм. На пике можно зарегистрировать только два максимума - 392 и 404 нм. Полной идентичности со спектром КП в плазме крови не наблюдается. Альбумин снижал коэффициент ОВ373/392
Рис. 6. Результаты электрофореза в ПААГ (неденатурирующие условия): 1 - альбумин; 2 - смесь альбумина и КП III после инкубации 30 минут; 3 - КП III: а - окрашено Кумасси ярко голубым, б - без окрашивания
Рис. 3. Влияние альбумина на спектр поглощения КП III (результаты одного из семи экспериментов). Концентрация КП III в пробе - 5,14нмоль /мл. Концентрация альбумина: 1 - отсутствует; 2 - 14 мкМ; 3 - 28 мкМ; 4 - 56 мкМ.
Рис. 4. Коэффициент ОВ 373/392 спектров поглощения КП Ш в присутствии альбумина. К (контроль) - КП без БСА, концентрация КП: 1 - 5,14 нмоль/мл; 2 - 11,02 нмоль /мл; 3 - 19,29 нмоль/мл.
Относительная величина (в % к контролю) оптической плотности при 373 и 392 нм водного раствора КП (19,29 нмоль/мл) в присутствии альбумина (средние из 7 экспериментов)
Длина волны, нм Альбумин, мкМ
14 28 56
373 73±8 76±5 83±6*
392 102±7 116±9 136 ±9*
* - p<0,05.
Рис. 5. Спектры поглощения: 1 - КП III (11,02 нмоль/мл); 2 - альбумина (420 мкМ); 3 - смеси КП III (11,02 нмоль/мл) и альбумина (420 мкМ)
Рис. 7. Влияние аргинина на спектр поглощения КП. Концентрация КП в пробе - 19,29 нмоль/мл. Концентрация аргинина: 1 - отсутствует; 2 - 24 мМ; 3 - 12мМ; 4 - 6мМ
Рис. 8. Влияние L-аргинина на коэффициент OD373/392 спектра поглощения КП III. К (контроль) - КП без L-аргинина, концентрация КП: 1 - 5,14 нмоль/мл; 2 - 11,02 нмоль /мл;
3 - 19,29 нмоль /мл
(рис. 4), что указывает на увеличение содержания в среде мономерной формы КП. Из данных, представленных на рис. 4 видно, что альбумин значительно снижает коэффициент OD373/392 и степень снижения зависит как от концентрации альбумина, так и от содержания в среде КП. Чем ниже содержание КП, тем значительней сдвиг равновесия в пользу мономера КП. При минимальной из исследованных концентраций КП коэффициент снижался в два раза, независимо от концентрации альбумина.
В таблице приведены данные об изменении поглощения КП в процентах к контролю раздельно для 373 и 392 нм.
Из данных таблицы видно, что снижение коэффициента OD373/392 связано как с понижением оптической плотности при 373 нм, так и с повышением максимума 392 нм, особенно значительного при более высокой концентрации альбумина.
Определение спектра КП при концентрации альбумина, близкой физиологической -420 мкМ, показало практическое слияние белкового пика и пика КП (рис. 5) с множеством трудно регистрируемых максимумов.
Характер спектра отличается от спектров, полученных в плазме крови. Воздействие альбумина на спектр КП может быть объяснено образованием комплексов между белком и порфирином.
Проведение электрофореза в неденатурирующих условиях смеси альбумина с КП не выявило наличия КП в полосах, относящихся к мономерному или олигомер-ным формам белка (рис. 6).
Другим компонентом плазмы, исследованным в качестве модификатора спектра КП, являлся L-аргинин (Арг). Концентрация Арг в плазме крови составляет 90-250 мМ. По данным литературы, L-аргинин тормозит олигомери-зацию порфиринов [3].
Наши эксперименты показали, что Арг, хотя и не изменяет положение пика КП, но значительно повышал максимум при 392 нм (рис. 7). Величина коэффициента OD373/392 в присутствии Арг уменьшалась, но, в отличие от альбумина, не наблюдалось зависимости эффекта от концентрации аминокислоты (рис. 8). При всех исследованных концентрациях КП и Арг коэффициент снижался практически вдвое. Такие же результаты получены и для физиологической концентрации Арг, равной 92 мМ. Снижение пика было связано не столько с уменьшением оптической плотности при 373 нм (81±8 % от контроля, n=17), сколько с повышением оптической плотности при 392 нм (159±19 %, n=17).
Воздействия Арг на спектр КП имеет однозначный характер по сравнению с эффектом альбумина. В настоящее время трудно объяснить значительное уширение пика КП в смеси с альбумином. Поскольку альбумин находится в водном растворе не только в мономерной, но и в нескольких олигомерных формах, возможно появление многих порфирин-белковых агрегатов. Отсутствие электрофоретического подтверждения связывания КП с альбумином можно объяснить слабостью связей между белком и порфирином и динамическим характеров этого взаимодействия.
