CC BY
29
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ И ТЕХНОЛОГИИ
УДК 616-022:612.6.05-053.2
БЫМБЛЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ В РАЗЛИЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ для ФОРМИРОВАНИЯ ГРУПП РИСКА Б ОТНОШЕНИИ ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ ТУБЕРКУЛЕЗОМ
Н. В. Ставицкая', А. Е. Дорошенкова', А. Л. Поспелов2, С. Ю. Кордичева2, М. М. Авербах2, В. Я. Гергерт2, Л. Е. Поспелов2
1 Кубанский государственный медицинский университет, г. Краснодар, 2Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза РАМН, г. Москва
Было обследовано 40 больных туберкулезом и 99 здоровых детей и подростков тувинской национальности (монголоиды) из Республики Тыва и 60 человек, проживающих на территории Краснодарского края (европеоиды), из которых 18 детей были здоровы, 8 — с поствакцинальными осложнениями, 34 ребенка были больны туберкулезом. Генотипирование локуса ШТ4 генов NRAMP1 и НЬА^ЯВ1 было проведено в каждой группе. Результаты исследования могут быть использованы для формирования групп риска в отношении заболеваемости туберкулезом генетического типирования для каждой конкретной популяции.
Ключевые слова: риск развития туберкулеза, генетика, дети.
ВВЕДЕНИЕ
Из 6,6 млрд человек, проживающих на Земле, приблизительно 2 млрд инфицированы микобактерией туберкулеза (ТВ). Однако только 10% из них заболевают туберкулезом. Возникновение туберкулеза является результатом сложного взаимодействия экологических условий и генотипа хозяина, приводящих в совокупности к развитию болезни. Большое количество семейных наблюдений поддерживает гипотезу влияния генотипа хозяина на туберкулезную болезнь [5]. Концепция генетической предрасположенности к туберкулезу также получила сильную научную поддержку благодаря обширным по-пуляционным исследованиям [7, 10]. Возникновение первичного туберкулеза у детей ско-
рее вызвано генетическими дефектами, в то время как у взрослых на восприимчивость к туберкулезу чаще всего влияют другие факторы (социальные, экологические), однако это не исключает и наличия генетических дефектов [6, 8].
С другой стороны, связь определенных генетических маркеров с любым заболеванием, в том числе и туберкулезом, не является однозначной. Это отражается на выявлении положительных ассоциаций с туберкулезом различных генетических вариантов одних и тех же генов в разных по происхождению популяциях [2, 3, 4]. Поэтому выявление групп риска в отношении заболеваемости туберкулезом с помощью генетических методов диктует необходимость проведения исследований в различных региональных популяциях.
Пермский медицинский журнал
2010 том XXVII № 4
Материалы и методы
ИССЛЕДОВАНИЯ
Аргументы в пользу вышесказанного предоставляют наши исследования, которые проводились в Республике Тыва и Краснодарском крае при обследовании здоровых и больных детей и подростков по генам HLA-DRB1 и NRAMP1 (полиморфизм INT4).
Было обследовано 40 больных туберкулезом и 99 здоровых детей и подростков тувинской национальности (монголоиды) из Республики Тыва и 60 человек, проживающих на территории Краснодарского края (европеоиды), из которых 18 детей были здоровы, 8 — с поствакцинальными осложнениями, 34 ребенка были больны туберкулезом. Образцы периферической крови больных туберкулезом и здоровых детей и подростков собирались и помещались в пробирки с EDTA. ДНК выделялась из крови пациентов с помощью наборов для выделения ДНК (Magna DNA Prep 200) ООО «Лаборатория «ИзоГен» (Россия). Праймеры и условия амплификации полимеразной цепной реакции использовались согласно методике S0borg C. е; а1., 2002 [10]. Полимеразная цепная реакция проводилась из 20 мкл объема, содержащего 4 мкл ДНК. Праймеры были заказаны на фир-
ме «Синтол» (Россия). Подсчет частоты встречаемости аллелей и генотипов проводился стандартными статистическими методами [1].
