CC BY
12DOI https://doi.org/10.47612/1999-9127-2021-30-61-67 УДК 575.174.015.3+575.162
Е. Л. Романишко, М. Е. Михайлова, Р. И. Шейко
ВЫЯВЛЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМОВ 1843С>Т В ГЕНЕ RYR1 И 5860C>T В ГЕНЕ DMD, АССОЦИИРОВАННЫХ СО СТРЕССОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ СВИНЕЙ, С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТЕХНОЛОГИИ KASP
Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: lenaramanishko@mail.ru
Подверженность свиней стрессам представляет для свиноводства серьезную экономическую проблему. Методом конкурентной аллель-специфической ПЦР (KASP) исследованы генетические факторы, обуславливающие чувствительность свиней к стрессу, такие как полиморфизмы 1843С>Т в гене RYR1 (rs344435545) и 5860С>Т в гене DMD (rs196952080) у пород, разводимых в Республике Беларусь. Частота встречаемости животных-носителей стресс-синдрома, ассоциированного с полиморфизмом гена DMD (генотип ТО/ТТ), составила в породе ландрас 2,8%. Мутантный аллель Т выявлен в выборке животных породы ландрас с частотой — 14,2%, дюрок — 1,3%, йоркшир — 0,8%. Мутантных аллелей n в гене RYR1 в исследованной выборке животных не выявлено. Результаты исследований показывают, что для контроля и элиминации проявления стресс-синдрома в популяции необходимо проведение ДНК-диагностики племенных животных по выявлению несинонимичных замен в генах RYR1 и DMD.
Ключевые слова: свиноводство, генетические дефекты, ДНК-тестирование KASP, RYR1, DMD, стресс-синдром.
Введение
Современная технология содержания свиней в крупных промышленных комплексах значительно отличается от естественных условий обитания животных. Комплексные зоотехнические и ветеринарные мероприятия, а также шум, скученность, замкнутое пространство становятся источниками сильного стресса у животных. Под влиянием стресса у свиней снижаются масса тела, воспроизводительные качества, увеличивается восприимчивость к инфекциям. Такие животные более требовательны к содержанию и кормлению. Поведенческая и физиологическая реакция организма на стресс получила название стресс-синдрома (PSS, porcine stress syndrome).
Характерные особенности свиней, подверженных PSS-синдрому, — повышенная возбудимость, гормональные расстройства, изменения в сердечно-сосудистой системе, нарушение теплообмена, из-за чего стрессочувствительные свиньи страдают от перегрева, что приводит к синдрому злокачественной гипертермии —
MHS (Malignant hypertermia syndrome). Ускоренный метаболизм и анаэробный гликолиз в скелетных мышцах приводят к образованию избыточного количества молочной кислоты, с утилизацией которой организму животного трудно справиться. Высокая концентрация молочной кислоты и высокая температура тела является причиной смерти чувствительных к стрессу животных, а также вызывают биохимические изменения в скелетной мускулатуре таких животных, у которых после убоя патологически бледная, водянистая и мягкая свинина с кислым вкусом — PSE (pale, soft,exudative) [1-4].
Длительная односторонняя селекция свиней на улучшение постности мяса привела к тому, что ряд высокопродуктивных мясных пород, таких как ландрас, пьетрен, гемпшир и йоркшир имеют повышенную чувствительность к стрессам. В исследовании Fujii J. с соавторами был описан однонуклеотидный полиморфизм 1843С>Т (rs344435545) в 17 экзоне гена рецептора рианодина (RYR1), ассоциированный со стрессочувствительностью свиней [5].
