CC BY
17
И. А. Эйдельштейн и соавт. Оценка механизмов устойчивости к фторхинолонам у Chlamydia trachomatis
Оценка распространенности «классических» механизмов устойчивости к фторхинолонам у Chlamydia trachomatis, связанных с мутациями в генах топоизомераз
И.А. Эйдельштейн1, М.В. Эйдельштейн1, Е.В. Шипицына2, Т.А. Хуснутдинова2, А.М. Савичева2, Р.С. Козлов1
1 НИИ антимикробной химиотерапии ГБОУ ВПО СГМА Минздрава России, Смоленск, Россия
2 ФГБУ «НИИ акушерства и гинекологии имени Д. О. Отта» СЗО РАМН, Санкт-Петербург, Россия
До настоящего времени мутационная устойчивость C. trachomatis к фторхинолонам (ФХ), которые используются, наряду с макролидами и тетрациклинами, для лечения хламидийных инфекций, не была описана в клинической практике. Возможность селекции мутаций резистентности к ФХ (преимущественно в участке QRDR gyrA) была продемонстрирована исключительно в экспериментах in vitro. В России ФХ широко используются и доступны в аптечной сети без рецепта, что потенциально оказывает селективное давление на развитие устойчивости к ним у различных видов возбудителей, включая возбудителей инфекций, передающихся половым путем. С помощью ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) 1572 клинических образца, полученных от пациентов с инфекциями урогенитального тракта, содержащих ДНК C. trachomatis, а также 200 отрицательных клинических образцов (контроль специфичности)
были исследованы на наличие любых мутаций в QRDR участках генов-мишеней: gyrA и parC C. trachomatis, способных вызывать снижение чувствительности к ФХ. В единственном образце анализ с использованием ПЦР-РВ и последующего секвенирования выявил наличие однонук-леотидной транзиции A/G в области связывания ПЦР-зонда, которая соответствует аминокислотной замене Ser-83/Gly в QRDR GyrA. Таким образом, впервые выявлено наличие типичной мутации устойчивости к ФХ в QRDR gyrA в клиническом штамме C. trachomatis. Проведенное исследование показывает, что «классические» механизмы резистентности к ФХ встречаются крайне редко в популяции клинических штаммов C. trachomatis.
Ключевые слова: Chlamydia trachomatis, фторхинолоны, топоизомеразы, QRDR, GyrA, мутации.
Evaluation of Prevalence of Classical Fluoroquinolone Resistance Mechanisms in Chlamydia trachomatis Due to Mutations in the Topoisomerase Genes
I.A. Edelstein1, M.V. Edelstein1, E.V. Shipitsyna2, T.A. Khusnutdinova2, A.M. Savicheva2, R.S. Kozlov1
1 Institute of Antimicrobial Chemotherapy, Smolensk, Russia
2 D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, St. Petersburg, Russia
Until now, mutational resistance to fluoroquinolones (FQs) that represent a second-line treatment option for chlamydial infections after macrolides and tetrxacyclines
Контактный адрес:
Инна Александровна Эйдельштейн
Эл. почта: [email protected]
has not been described in clinical isolates of C. trachomatis. However, a possibility of selection of FQ resistance via mutations in the primary target gene, gyrA, has been demonstrated in vitro with C. trachomatis strains. In Russia, FQs are used widely and available over-the-counter thus potentially exerting significant selective pressure
И. А. Эйдельштейн и соавт. Оценка механизмов устойчивости к фторхинолонам у Chlamydia trachomatis
for resistance development in STI pathogens. This study aimed to assess the presence of any FQ resistance mutations in quinolone resistance determining regions (QRDRs) of the C. trachomatis gyrA and parC genes directly in clinical samples using a newly developed realtime PCR assay. A total of 1572 C. trachomatis-positive clinical samples, obtained from patients with various urogenital tract infections, and 200 negative samples (used for control of assay specificity) were screened. A single sample revealed the presence of an A/G nucleotide transition in the PCR probe binding site corresponding to the
Ser-83/Gly amino acid substitution of in the GyrA QRDR which was confirmed by re-amplification and direct DNA sequencing. We, therefore, report for the first time the identification of a typical FQ resistance mutation in the C. trachomatis gyrA gene from a clinical sample. Results of our study, however, demonstrate that the «classical» resistance mechanisms to FQ are rare in the studied population of C. trachomatis.