Результаты и их обсуждение
Как показали исследования (табл. 1), в краснодарской популяции у детей и подростков, больных туберкулезом органов дыхания, с повышенной частотой встречались специфичности *04 и ША^Ш:* 16
по сравнению со здоровыми донорами (33,3% против 12,3% и 13,3% против 3,5% соответственно). В то же время в группе здоровых детей этой популяции значительно чаще по сравнению с группой больных туберкулезом детей встречалась специфичность HLA-DRB1*16 (16,7% против 3,5%). Разница во всех случаях была статистически достоверной. Сравнение частоты встречаемости специ-фичностей гена HLA-DRB1 у больных туберкулезом и здоровых детей и подростков тувинской национальности показало разницу в распределении ряда других специфичностей в сравниваемых группах. Так, у больных туберкулезом легких чаще, чем у здоровых лиц, встречались специфичности HLA-DRB1*13 (37,7% против 19,1% соответственно)
Таблица 1
Частота встречаемости специфичностей HLA-DRB1 у детей в разных популяциях
HLA-DRB1 Республика Тыва Краснодарский край
Здоровые (n=84) Больные туберкулезом (n=53) Здоровые (n=57) Больные туберкулезом (n=60)
04 0,2976 0,3207 0,1228 0,3333
07 0,2262 0,2075 0,3684 0,2000
13 0,1905 0,3774 0,2105 0,1500
14 0,0833 0,2075 0,1053 0,0667
15 0,2619 0,1132 0,2105 0,1167
16 0,0476 0,0377 0,0351 0,1667
Примечание. DRB1*04: %2=7,30; p<0,01; RR=3,57; DRB1*07: %2=4,09; p<0,05; RR=0,43; DRB1*13: %2=5,82; p<0,01; RR=2,58; DRB1*14: %2=4,39; p<0,05; RR=2,88; DRB1*15: %2=4,41; p<0,05; RR=0,36; DRB1*16: %2=5,50; p<0,05; RR=5,50.
и DRB1*14 (20,7% против 8,3% соответственно), а специфичность HLA-DRB1*15, наоборот, чаще встречалась у здоровых лиц тувинской национальности (26,2%) по сравнению с больными туберкулезом детьми (11,3%). Разница также во всех случаях была статистически достоверной.
Полученные нами данные указывают на то, что ассоциации с туберкулезом по антигенам класса II HLA-системы в указанных регионах различаются.
Помимо этого, как показали исследования (табл. 2), из возможных вариантов полиморфизма INT4 (С/С, C/G, G/G) гена NRAMP1 в группе здоровых детей тувинской национальности фактически наблюдаемая частота встречаемости генотипа С/С (Рф=0,0510) была в два раза ниже ожидаемой (теоретически рассчитанной) (Ро=0,1099). Эта тенденция сохранялась и для общей группы обследованных детей тувинской национальности (здоровые плюс больные туберкулезом), где наблюдаемая (фактическая) частота встречаемости генотипа С/С (Рф=0,0579) также была в два раза ниже ожидаемой (теоретически рассчитанной) (Ро=0,10б3).
При обследовании детей и подростков, проживающих на территории Краснодарского края, были выявлены другие закономерности распределения генотипов локуса INT4 в сравниваемых группах. Так, в группе здоровых детей не было обнаружено различий между фактически наблюдаемой и ожидаемой частотой встречаемости генотипов С/С, G/G, С/G. В то же время в группах детей с поствакцинальными осложнениями и локальным туберкулезом гомозиготный генотип С/С не был обнаружен вовсе, а в группе здоровых детей этот гомозиготный генотип встретился в 11,1% случаев.
Поскольку в группе здоровых детей тувинской национальности выявлен значительный недостаток гомозиготного генотипа С/С локуса INT4, а заболеваемость детского населения Республики Тыва значительно выше по сравнению с заболеваемостью детей в Краснодарском крае, вероятно, что генотип С/С определяет резистентность к туберкулезу и его недостаток в тувинской популяции влияет на повышенную чувствительность к туберкулезной инфекции у тувинцев. Результаты исследования детского населения Крас-
Таблица 2
Частота встречаемости аллелей и генотипов локуса гена NRAMP1 у детей в разных популяциях
Генотип Республика Тыва Краснодарский край
Здоровые (n=99) Больные туберкулезом (n=40) Общая группа (n=139) Здоровые (n=18) Больные туберкулезом (n=34) Поствакцинальные осложнения (n=8)
Рф/Ро Рф/Ро Рф/Ро Рф/Ро Рф/Ро Рф/Ро
C/C 0,0510 0,0750 0,0579 0,1111 0 0
0,1099 0,0976 0,1063 0,1304 0,0625 0,0352
G/G 0,3877 0,4467 0,4520 0,4726 0,4058 0,4541 0,3889 0,4082 0,5000 0,5625 0,6250 0,6602
C/G 0,5612 0,4493 0,4749 0,4297 0,5363 0,4395 0,5000 0,4614 0,5000 0,3750 0,3750 0,3047
C 0,3316 0,3125 0,3261 0,3611 0,2500 0,1875
G 0,6684 0,6875 0,6739 0,6389 0,7500 0,8125
Примечание. Рф — частота фактическая (наблюдаемая); Ро — частота ожидаемая (теоретически рассчитанная).