Ген рецептора рианодина кодирует экспрес-сирующийся в скелетных мышцах белок кальциевого канала. Замена цитозина на тимин приводит к аминокислотной замене аргинина на цистеин в кодоне 615 (R615C), в результате чего нарушается структура одного из ферментов кальциевого канала и, как следствие, изменяется ход обменных процессов кальция в скелетных мышцах. У гомозиготных животных с генотипом nn наблюдается так называемый индуцируемый стрессом синдром злокачественной гипертермии — MHS [5, 6]. До 12% исследованных животных с генотипом nn умирают от PSS и до 50% — имеют порок PSE [7]. Поскольку полиморфизм 1843С>Т ассоциирован с высоким содержанием более постного мяса в туше, интенсивная селекция на мясность привела к тому, что частота встречаемости этой мутации в популяциях свиней значительно выросла. Так, частота мутантного аллеля n в зависимости от породы составляла: в Канаде до 8,6% [7], в Румынии до 9,4% [8], в Словении до 21,4% [9], в России — 1,3% [10]. Животные с высоким содержанием мяса часто характеризуются низкой устойчивостью к стрессу, следствием чего является ухудшение качества свинины, замедление роста поросят, снижение репродуктивных показателей и иммунного статуса животных. Однако объяснить все случаи PSS с помощью только одного полиморфизма в гене RYR1 не удалось, поэтому поиски других полиморфизмов в геноме свиней продолжили.
Так, Nonneman Dan J. с соавторами описали мутацию 5860C>T (rs196952080) в гене дистрофина (DMD), которая вызывает новый стресс-синдром свиней [11]. Этот однонукле-отидный полиморфизм приводит к аминокислотной замене аргинина на триптофан в кодоне 1958 (R1958W), что ведет к уменьшению экспрессии дистрофина в диафрагме, поясничной и длиннейшей мышце спины [12, 13]. Из-за локализации гена на Х-хромосоме, стресс-синдром, как правило, встречается в основном у хряков, унаследовавших Х-хромосому с дефектным аллелем от матери. Наибольшая восприимчивость к стрессу у свиней отмечается в возрасте двух-трех месяцев, который проявляется в виде проблем с дыханием после стрессовой ситуации. Такие животные становятся малоподвижными и редко восстанавливаются
после стресса. На данный момент отсутствует информация о распространении мутантного аллеля гена DMD, обуславливающего развитие стресс-синдрома свиней у племенных животных различных пород, разводимых в Республике Беларусь. Однако согласно решению № 74 от 02.06.2020 г. положения о порядке проведения молекулярной генетической экспертизы племенной продукции государств-членов Евразийского экономического союза, свиньи подлежат обязательному тестированию на RYR-синдром и DMD-стресс-синдром.
Поэтому цель работы заключалась в применении KASP технологии для идентификации полиморфных вариантов (SNP) 1843С>Т (RYR1) и 5860C>T (DMD) и исследовании частоты встречаемости животных носителей мутантных аллелей в выборках свиней белорусской селекции.
Материалы и методы
В качестве объекта исследования были использованы свиньи белорусской селекции пород ландрас (n = 171), йоркшир (n = 120), дюрок (n = 39).
Материалом для исследования служила ДНК, выделенная из биологического материала — проб ткани (ушной выщип) и спермы. Для выделения ДНК использовали набор реагентов «Нуклеосорб» («Праймтех», Беларусь). Количество выделенной ДНК определяли с помощью флуориметра DeNovix DS 11 FS с использованием набора реагентов для измерения концентрации ДНК DeNovix dsDNA Broad Range Kit (DeNovix, США).
Конкурентную аллель-специфическую ПЦР (KASP, Kompetitive Allele Specific PCR) проводили на приборе CFX96 (Bio-Rad, США). Реакционная смесь для проведения ПЦР(10 мкл) содержала: х2 KASP Мастер Микс, смесь специфических праймеров (KASP Assay mix), деионизированную MQ-H2O и 10 нг геномной ДНК.
Полимеразную цепную реакцию проводили по программе: 94 °C - 15 мин; 94 °С - 20 с, 60 °С — 1 мин (со снижением каждый цикл на 0,6 °С) — 10 циклов; 94 °С — 20 с, 55 °С — 60 с — 26 циклов. Анализ и учет полученных результатов ПЦР осуществляли с использованием программного обеспечения Bio-Rad CFX Mаestro.