Key words: fluoroquinolones, QRDR, Chlamydia trachomatis, mutation, topoisomerase, GyrA.
Введение
Облигатный внутриклеточный микроорганизм Chlamydia trachomatis в настоящее время рассматривается как самый распространенный бактериальный возбудитель заболеваний, передающихся половым путем.
Внутриклеточный цикл развития хламидий предполагает использование для терапии антибиотиков, способных накапливаться в клетках и препятствовать размножению возбудителя. Данными свойствами обладают тетрациклины, макролиды, азалиды и фторхинолоны (ФХ).
Азалиды (азитромицин) и тетрациклины (док-сициклин) являются антибиотиками выбора при лечении заболеваний, вызванных C. trachomatis. Известно, что фторхинолоны также демонстрируют высокую антихламидийную активность in vitro и рассматриваются как альтернативные препараты для терапии хламидийной инфекции, преимущественно в сочетании с гонококковой. ФХ являются одними из наиболее широко используемых в России антимикробных препаратов (40% от общего количества антибиотиков), особенно в урологической практике. Широкое применение ФХ, тем самым, создает условия селективного давления на патогенные микроорганизмы и может способствовать отбору штаммов с приобретенной устойчивостью.
До настоящего времени проблема развития антибиотикорезистентности у хламидий изучена недостаточно хорошо, исключая случаи описательного характера и публикации, указывающие на возможное отсутствие эффекта терапии у пациентов с хламидийной инфекцией [1]. В отдельных работах эффект множественной резистентности выделенных штаммов связывают с фенотипической (гетеро-типической) резистентностью, но не с генетической (мутационной), поскольку молекулярные мишени для разных групп антимикробных препаратов различны. До настоящего времени, однако, случаи выделения клинических изолятов C. trachomatis, проявляющих стабильный фенотип резистентности
вследствие наличия известных генетических механизмов, описаны не были.
Вместе с тем, была продемонстрирована возможность in vitro селекции мутаций устойчивости к моксифлоксацину и ципрофлоксацину у штаммов C. trachomatis LGV2 при их последовательном культивировании на среде с возрастающей концентрацией антибиотика [2].
В России изучению проблемы антибиотикорези-стентности C. trachomatis посвящен ряд работ, включая исследования in vitro чувствительности к ФХ клинических изолятов (выделенных у пациентов при неэффективной антибактериальной терапии), с использованием культурального метода [3-6]. В этих работах также предпринята попытка анализа молекулярно-генетических механизмов устойчивости изолятов со сниженной чувствительностью к ФХ путем прямого секвенирования генов мишеней ФХ (gyrA и parC). Однако в ходе данного анализа были выявлены лишь мутации, приводящие к аминокислотным заменам вне участков связывания ФХ (quinolone resistance determining regions, QRDRs), что позволяет сделать вывод о возможном наличии у хламидий альтернативных механизмов устойчивости к данным антибиотикам [3, 4, 7].
Выделение C. trachomatis в культуре клеток является трудоемким и длительным процессом, а изучение антибиотикочувствительности осложняется отсутствием стандартизованной методики и критериев интерпретации данных, а также понимания взаимосвязи между результатами, полученными in vitro, и клиническим исходом терапии [8, 9, 10]. Многочисленные исследования показывают, что данные оценки уровня устойчивости к антихла-мидийным препаратам, полученные при использовании различных вариантов методов культивирования, могут существенно отличаться [11].
В последние годы интенсивно разрабатываются молекулярные методы для выявления генетических детерминант резистентности у микроорганизмов. Мутации в генах, приводящие к модификации
И. А. Эйдельштейн и соавт. Оценка механизмов устойчивости к фторхинолонам у Chlamydia trachomatis
мишени связывания с антибиотиком, описаны для различных групп препаратов. Основой формирования резистентности к ФХ у грамотрицательных бактерий являются аминокислотные замены в QRDR участках каталитических субъединиц ДНК-гиразы (GyrA, участок между аминокислотными остатками 67 и 106, обычно в позициях 83 и 87) и топои-зомеразы IV (ParC, позиции 80 и 84), приводящие к снижению их аффинности к хинолонам.
