CC BY
78
УДК 616-022.7:579.887-085.33
выявление МУТАЦИЙ устойчивости К МАКРОЛИдАМ в гене 23S рРНК Mycoplasma pneumoniae С ПОМОщью ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
в режиме реального времени
И.А. Эйдельштейн1, М.В. Эйдельштейн1, А.В. Романов1, С.А. Рачина1, С.Б. Яцышина2, И.В. Раковская3, Р.С. Козлов1
1 НИИ антимикробной химиотерапии Смоленской государственной медицинской академии (214019, г. Смоленск, ул. Кирова, 46а), 2 Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии (111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, 3a), 3 НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАМН (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 18)
Ключевые слова: микоплазмы, молекулярная диагностика, антибиотикорезистентность.
DETECTION OF MACROLIDE-REsIsTANCE MUTATIONs IN 23S rRNA GENE OF Mycoplasma pneumoniae UsING A NOvEL REAL-TIME PCR AssAY
I.A. Edelstein1, M.V. Edelstein1, A.V. Romanov1, S.A. Ratchina1, S.B. Yatsyshina2, I.V. Rakovskaja3, R.S. Kozlov1
1 Institute of Antimicrobial Chemotherapy Smolensk State Medical Academy (46a Kirova St. Smolensk 214019 Russian Federation),
2 Central Research Institute for Epidemiology (3a Novogyreevskaja St. Moscow 111123 Russian Federation), 3 Research Institute
of Epidemiology and Microbiology named under N.F. Gamaleya (18 Gamaleya St. Moscow 123098 Russian Federation) Background. Mycoplasma pneumoniae is a widespread pathogen of the respiratory tract diseases. In recent years, the data of foreign publications indicate the appearance and spread of resistant M. pneumoniae to macrolide antibiotics, which is associated with mutations in the 23S pRNA gene, mainly in positions 2063, 2064 and 2617.
Methods. Studied 146 clinical samples obtained in 2006-2013. of patients with infections of the lower respiratory tract. Primary screening was done for the presence of DNA material M. pneumonia based on polymerase chain reaction (PCR) in real time. Results. The possibility of detecting and differentiation of various mutations in positions 2063, 2064 and 2617 in the 23S pRNA gene format single sample multiplex PCR in real time with subsequent melting curve analysis of fluorescently-labeled probes. In the study of clinical samples in all cases been detected 23S pDNA sequences of M. pneumoniae "wild-type" typical for phenotype of sensitivity to macrolides.
Conclusions. Detection of single nucleotide corresponding replacements allows effective predict macrolide resistance phenotype, but used for this purpose methods are laborious and expensive. At present data on the prevalence and mechanisms of macrolide resistance in strains of M. pneumoniae in Russia are absent. The present study focuses on the development and validation of a new method for the determination of mutations associated with resistance to mac-rolides in M. pneumoniae, and also its use for the analysis of clinical samples in patients with lower respiratory tract infections. Keywords: mycoplasma, molecular diagnostics, antibiotic resistance.
Pacific Medical Journal, 2015, No. 1, p. 63-66.
Mycoplasma pneumoniae вызывает заболевания респираторного тракта, и, по мнению ряда исследователей, может длительно персистировать в клетках эпителия, лимфоглоточном кольце, обусловливать более тяжелое течение неспецифических заболеваний легких и служить причиной обострения хронической бронхо-легочной патологии [15]. M. pneumoniae также может
Эйдельштейн Инна Александровна - канд. биол. наук, зав. лабораторией молекулярной диагностики НИИ антимикробной химиотерапии СмолГМА; e-mail: [email protected]
являться этиологическим агентом широкого спектра внелегочной патологии и постинфекционных осложнений [7].
Макролиды - антибиотики выбора для лечения заболеваний, вызванных M. pneumoniae. Однако публикации последних лет свидетельствуют о нарастании вторичной устойчивости к препаратам данной группы у ряда штаммов этого возбудителя [8]. В отдельных публикациях описаны случаи рецидива ми-коплазменной пневмонии или длительного ее течения на фоне терапии макролидными антибиотиками, известны также случаи формирования устойчивости к азитромицину in vivo, подтвержденные результатами определения чувствительности последовательно выделенных изолятов M. pneumoniae [6, 11]. Более того, в ряде стран Европы, Азии и Северной Америки зарегистрированы локальные вспышки респираторных инфекций, вызванных устойчивыми к макролидам штаммами M. pneumoniae, а в Китайской Народной Республике и Японии, по данным многоцентровых эпидемиологических исследований, распространенность устойчивости достигает 20 и 60 %, соответственно [9].