Двуаллельная дискриминация достигается за счет конкурентного связывания двух аллель-специфических прямых праймеров. Дискриминацию аллелей для определения генотипов проводили по значениям ЯГи (относительные
единицы флуоресценции) для каналов FAM и HEX (табл. 1, рис. 1, 2).
Технология KASP позволяет значительно сократить время проведения анализа, что выгодно отличает его от ПЦР-ПДРФ анализа.
Рис. 1. Дискриминация аллелей однонуклеотидного полиморфизма 5860C>T в гене DMD с использованием технологии KASP-генотипирования: 1 кластер — хряки с генотипом TO, свиноматки с генотипом TT, стресс-чувствительные животные; 2 кластер — свиноматки с генотипом ТС, животные-носители стресс-чувствительного аллеля; 3 кластер — хряки с генотипом СО, свиноматки с генотипом СС, стресс-устойчивые
животные; 4 — контроль без матрицы (NTC)
Рис. 2. Дискриминация аллелей однонуклеотидного полиморфизма 1843С>Т в гене ЯУЯ1 с использованием технологии KASP-генотипирования: 1 кластер — особи с генотипом NN 2 кластер — особи с генотипом
3 — контроль без матрицы (ЭТС)
Таблица 1
Последовательность нуклеотидов исследуемых локусов генов RYR1 и ВЫВ
Ген Полиморфизм (БОТ) Последовательность ДНК FAM Аллель НЕХ Аллель
ЯУЯ1 ^344435545 CTGGATGTCCTGTGTTCCCTGTGTGTGTGCAATGGTG TGGCCGTG[C/T]GCTCCAACCAAGATCTCATTACTGA GAACTTGCTCCCTGGCCGCGAGCTTCTGCTGCAGA п N
БЫВ ге196952080 GATGGGGCAGCAATGGCAGTGGAGCCAACTCAGATCC AGCTCAGCAAGCGCTGG[C/T]GGGAAATTGAGAGCAA ATTTGCTCACTTTCGAAGACTCAACTTTGCACAAATTG С T
Результаты и обсуждение
Исследованы выборки свиней пород лан-драс, йоркшир и дюрок для определения полиморфизмов в генах ЯУЯ1 и БЫВ методом конкурентной аллель-специфичной ПЦР (KASP). Оценена частота аллелей и генотипов исследуемых полиморфных вариантов генов в выборке племенных животных различных пород свиней, разводимых в Республике Беларусь (табл. 2).
В нашем исследовании не было выявлено животных-носителей злокачественной гипертермии у пород ландрас, йоркшир, дюрок. В проведенном нами ранее анализе полиморфизма гена ЯУЯ1, в выборке свиней (п = 482) разных пород, выявили наличие 4,4% животных-носителей злокачественной гипертермии у породы дюрок, 6,7% у породы крупная белая и 50% у пьетрен [14]. В исследовании Р. И. Шейко частота встречаемости животных-носителей злокачественной гипертермии у крупной белой породы составила 6%, дюрок — 4%, белорусской мясной — 20,5, черно-пестрой пород — 26,0%, и 0,5% поголовья белорусской мясной породы оказалось предрасположенным к стрессам с генотипом пп [15]. Таким образом, внедрение обязательного генотипирования племенных животных по гену RYR1 в Беларуси позволило выявить и элиминировать из популяции скрытых носителей злокачественной гипертермии.