Для определения мутаций устойчивости к фтор-хинолонам в QRDR генов-мишеней (gyrA и parC) у C. trachomatis нами была разработана методика на основе ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ), которая может быть использована как скрининго-вый подход для мониторинга возможных механизмов резистентности к фторхинолонам.
Целью данного исследования явилось выявление мутаций устойчивости к фторхинолонам в QRDR генов-мишеней (gyrA и parC) C. trachomatis.
Материал и методы
Клинические образцы. В исследование было включено 1572 клинических образца (соскобы из цервикального канала женщин и уретры мужчин), полученных в 2009-2011 гг., от пациентов с инфекциями урогенитального тракта различной локализации. Материал был получен из лаборатории микробиологии ФГБУ «НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта» СЗО РАМН (Санкт-Петербург) и лаборатории НИИ антимикробной химиотерапии ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Минздрава России (Смоленск), где осуществлялся предварительный скрининг образцов на наличие ДНК C. trachomatis с использованием коммерческой тест-системы «АмплиСенс® Chlamydia trachomatis-FL» (ООО
«ИнтерЛабСервис», Россия) на основе технологии ПЦР-РВ. Выделение ДНК проводили сорбционным методом с применением набора «ДНК-сорб-АМ» (ООО «ИнтерЛабСервис», Россия). Очищенную ДНК хранили при -70 °С до момента анализа.
ПЦР-РВ для анализа мутаций в QRDR gyrA и parC. Наличие мутаций в QRDR генов gyrA и parC определяли с помощью метода ПЦР-РВ с эффектом гашения флуоресценции зонда прай-мером [12]. Дизайн флуоресцентномеченных зондов (таблица) обеспечивал возможность выявления последовательностей ДНК C. trachomatis «дикого типа» и любых мутаций в участках, соответствующих кодонам 81-87 gyrA и 80-85 parC (нумерация Escherichia coli), путем анализа кривых плавления зондов непосредственно после проведения амплификации.
Состав ПЦР смеси общим объемом 25 мкл включал: олигонуклеотидные праймеры и зонды (ЗАО «Синтол», Россия) в концентрации, указанной в таблице; 0,2 мМ дНТФ; 2 мМ MgCl2; 2,5 ед. TaqF ДНК-полимеразы;1х ПЦР буфер (ООО «ИнтерЛабСервис», Россия) и 3 мкл образца ДНК.
Амплификацию и анализ кривых плавления зондов проводили с помощью системы Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия) согласно следующему протоколу: начальная инкубация 15 мин. при 95 °C; денатурация 1 мин. при 95 °C; затем 55 циклов денатурации 15 с при 95 °C и 15 с отжига-элонгации при 58 °C с детекцией флуоресценции на каналах FAM и JOE (R6G); анализ кривых плавления с начальной инкубацией в течение 3 мин. при 45 °C и последующим повышением температуры на 1 °C каждые 10 с до 85 °C с детекцией флуоресценции на каналах FAM и JOE (R6G).
Олигонуклеотидные праймеры и зонды для выявления и характеристики мутаций в QRDR генов gyrA и parC
Праймер / зонд
Последовательность, 3'-5'*
Концентрация, мкМ
CTR_gyrA_Rpm CTR_gyrA_Fpm CTR_gyrA_Pb
CTR_parC_Rpm CTR_parC_Fpm CTR_parC_Pb
CTR_gyrA_SeqF CTR_gyrA_SeqR
ПЦР-РВ
ATCCTGTGCCAGCCTTACTAAAGT ATACTTCCGGAGATTA (T-BHQ1) CACCC AAAGTAGGATAAATGACACTTTCTCC-R6G
TTTATTTGCCAAAACGACAAGA GCTGCACCTGCATGG (T-BHQ1) GAT AGCTTCCACGATAGGCGC-FAM
ПЦР и секвенирование
ATTAAAACCTTCTCAGCGACG GTTTCATCGTAGTTAGGGACCA
0,2 0,8 0,2 0,2 0,8 0,2
0,2 0,2
Примечание. * FAM — карбоксифлуоресцеин, R6G — 6-карбоксиродамин, BHQ1 — темновой гаситель флуоресценции 1 (black hole quencher 1)
И. А. Эйдельштейн и соавт. Оценка механизмов устойчивости к фторхинолонам у Chlamydia trachomatis
Идентификацию последовательностей «дикого типа» и мутаций в QRDR gyrA и parC проводили в соответствии с температурой плавления зондов. В качестве контрольной ДНК использовали препарат, выделенный из C. trachomatis (серовар L2) с последовательностями QRDR gyrA и parC «дикого типа».