В настоящее время проблема формирования ан-тибиотикорезистентности у микоплазм изучена достаточно хорошо. Продемонстрирована возможность селекции мутаций устойчивости к эритромицину, азитромицину и джозамицину у клинических штаммов при их последовательном культивировании на среде с возрастающей концентрацией препаратов, а также хорошо описаны молекулярные механизмы макролидоустойчивости M. pneumoniae у клинических изолятов [3]. Мутации в генах, приводящие к модификации мишени связывания с антибиотиком, описаны для различных групп препаратов. Одним из механизмов формирования резистентности к макролидным антибиотикам является наличие мутаций в генах 23S рРНК и рибосомальных белков, приводящих к кон-формационным изменениям пептидилтрансферазного центра и, соответственно, к снижению аффинности препаратов.
В Российской Федерации до настоящего времени исследования чувствительности M. pneumoniae к антибактериальным препаратам с использованием
международных методов и интерпретационных стандартов [4] не проводились. Отсутствуют также данные оценки распространенности мутаций устойчивости к макролидам среди клинических изолятов M. pneumoniae, что в значительной степени связано с недостатком коммерческих молекулярно-диагностических систем для выявления значимых мутаций, а также c трудоемкостью классических методов амплификации и секвенирования генов 23S рРНК [5].
В последние годы интенсивно разрабатываются молекулярно-генетические методы для выявления молекулярных основ развития резистентности у микроорганизмов [12]. Эти методы, основанные на выявлении специфических последовательностей ДНК возбудителя, имеют ряд преимуществ перед классической культуральной и иммунологической диагностикой. Обладая высокой чувствительностью и специфичностью, они позволяют добиться большей скорости и производительности исследования при отсутствии необходимости сохранения жизнеспособных клеток возбудителя в изучаемом материале, а исследование возможности формирования устойчивости возбудителя к антимикробным препаратам исключает этап длительного культивирования микроорганизма на искусственных питательных средах.
Для выявления мутаций, приводящих к устойчивости M. pneumoniae к макролидным антибиотикам, разработан метод на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени, который может быть использован как скрининговый подход для мониторинга возможных механизмов резистентности.
Материал и методы. В исследование были включены 146 клинических образцов: 111 соскобов с задней стенки глотки и 35 проб мокроты, полученных в 2006-2013 гг. от пациентов с инфекциями нижних дыхательных путей (бронхит, пневмония). Материал поступил из лаборатории микоплазм и L-форм бактерий НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, лаборатории референс-центра по мониторингу за возбудителями инфекций верхних и нижних дыхательных путей ЦНИИЭ Роспотреб-надзора и лаборатории молекулярной диагностики НИИ антимикробной химиотерапии Смоленской
Олигонуклеотидные праймеры и зонды для выя
государственной медицинской академии. 36 из 146 образцов были получены от пациентов во время вспышки микоплазменной пневмонии на территории Смоленской области в 2013 г. [1]. В лабораториях-участниках проекта был осуществлен первичный скрининг клинического материала на наличие ДНК M. pneumoniae с применением коммерческого набора реагентов «АмплиСенс Mycoplasma pneumoniae/ Chlamydophila pneumoniae-FL» (ЦНИИЭ, Россия) на основе технологии ПЦР в режиме реального времени. Выделение ДНК проводили с помощью набора «Ри-бо-Преп» (ЦНИИЭ, Россия). В качестве контролей использовали образцы ДНК контрольного штамма M. pneumoniae FH ATCC15531 (последовательность гена 23S рРНК дикого типа), M. pneumoniae P05/132 (23S рДНК A2064G), M. pneumoniae T79 (23S рДНК A2063G), M. pneumoniae B 6329 (23S рДНК C2617G) [4, 12, 14].