При исследовании нового PSS-синдрома, ассоциированного с геном DMD, в популяциях свиней, разводимых в республике, выявлены животные-носители с генотипом ТО/ ТТ только в популяции свиней породы лан-драс. Полученные нами данные согласуются с результатами других авторов, которые
показывают наличие дефектного генотипа в популяциях свиней пород ландрас, однако демонстрируют отсутствие мутантного аллеля Т у других пород свиней [16]. Наше исследование, проведенное не только на хряках, но и на свиноматках, показывает наличие мутантного аллеля с наибольшей частотой встречаемости в выборке животных породы ландрас — 14,2%, дюрок — 1,3% и наименьшей частотой встречаемости дефектного аллеля Т в выборке животных породы йоркшир — 0,8%.
Частота мутантных аллелей, включая рецессивные летальные аллели, увеличивается в популяциях как в результате дрейфа генов из-за небольшого эффективного размера численности популяции, так и в результате направления отбора [17, 18]. Наследственные дефекты обычно возникают в популяции в результате распространения уникальных мутаций от «основателя», которые можно проследить до выдающихся быков-производителей, которые интенсивно использовались для искусственного осеменения по всему миру. Было описано множество летальных аллелей, с высокой частотой встречаемости у крупного рогатого скота [19-21], что обусловлено высоким генетическим вкладом одного быка, от которого получены сотни тысяч дочерей. Однако в свиноводстве, предположительно, такой эффект дрейфа будет менее значимым из-за меньшей интенсивности селекции самцов [22].
Согласно исследованию Пестис В. К. и др. у свиноматки крупной белой породы с генотипом ЯУЯ1 № на 1,11 голов рождалось больше живых поросят при более высокой массе гнезда при рождении на 2,51 кг, однако сохранность была ниже, чем у маток
Таблица 2
Частоты аллелей и генотипов исследуемых полиморфных вариантов генов ЯУЯ1 и ВЫВ
Ген Порода Всего Частота встречаемости генотипов, % Частота аллелей, ±Sq
п NN п № п пп N п
КУК1 Ландрас 86 86 100 - - - - 1 -
Йоркшир 70 70 100 - - - - 1 -
Дюрок 39 39 100 - - - - 1 -
ОЫО п СС/СО п СТ п ТО/ТТ С Т
Ландрас 180 134 74,4 41 22,8 5 2,8 0,858±0,018 0,142±0,018
Йоркшир 124 122 98,4 2 1,6 - - 0,992±0,006 0,008±0,006
Дюрок 39 38 97,4 1 2,6 - - 0,987±0,013 0,013±0,013
с генотипом ЯУЯ1 NN на 25,8%. Выявлено, что животные, характеризующиеся предрасположенностью к стрессам, имели более высокое содержание мяса в туше. Результаты обвалки туш показали, что у гетерозиготных животных ЯУЯ1 Кп количество мяса на 9,1% было выше, чем у гомозиготных ЯУЯ1 NN с одновременно более высоким содержанием сала на 10% [4].
Согласно исследованию Костюниной О. В. и соавторов носители мутантного аллеля Т гена БЫВ имеют превосходство по многоплодию, массе гнезда и общему количеству рожденных поросят. Мутация гена БЫВ оказывала значимое влияние на живую массу потомков по завершению выращивания (+3,63 кг) и среднесуточный прирост (+21,65), а также уровень молочности (+0,91 кг) [16].
Таким образом, мы наблюдаем балансирующий отбор, при котором для разведения неосознанно отбирались племенные гетерозиготные животные, обладающие высокими показателями мясной продуктивности. В последние годы велась планомерная работа по элиминации животных-носителей PSE-синдрома у свиней. Однако, высокая частота встречаемости животных-носителей нового стресс-синдрома показывает необходимость ДНК-тестирования свиней по гену ВЫВ и включения данного генетического маркера в перечень обязательных для генотипиро-вания при отборе племенных животных для селекции.
Заключение
В результате исследования выборок из пород свиней ландрас, йоркшир, дюрок не было выявлено животных носителей мутантного аллеля п в гене RYR1, детерминирующего злокачественную гипертермию. Частота встречаемости животных-носителей нового стресс синдрома, ассоциированного с полиморфизмом в гене DMD (генотип ТО/ ТТ), составила 2,8% (порода ландрас). Частота встречаемости мутантного аллеля Т в выборке животных пород йоркшир — 0,8%, дюрок — 1,3% и ландрас — 14,2%.