Секвенирование QRDR gyrA C. trachomatis.
При выявлении с помощью ПЦР-РВ отличной от контрольного образца температуры плавления зонда, свидетельствующей о наличии мутаций в области кодонов 81-87 gyrA, внутренний фрагмент gyrA длиной 336 п. н., включающий всю область QRDR, исследовали путем дополнительной амплификации и секвенирования с внешними праймерами (см. таблицу). Секвенирование проводили с помощью наборов BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit и генетического анализатора ABI Prism® 310 (Applied Biosystems, США).
Результаты исследования и обсуждение
Дизайн ПЦР-РВ для детекции мутаций в QRDR gyrA и parC C. trachomatis. Использованная в данном исследовании технология ПЦР-РВ обеспечивает возможность выявления различных (как известных, так и неизвестных) мутаций в области связывания олигонуклеотидных зондов и основана на эффекте переноса энергии флюоресценции между зондом и одним из праймеров [12]. При этом для амплификации каждого из целевых участков нуклеотидных последовательностей QRDR gyrA и parC C. trachomatis были разработаны соответствующие пары праймеров, в которых один из олигонуклеотидов служит для образования цепи ДНК, комплементарной зонду, и содержит внутренний нефлуоресцирующий (темновой) гаситель флуоресценции (BHQ), а для детекции целевых нуклеотидных последовательностей, находящихся между участками связывания праймеров, использованы 3'-флуоресцентномеченные зонды, участки связывания которых совпадают с областям QRDR и находятся на расстоянии нескольких нуклео-тидов от 3'-концов соответствующих праймеров, несущих гасители флуоресценции. Таким образом, связывание зондов с цепями ДНК, образованными в результате элонгации праймеров, приводит к сближению флуорофора и гасителя на расстояние, достаточное для эффективного гашения флуоресценции за счет резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) или образования стабильных комплексов между флуорофором и гасителем (статическое или контактное гашение). В соответствии с описанным выше дизайном, мутации в участках QRDR gyrA и parC могут быть выявлены
с помощью постамплификационного анализа кривых плавления зондов: образцы, несущие мутации в области связывания зонда, характеризуются сниженной аффинностью и соответственно меньшей температурой плавления (Tm) зонда.
Скрининг клинических образцов на наличие мутаций в QRDR gyrA и parC. В исследование было включено 1572 клинических образца, положительных на наличие ДНК C. trachomatis по результатам первичного скрининга с использованием коммерческой тест-системы «АмплиСенс® Chlamydia trachomatis-FL» и 200 отрицательных образцов (контроль специфичности). Все образцы были проанализированы на наличие мутаций в QRDR gyrA и parC с использованием описанной выше технологии. Пример анализа мутаций в QRDR gyrA и parC у C. trachomatis с помощью ПЦР-РВ и анализа кривых плавления зондов представлен на рис. 1. Специфические последовательности gyrA и parC у C. trachomatis были выявлены соответственно в 1566 и 1564 положительных образцах (относительная чувствительность 99,6 и 99,5%), но ни в одном из отрицательных образцов (специфичность 100%). При этом следует отметить высокую чувствительность выявления хромосомных локусов gyrA и parC, несмотря на их менее высокую копийность по сравнению с криптической плазмидой C. trachomatis, которая является мишенью коммерческих диагностических систем [13]. Скрининг не выявил значимых мутаций в QRDR parC ни в одном образце. Все образцы имели профиль плавления зонда CTR_parC_Pb, идентичный «дикому типу». Факт отсутствия мутаций в parC клинических штаммов C. trachomatis является в достаточной степени ожидаемым, поскольку топоизомераза IV является вторичной мишенью ФХ у всех грамотри-цательных бактерий, и мутации в области QRDR parC встречаются реже по сравнению с QRDR gyrA у различных видов данной группы [14].