Наличие мутаций в гене 23S рРНК определяли методом ПЦР в реальном времени с эффектом гашения флуоресценции зонда праймером. Разработанный метод (табл.) обеспечивал возможность выявления любых нуклеотидных замен в позициях 2063, 2064 и 2617 в гене 23S рРНК M. pneumoniae (2057, 2058 и 2611 согласно нумерации для Escherichia coli) с помощью анализа кривых плавления зондов непосредственно после проведения амплификации в мультиплексном формате (табл.). Дизайн праймеров и зондов осуществляли с помощью программного пакета CLC Main Workbench v. 5.7.1 (CLC Bio, Qiagen, Дания) с использованием встроенных алгоритмов BLAST и Primer-BLAST для проверки специфичности праймеров (www.ncbi.nlm. nih.gov/blast/). Расчет теоретической температуры плавления зондов для полностью комплементарных последовательностей 23S рДНК и ее изменения при наличии замен A2063G/T, A2064G/C и C2617G проводили с помощью программы MeltCalc (www.meltcalc.com).
Состав смеси для мультиплексной ПЦР общим объемом 25 мкл включал: олигонуклеотидные праймеры и зонды (ЗАО «Синтол», Россия) в концентрации, указанной в табл.: 0,2 мМ дНТФ, 2 мМ MgCl2, 2,5 ед. ДНК полимеразы SNP Detect, 1х ПЦР буфер SNP Detect (Evrogen, Россия) и 3 мкл образца ДНК.
Таблица
ения и характеристики мутаций в 23S рРНК.
Праймер/зонд Последовательность, 3' -5'* Концентрация в ПЦР, мкМ
Mpn2617-Rv AAGCAACACTCTTCAATCTTCC(T-BHQ1)A AC 0,2
Mpn2617-Fw CGTCGTGAGACAGGTTGG 0,8
Mpn2617-Pb GGTTGGTCCCTATCTATTGTG-(R6G) 0,2
Mpn2063-Rv2 TGTCCTGATCAATATTAATCTACAG(T-BHQ1)AAAG 0,2
Mpn2063-Fw2 GAAGACACCCGTTAGGCGCAAC CAACGGGAC 0,8
Mpn2063-Pb2 GGAAAGACC-(FAM) 0,2
* FAM - карбоксифлуоресцеин, R6G - 6-карбоксиродамин, BHQ1(black hole quencher 1) - темновой гаситель флуоресценции-1.
dF/dT
dF/dT
-0,5
2063G 2064G WT (2063A, 2064A)
WT (2617C)
45
50
55 60
Температура, °С
65
70
75
1,50 1,25 1,00 0,75 . 0,50 0,25 0
б
1-1-Г
55 60 65
Температура, °С
Т
75
Рис. Пример одновременного выявления различных мутаций устойчивости к макролидам в гене 23S рРНК M. pneumoniae с помощью оценки кривых плавления флуоресцетно меченых зондов (а - FAM, б - R6G) после мультиплексной ПЦР в режиме реального
времени. WT - wild type (дикий тип).
Амплификацию и анализ кривых плавления зондов выполняли с помощью системы Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия) согласно следующему протоколу: начальная инкубация 15 мин. при 95 °С; затем 55 циклов по 20 с денатурации при 95 °С и 15 с отжига-элонгации при 55 °С с детекцией флуоресценции на каналах FAM и JOE (R6G); анализ кривых плавления с начальной инкубацией 2 мин. при 45 °С и последующим повышением температуры на 1 °С каждые 10 с до 85 °С с детекцией флуоресценции на каналах FAM и JOE (R6G). Идентификацию последовательностей «дикого типа» и мутаций в 23S рРНК проводили в соответствии с температурой плавления зондов.
Результаты исследования. Использованная в данном исследовании технология ПЦР обеспечивает возможность выявления различных (как известных, так и неизвестных) мутаций в области связывания олигонуклеотидных зондов и основана на эффекте переноса энергии флюоресценции между зондом и одним из праймеров [2]. Для детекции мутаций в двух целевых участках гена 23S рРНК M. pneumoniae, включающих позиции 2063-2064 и 2617, разработаны, соотвественно, два олигонуклеотидных зонда, содержащих флуорофоры (FAM и R6G) на З'-конце и полностью комплементарные последовательностям 23S рДНК дикого типа, и две пары праймеров, в каждой из которых один праймер, формирующий цепь ДНК, комплементарную зонду, расположен непосредственно перед областью связывания зонда и содержит внутренний нефлуоресцирующий (темновой) гаситель флуоресценции. Таким образом, связывание зондов с цепями ДНК, образованными в результате элонгации праймеров, приводит к сближению флу-орофоров и гасителей на расстояние, достаточное для эффективного гашения флуоресценции за счет резонансного переноса энергии флуоресценции или образования стабильных комплексов между флуо-рофором и гасителем (статическое или контактное
гашение). В соответствии с описанным выше дизайном, мутации в участках 23S рРНК могут быть выявлены с помощью постамплификационного анализа кривых плавления зондов: образцы, содержащие однонуклеотидные замены в области связывания зонда, характеризуются сниженной аффинностью и, соответственно, меньшей температурой плавления. Контрольные образцы ДНК M. pneumoniae, несущие мутации A2063G и A2064G были четко различимы между собой и отличались от образцов «дикого типа» по температуре плавления зонда Mpn2063-Pb2, соответственно на 9,5 и 7,3 °С (рис., а). Разница в температуре плавления зонда Mpn2617-Pb для мутантного образца C2617G по сравнению с образцом дикого типа составила 8,8 °С (рис., б).