Пермский медицинский журнал
2010 том XXVII № 4
нодарского края подтверждают выводы о влиянии генотипа С/С на восприимчивость к туберкулезу, поскольку этот генотип встречается только у здоровых индивидов, определяя, наряду с другими генетическими факторами, резистентность к туберкулезной инфекции.
Выводы
Таким образом, в исследованных популяциях положительно ассоциируются с туберкулезом как разные аллели одного и того же гена (в данном случае — HLA-DRB1), так и одинаковые аллели одного и того же гена (NRAMP1). Этот факт указывает на необходимость для формирования групп риска в отношении заболеваемости туберкулезом генетического типирования для каждой конкретной популяции.
Вышеуказанные данные подтверждают теорию о значительном влиянии генетических факторов на предрасположенность к заболеванию туберкулезом. Но, к сожалению, хотя известно много аллельных вариантов генов, ассоциирующихся с туберкулезом, еще не установлены сочетания этих полиморфизмов, характерные для различных популяций, которые в совокупности в еще большей степени влияют на восприимчивость к туберкулезной инфекции по сравнению с отдельными аллелями. Решению этих вопросов будут посвящены дальнейшие иммуногенети-ческие исследования в обследованных популяциях.
Библиографический список
1. Вейр Б. Анализ генетических данных/Пер. с англ.— М.: Мир, 1995.
2. Изучение распределения антигенов системы НЬА у больных туберкулезом и здоровых лиц в отдельных регионах Республики Тыва/Л. Е. Поспелов, А. Г. Матракшин,
В. В. Еремеев, Е. М. Месько, С. Б. Хайбы// Проблемы туберкулеза и болезней легких.- 2003.- № 1.- С. 54-55.
3. Изучение связи распределения антигенов локуса DR системы HLA и туберкулеза в различных популяциях/Л. Е. Поспелов, Л. Д. Серова, А. Ф. Маленко, В. И. Литвинов //Проблемы туберкулеза.— 1987.— № 10.- С. 54-56.
4. Массовое иммуногенетическое обследование больных легочной патологией в различных регионах Советского Союза/ В. И. Литвинов, Л. Е. Поспелов, А. Ф. Маленко, Н. А. Кетова//Конф. «Методология, организация и итоги массовых иммуно-генетических обследований».- Ангарск, 1987.- С. 53-54.
5. A study on the family contacts examination of tuberculosis patients (6 report)/ K. Kameda, N. Kuchii, F. Horii et al// Kekkaku.- 1983.- Vol. 58 - № 1.- P. 3337.
6. Alleles of the NRAMP1 gene are risk factors for pediatric tuberculosis disease/5. Malik, L Abel, H. Tooker et al.//PNAS.- 2005.-Vol. 102.- № 34.- P. 12 183-12 188.
7. Buschman E. Human genetics of infectious diseases: progress and prospects, in the genetic basis of common diseases: 2nd edn./E. Buschman, E. Skamene, E. Schurr// Oxford: Oxford University Press. P. 181197.
8. Casanova J. L. Genetic dissection of immunity to mycobacteria: the human model/ J. L. Casanova, L. Abel//Ann. review of immunology.- № 20.- P. 581-628.
9. Szborg C. Madsen et al./C. Szborg, A. B. Andersen, O. Hanst//Journal of infectious diseases.- 2002.- Vol. 186.- № 1.-P. 517-521.
10. Tuberculosis in children and adults: two distinct genetic diseases/A. Alcais, C. Fieschi, L. Abel, J. L. Casanova//J. of experimental medicine.- 2005.- Vol. 202.- № 2.-P. 1617-1621.
N. V. Stavitskaya, A. E. Doroshenkova, A. L. Pospelov, S. Yu. Kordicheva, M. M. Averbakh, V. Ya. Gergert, L. E. Pospelov
INVESTIGATION OF GENE POLYMORPHISM IN DIFFERENT POPULATIONS FOR THE PURPOSE OF FORMING RISK GROUPS IN RELATION TO TUBERCULOSIS MORBIDITY
Forty patients with tuberculosis and 99 children and adolescents of Tuvinian nationality (mongoloids) from Republic of Tuva and 60 persons living on the territory of Krasnodarskiy Krai (europeoids) including 18 healthy children, 8 — with postvaccinal complications and 34 —
with tuberculosis were examined. Genetic typing of INT4 locus of NRAMP1 gene and HLA-DRB1 was carried out in each group. Results of investigation can be used to form risk groups in relation to tuberculosis morbidity for each concrete population.
Keywords: risk of tuberculosis development, genetics, children.
Контактная информация: Ставицкая Наталия Васильевна, канд. мед. наук, ассистент кафедры фтизиопульмонологии Кубанского государственного медицинского университета, 350063, г. Краснодар, ул. Айвазовского, 95, тел. 8 (861) 233-66-61
Материал поступил в редакцию 20.05.2010