Элиминация рецессивных наследственных аномалий в популяциях сельскохозяйственных животных требует разработки и внедрения современных систем ДНК идентификации животных-носителей мутант-ных аллелей. Предложенный метод конкурентной аллель-специфической ПЦР может быть использован для ДНК-диагностики животных, при включении DMD-стресс-синдрома в перечень обязательных для тестирования генетически детерминированных заболеваний у племенных свиней, разводимых в Беларуси. Использование разработанных методов генодиагностики свиней позволит проводить селекцию, не допуская перехода мутантных аллеей в гомозиготное состояние. Таким образом, управление генетическими ресурсами будет способствовать повышению эффективности свиноводства.
Список использованных источников
1. Князев, С. П. Проблемы дискордантности и косегрегации экспрессии галотан-чувстви-тельности свиней с мутацией 1843 С-Т в локу-се RYR1 рецептора рианодина / С. П. Князев, К. Е. Жучаев, В. В. Гарт // Генетика. - 1998. -Т. 34, № 12. - С. 1648-1654.
2. Ogawa, Y. Dysregulation of the gain of CICR through ryanodine receptor1 (RyR1): the putative mechanism underlying malignant hyperthermia / Y. Ogawa // Adv. Exptl. Med. Biol. - 2007. -Vol. 592. - P. 287-294.
3. Марзанов, Н. С. RYR1-ген у свиней отечественных и зарубежных пород / Н. С. Марзанов, Д. А. Фролкин, Н. А. Зиновьева // Доклады Российской Академии сельскохозяйственных наук. - 2001. - № 1. - С. 34-36.
4. Ассоциация полиморфизма гена RYR1 с показателями продуктивных качеств свиней пород, разводимых в Беларуси / В. К. Пестис [и др.] // Молодой ученый. - 2015. - № 5.2. - С. 33-37.
5. Identification of a mutation in porcine ryanodine receptor associated with malignant hyperthermia / Fujii J. [et al] // Science. - 1991. -Vol. 253. - P. 448-451.
6. Редкое сочетание двух новых однонукле-отидных полиморфизмов в интроне 16 гена рецептора рианодина RYR1 у свиней кемеровской породы / Н. С. Юдин [и др.] // Вестник ВОГиС. - 2010. - Т. 14, № 1. - С. 116-121.
7. Basic, I. Stress syndrome: Ryanodine receptor (RYR1) gene in malignant hyperthermia in humans and pigs / I. Basic [et al] // Gomercic periodicum biologorum. - 1997. - Vol. 99, № 3. - Р. 313-317.
8. Screening of RYR1 genotypes in swine population by a rapid and sensitive method / D. E. Ilie [et al] // Romanian Biotechnological Letters. - 2014. - Vol. 19, № 2. - Р. - 9170-9178.
9. Skrlep, M. Comparison of PRKAG3 and RYR1 gene effect on carcass traits and meat quality in Slovenian commercial pigs / M. Skrlep, T. Kavar, M. Candek-Potokar Czech // J. Anim. Sci. - 55. - 2010. - P. 149-159.
10. Смирнов, Н. Н. Взаимосвязь генотипов по генам RYR1 и ESR с естественной резистентностью и продуктивностью свиней : автореф. дис. ... канд. с.-х. наук : 06.02.07 / Смирнов Николай Николаевич. - Персианов-ский. - 2013. - 28 с.
11. Nonneman, Dan J. A detect in dystrophin causes a novel porcine stress syndrome / J., Non-
neman [et al] // BMC Genomics 2012. - № 13. -P. 233.
12. Hollinger, К. The physiological response of protease inhibition in dystrophic muscle/ K. Hollinger, J. T. Selsby //Acta Physiol. - 2013. -№ 208. - P. 234-244.