Во всех образцах, за исключением одного, были также обнаружены последовательности QRDR gyrA «дикого типа» в соответствии с профилем плавления зонда CTR_gyrA_Pb. Единственный образец продемонстрировал характерное снижение температуры плавления зонда (ДTm=3,7oС), свидетельствующее о наличии мутации в QRDR gyrA (см. рис. 1).
Последующий анализ с использованием секве-нирования подтвердил наличие однонуклеотидной транзиции A/G в области связывания зонда, которая соответствует аминокислотной замене Ser-83/ Gly в QRDR GyrA (рис. 2). Известно, что данная мутация приводит к нарушению связывания ФХ с ДНК-гиразой и, тем самым, к формированию
И. А. Эйдельштейн и соавт. Оценка механизмов устойчивости к фторхинолонам у Chlamydia trachomatis
0,5 0
46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78
deg.
0 -0,2 -0,4
-0,8
46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82
deg.
Рис. 1. Пример анализа QRDR gyrA иparC у C. trachomatis с помощью анализа кривых плавления зондов после проведения ПЦР-РВ.
устойчивости к препаратам данной группы у различных видов грамотрицательных бактерий. В частности, замены аминокислотного остатка в позиции 83 GyrA, включая Gly-83, широко распространены у ФХ-резистентных штаммов энтеробактерий (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp. и др.). Во многих исследованиях показана четкая корреляция между наличием замен в позициях 83 и 87 GyrA и повышенным уровнем устойчивости к ФХ [15, 16]. Более того, в исследовании S. Dessus-Babus, et al. [14] культивирование штаммов C. trachomatis in vitro в присутствии субингиби-
рующих концентраций офлоксацина и ципрофлок-сацина приводило к селекции мутантов с аминокислотными заменами именно в позиции 83 GyrA, которые обусловливали повышение минимальных подавляющих концентраций ФХ в 256 и более раз. Таким образом, роль замены Ser-83/Gly в QRDR GyrA в формировании устойчивости C. trachomatis к ФХ является однозначно установленной.
Заключение_
В ходе проведенного молекулярно-генетическо-го скрининга большой коллекции урогенитальных
И. А. Эйдельштейн и соавт. Оценка механизмов устойчивости к фторхинолонам у Chlamydia trachomatis
Cie.ltfrA fpr
44: ДО
в» <Й
etc CAT Dû
1
Чо-и-
Ni_ '
ДД1ДСТТ^СйЬЛОЛТ ГАТСAC
АЦ] Thr Ml Ö|j Aip Tyi ПН "m Ич CFt Glu fc»r VjJ Ht T>t Pî-j Tfc Uuj Vil
¿ЧЛААйТОТСДТТТ^ТССТАСТТТАСТ/лЬОДТСОСАСАПЬДГТ
Alt Gin Aifi
OA 1 A G TT -С ( IJi Aii ATT AT t A С С Ci ■T'i A T Cp ¡j-.MJA r. Q il 14". Д T TfATCETAÎ Г^АйТААЛЛТвМАСЛййЛТТ1 |Ц| Till tfli tlv Aid Тц H-" OI5 CN L-(i VA1 "- Ту? Cm иг Lé-.j Vti »j-e Mil Kl. CUn Aid
Л»WAWUw ft.AWA/Лгл À-MïMiAl 'Шла MЛ aA'îV
Рис. 2. Фрагмент нуклеотидной последовательности QRDR gyrA у С. trachomatis «дикого типа» (сверху) и соответствующей мутантной последовательности (внизу) с указанием позиций нуклеотидных замен, а также участков связывания праймеров и зонда (серые стрелки).