Специфичность разработанного метода были оценены путем исследования контрольных образцов, содержащих ДНК Chlamydophila pneumoniae, M. pneumoniae, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum, a также 20 образцов ДНК человека, не содержащих ДНК M. pneumoniae. Все образцы образцы, выбранные для контроля специфичности, были предварительно охарактеризованы с использованием коммерческих наборов реагентов ЦНИИЭ (Россия). Положительные результаты амплификации получены только для образцов ДНК M. pneumoniae (специфичность 100 %). Аналитическая чувствительность метода составила не менее 15 геномоэквивалентов M. pneumoniae FH ATCC 15531 на реакцию.
Разработанный метод был использован для анализа 146 клинических образцов, положительных на наличие ДНК M. pneumoniae по результатам первичного скрининга с использованием коммерческого набора реагентов «АмплиСенс Mycoplasma pneumoniae/Chlamydophila pneumoniae--FL». Специфические последовательности 23S рРНК были обнаружены в 140 образцах (относительная чувствительность 95,8 %). Скрининг не выявил
а
мутаций, ассоциированных с устойчивостью к макролидам, ни в одном случае. Все образцы имели профиль плавления зондов Mpn2063-Pb2 и Mpn2617-Pb, идентичный «дикому типу».
Обсуждение полученных данных. Таким образом, разработан быстрый и чувствительный метод определения мутаций устойчивости к макролидам в гене 23S рРНК M. pneumoniae. По сравнению с описанными в литературе молекулярно-генетическими методами, такими как классическое секвенирование по Сэнгеру [5], пиросеквенирование [13] или анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов [10], он обладает классическими преимуществами, характерными для ПЦР в режиме реального времени: является одноэтапным и не требует манипуляций с продуктами амплификации, что упрощает анализ и снижает риск контаминации. Так же, как и метод FRET ПЦР в режиме реального времени, описанный O. Peuchant et al. [12], предложенный нами подход обеспечивает возможность одновременного выявления различных мутаций в позициях 2063, 2064 и 2617 гена 23S рРНК и, кроме того, дополнительно позволяет дифференцировать замены A2063G и A2064G.
В ходе молекулярно-генетического скрининга коллекции респираторных образцов, содержавших ДНК M. pneumoniae, не были выявлены значимые мутации, связанные со снижением чувствительности к макролидным препаратам. Разработанный подход может быть использован для быстрого выявления мутаций и прогнозирования возможной устойчивости M. pneumoniae к макролидным антибиотикам. Литература
1. Бобылев А.А., Рачина С.А., Эйдельштейн И.А. [и др.] Описание вспышки инфекции, вызванной Mycoplasma pneumoniae, в Смоленской области // Пульмонология. 2013. Т. 5. С. 97-100.
2. Эйдельштейн И.И., Эйдельштейн М.В., Романов А.В. [и др.] Оценка распространенности «классических» механизмов устойчивости к фторхинолонам у Chlamydia trachomatis, связанных с мутациями в генах топоизомераз / / Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2014. Т. 16, № 4. С. 301-307.
3. Averbuch D., Hidalgo-Grass C., Moses A. [et al.] Macrolide resistance in Mycoplasma pneumoniae, Israel, 2010 // Emerging Infectious Diseases (Centers for Disease Control and Prevention). 2011. Vol. 17, No. 6. P. 1079-1082.
4. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2011. Methods for antimicrobial susceptibility testing of human mycoplasmas. Approved Guideline M43-A. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA.
5. Dumke R., von Baum H., Luck P. [et al.] Occurrence of macrolide-resistant Mycoplasma pneumoniae strains in Germany // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2010. Vol. 16, No. 6. P. 613-616.