13. Новый стресс-синдром у свиней, обусловленный мутацией в гене DMD / О. В. Ко-стюнина [и др.] // Племенное дело. - 2015. -№ 8. - С. 14-15.
14. Михайлова, М. Е. Исследование генетической структуры популяций свиней по ло-кусу гена RYR1 / М. Е. Михайлова, Е. Л. Романишко, Н. А. Камыш // Весшк МДПУ iмя I. П. Шамяюна. - 2011. - Р. 20-24.
15. Шейко, Р. И. Повышение продуктивных качеств сельскохозяйственных животных на основе использования биотехнологических приемов и методов / Р. И. Шейко //Доклады Национальной академии наук Беларуси. -2017. - Т. 61, № 4. - С. 119-128.
16. Костюнина, О. В. Генетическая устойчивость свиней к стрессам и колибактериозам / О. В. Костюнина [и др.] // Достижения науки и техники АПК. - 2018. - То. 32, № 6. - С. 53-55.
17. Derks, M. L Balancing selection on a recessive lethal deletion with pleiotropic effects on two neighboring genes in the porcine genome / M. L Derks [et al] // PLoS Genet. - 2018. -Vol. 14, № 9. - P. 1-20.
18. Leroy, G. Inbreeding depression in livestock species: review and meta-analysis / G. Leroy // Anim Genet. - 2014. - Vol. 45, № 5. -Р. 618-628.
19. Михайлова, М. Е. Детекция полиморфизма rs456206907 гена SMC2, детерминирующего гаплотип фертильности hh3 у крупного рогатого скота / М. Е. Михайлова, Е. Л. Рома-нишко, А. И. Киреева // Молекулярная и прикладная генетика. - 2018. - Т. 25. - C. 67-72.
20. Hoff, J. L. Candidate lethal haplotypes and causal mutations in Angus cattle / J. L. Hoff [et al] // BMC Genomics. - 2017. - Vol. 18, № 1. -С. 799.
21. Зиновьева, Н. А. Гаплотипы фертильно-сти голштинского скота // Сельскохозяйственная биология. - 2016. - Т. 51. - C. 423-435.
22. Knol, E. F. Genomic selection in commercial pig breeding / E. F. Knol, B. Nielsen, P. W. Knap // Animal Frontiers. - 2016. -Vol. 6, № 1. - Р. 15-22.
E. L. Ramanishka, M. E. Mikhailova, R. I. Sheyko
IDENTIFICATION OF POLYMORPHISMS 1843C>T IN THE RYR1 GENE AND 5860C>T IN THE DMD GENE ASSOCIATED WITH THE STRESS SINDROM OF PIGS USING KASP TECHNOLOGY
Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus 27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, Republic of Belarus e-mail: lenaramanishko@mail.ru
Pig exposure to stress is a serious economic problem for pig breeding. We have studied genetic factors that determine the sensitivity of pigs to stress in different breeds of pig such as polymorphisms 1843C>T in the RYR1 gene (rs344435545) and 5860C>T in the DMD gene (rs196952080) in the Republic of Belarus using the competitive allele-specific PCR (KASP) method. The frequency of occurrence of animals carrying stress syndrome associated with the DMD gene polymorphism (TO/TT genotype) was 2.8% in the Landrace breed. The mutant T-allele was identified in the sample of animals of the Landrace breed with a frequency of 14.2%, in Duroc - 1.3%, in Yorkshire - 0.8%. Mutant n-alleles were not found in the RYR1 gene in the studied sample of animals. The study results demonstrate that DNA diagnostics of breeding animals is required to identify nonsynonymous substitutions in RYR1 and DMD genes in order to control and eliminate stress syndrome in pig population.
Keywords: pig breeding, genetic defects, DNA testing, KASP, RYR1, DMD, stress syndrome.
Дата поступления статьи: 22 февраля 2021 г.