Исследованые компоненты плазмы объясняют изменения спектральных свойств КП Ш в присутствии плазмы лишь частично. Так, батохромный сдвиг главного пика порфирина может быть объяснен воздействием альбумина как фактора, смещающего равновесие в пользу мономерного КП III. Полученные нами данные согласуются с результатами исследования влияния альбумина на другой порфирин, а именно, радахлорин [4].
Для полного прояснения причин обнаруженных нами изменений спектральных характеристик КП Ш, необходимо продолжить анализ спектров КП Ш в присутствии плазмы исследованных и, возможно, других компонентов.
ВЫВОДЫ
1. Плазма крови вызывает батохромный сдвиг и деформацию спектра копропорфирина III. Максимум поглощения КП в плазме соответствует мономерной форме копропорфирина и равняется 392 нм. Поэтому для определения концентрации фотосенсибилизатора в крови пациентов следует регистрировать КП не по
ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
известному для водной среды максимуму 373 нм, а при 392 нм.
2. Альбумин в концентрациях 14-56 мкМ вызывает батохромный сдвиг и расширение пика КП. Уменьшение отношения OD373/392 в присутствии альбумина свидетельствует об увеличении концентрации мономерной формы фотосенсибилизатора. Эффект альбумина зависит как от концентрации КП, так и от содержания белка. По данным электрофореза, прочного взаимодействия альбумина с КП не происходит.
3. L-аргинин в концентрациях 6-92 мМ не смещает, но изменяет форму пика КП. Независимо от своей концентрации, L-аргинин в два раза уменьшает коэффициент OD373/392, главным образом за счет повышения оптической плотности при 392 нм, соответствующей максиму поглощения мономерной формы порфирина.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гельфельд М. Л. Фотодинамическая терапия в онкологии // Практич. онкол. 2007. Т. 8. № 4. С. 204-210.
2. Bohmer R. M., Morstyn G. Uptake of hematoporphy-rin derivative by normal and malignant cells: Effect of serum, pH, temperature, and cell size // Canc. Res. 1985. № 45. P. 5328-5334.
3. Braun S. B., Shillcock M. Equilibium and kinetic studies of the aggregation of porphyrins in aqueous solution // Biochem. J. 1976. Vol. 153. P. 279-285.
4. DouillardS., Olivier D., Patrice T. In vitro and in vivo evalution of Radachlorin for photodynamic therapy // Photochem. Photobiol. 2009. Vol. 8. № 3. P. 405-412.
5. Grossweiner L. I., Fernandez J. M., Bilgin M. D. Photosensitisation of red blood cell heamolysis by photodynamic agents // Lasers Med Sci. 1998. Vol. 13. P. 42-54.
6. O'Connor A. E., Gallaer W. M., Byrne A. T. Porphyrin and nonporphyrin photosensitizers inoncology: preclinical and clinical advancers in photodynamic therapy // Photochem. Photobiol. 2009. Vol. 85. № 5. P. 1052-1073.
РЕЗЮМЕ
Л. В. Галебская, И. Л. Соловцова, В. П. Фаенкова, М. А. Соловьева, Д. А. Овчинников
Влияние плазмы крови на спектральные свойства копро-порфирина III
Исследовано влияние цельной плазмы крови и некоторых ее компонентов на спектральные свойства копропорфирина III (КП III). Выявлены батохромный сдвиг и деформация спектра КП III в присутствии плазмы, что, вероятно, является следствием взаимодействия компонентов плазмы с молекулами КП III, а также их влияния на олигомеризацию КП III. Вызванные плазмой изменения в спектре КП III необходимо учитывать при анализе спектров плазмы крови пациентов, получающих КП при сеансах фотодинамической терапии. Компоненты плазмы альбумин и аргинин вызывали характерные изменения в спектрах КП III и способствовали образованию мономерной формы порфирина.
Ключевые слова: копропорфирин, спектр поглощения, альбумин, аргинин, фотосенсибилизатор, фотодинамическая терапия.
SUMMARY
L. V. Galebskaya, I. L. Solootsooa, V. P. Faenkova, M. A. Solov'eva, D. A. Ovchinnikov
Blood plasma modification of the coproporphyrin III spectrum
The influence of the whole blood plasma and of some its components, upon the coproporphyrin III (CPIII) spectrum was under study. A bathochromic shift and some CPIII spectrum deformation were found in the presence of plasma, presumably due to CPIII and plasma components complex formation, and plasma interference in the CPIII olygomerization. Changes in the spectrum of CPIII induced by plasma should be considered in the patient plasma analysis in the process of the photodynamic therapy with CPIII. The tested plasma components namely albumin and L-arginine induced some specific changes in the CPIII spectrum, and facilitated the transition of CPIII into its monomeric form.
Key words: coproporphyrin, absorption spectrum, albumin, arginine, photosensitizer, photodynamic therapy.