6. Dumke R., Stolz S., Jacobs E. [et al.] Molecular characterization of macrolide resistance of a Mycoplasma pneumoniae strain that developed during therapy of a patient with pneumonia // Int. J. Infect. Dis. 2014. Vol. 29. P. 197-199.
7. Godron A., Pereyre S., Monet C. [et al.] Hemolytic uremic syndrome complicating Mycoplasma pneumoniae infection // Pediatr. Nephrol. 2013. Vol. 28, No. 10. P. 2057-2060.
8. Hantz S., Garnier F., Peuchant O. [et al.] Multilocus variable-number tandem-repeat analysis-confirmed emergence of a mac-rolide resistance-associated mutation in Mycoplasma pneumoniae
during macrolide therapy for interstitial pneumonia in an immunocompromised child // Journal of Clinical Microbiology. 2012. Vol. 50, No. 10. P. 3402-3405.
9. Li X., Atkinson T., Hagood J. [et al.] Emerging macrolide resistance in Mycoplasma pneumoniae in children: detection and characterization of resistant isolates // Pediatric Infectious Disease Journal. 2009. Vol. 28, No. 8. P. 693-696.
10. Mayumi M., Mitsuo N., Norio O. [et al.] Characterization and molecular analysis of macrolide-resistant Mycoplasma pneumo-niae clinical isolates obtained in Japan // Antimicrob. Agents Chemother. 2004. Vol. 48, No. 12. P. 4624-4630.
11. Mulholland S., Gavranich J., Gillies M., Chang A.B. Antibiotics for community-acquired lower respiratory tract infections secondary to Mycoplasma pneumoniae in children // Cochrane Database Syst. Rev. 2012. Vol. 12, No. 9. DOI: 10.1002/14651858. CD004875.pub4.
12. Peuchant O., Menard A., Renaudin H. [et al.] Increased mac-rolide resistance of Mycoplasma pneumoniae in France directly detected in clinical specimens by real-time PCR and melting curve analysis // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2009. Vol. 64, No. 1. P. 52-58.
13. Spuesens E., Hoogenboezem T., Sluijter M. [et al.] Macrolide resistance determination and molecular typing of Mycoplasma pneumoniae by pyrosequencing // J. Microbiol. Methods. 2010. Vol. 82, No. 3 P. 214-222
14. Spuesens E., Meijer A., Bierschenk D. [et al.] Macrolide resistance determination and molecular typing of Mycoplasma pneumoniae in respiratory specimens collected between 1997 and 2008 in The Netherlands // Journal of Clinical Microbiology. 2012. Vol. 50, No. 6. P. 1999-2004.
15. Waites K., Talkington D. Mycoplasma pneumoniae and its role as a human pathogen // Clin. Microbiol. Rev. 2004. Vol. 17, No. 4. P. 697-728.
Поступила в редакцию 13.01.2015.
Выявление мутаций устойчивости к макролидам в гене 23S рРНК Mycoplasma pneumoniae с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени И.А. Эйдельштейн1, М.В. Эйдельштейн1, А.В. Романов1, С.А. Рачина1, С.Б. Яцышина2, И.В. Раковская3, Р.С. Козлов1 1 Научно-исследовательский институт антимикробной химиотерапии Смоленской государственной медицинской академии (214019, г. Смоленск, ул. Кирова, 46а), 2 Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии (111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, 3a), 3 Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАМН (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 18) Резюме. В последнее время данные зарубежных публикаций свидетельствуют о появлении и распространении устойчивости Mycoplasma pneumoniae к макролидным антибиотикам, которая связана с мутациями в гене 23S рРНК, главным образом, в позициях 2063, 2064 и 2617. Выявление соответствующих однонуклеотидных замен позволяет эффективно предсказать фенотип устойчивости к макролидам, однако, используемые с этой целью методы являются трудоемкими и дорогостоящими. Исследование посвящено разработке и валидации нового метода определения мутаций, ассоциированных с устойчивостью к макролидам у M. pneumoniae, а также его использованию для анализа клинических образцов. Показана возможность выявления и дифференциации различных мутаций в позициях 2063, 2064 и 2617 гена 23S рРНК в формате однопробирочной мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с последующим анализом кривых плавления флуоресцентно-меченых зондов. При исследовании клинических образцов во всех случаях обнаружены последовательности 23S рДНК M. pneumoniae «дикого типа», характерные для фенотипа чувствительности к макролидам. Ключевые слова: микоплазмы, молекулярная диагностика, антибиотикорезистентность.