образцов, содержащих ДНК C. trachomatis, нами впервые выявлен случай наличия типичной мутации в QRDR gyrA, связанной со снижением чувствительности к ФХ. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможности формирования «классических» механизмов устойчивости к ФХ у C. trachomatis, встречающихся у других видов грамотрицательных бактерий. Вместе с тем, следует отметить крайне низкую (<0,07%)
частоту встречаемости подобного механизма устойчивости в исследованной популяции штаммов C. trachomatis — возбудителей инфекций мочеполовой системы. Разработанный нами подход может быть использован для быстрого выявления мутаций и прогнозирования возможной устойчивости C. trachomatis к антибиотикам фторхинолонового ряда.
Литература
1. Somani J., Bhullar V.B., Workowski K.A., Farshy C.E., Black C.M. Multiple drug-resistant Chlamydia trachomatis associated with clinical treatment failure. J Infect Dis 2000; 181:1421-7.
2. Morrissey I., Salman H., Bakker S., Farrell D., Bebear C.M., Ridgway G. Serial passage of Chlamydia spp. in sub-inhibitory fluoroquinolone concentrations. J Antimicrob Chemother 2002; 49:757-61.
3. Лазарев В.Н., Говорун В.М., Савичева А.М. Анализ точечных мутаций в генах ygeD, gyrA и parC клинических изолятов Chlamydia trachomatis, устойчивых к фторхинолонам. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 2004; (3):3-7.
4. Мисюрина О.Ю. Молекулярно-генетические особенности клинических изолятов Chlamydia trachomatis, in vitro устойчивых к фторхинолонам или макролидам. Дисс. канд. биол. наук. Москва; 2002. 73.
5. Шипицина Е.В. Савичева А.М. Хуснутдинова Т.А. Устойчивость Chlamydia trachomatis к антибиотикам in vitro: методологические аспекты и клиническое значение. Клин микробиол антимикроб химиотер 2004; 6(1):54-64.
6. Shkarupeta M.M., Lazarev V.N., Akopian T.A., et al. Analysis of antibiotic resistance markers in Chlamydia
trachomatis clinical isolates obtained after ineffective antibiotic therapy. Bull Exp Biol Med 2007; 143:713-7.
7. Николаева О.Ю. Резистентность к терапии уроге-нитального хламидиоза: механизмы устойчивости к антибактериальным препаратам. Дисс. канд. биол. наук. Москва; 2004. 83 с.
8. Holmes K., Sparling P., Stamm W., et al. Sexually Transmitted Diseases. 4-th ed. McGraw-Hill Medical; 2008.
9. Lorian V., Ed. Antibiotics in laboratory medicine. 5-th ed. Williams & Willrins; Baltimore; 2005.
10. Ridgway G.L., Bebear C., Bebear C.M., Felmingham D., et al. Sub-committee on susceptibility testing of intracellular and cell-associated pathogens of the European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID). Antimicrobial susceptibility testing of intracellular and cell-associated pathogens. EUCAST discussion document E.Dis 6.1 March 2001. Clin Microbiol Infect 2001; 7 (12):1-10.
11. Suchland R.J., Geisler W.M., Stamm W.E. Methodologies and cell lines used for antimicrobial susceptibility testing of Chlamydia spp. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47 (2):636-42.
И. А. Эйдельштейн и соавт. Оценка механизмов устойчивости к фторхинолонам у Chlamydia trachomatis
12. Эйдельштейн М.В., Алексеев Я.И., Романов А.В. и др. Способ детекции специфических нуклеотидных последовательностей и нуклеотидных замен с помощью ПЦР в режиме реального времени с эффектом гашения флуоресценции зонда праймером. Патент на изобретение № RU 2451086.
13. Lee S.H., Vigliotti V.S., Pappu S. DNA sequencing validation of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae nucleic acid tests. Am J Clin Pathol 2008; 129:852-9.
14. Dessus-Babus S., Bebear C.M., Charron A., Bebear C., de Barbeyrac B. Sequencing of gyrase and topoisomerase IV quinolone-resistance-determining regions of Chlamydia
trachomatis and characterization of quinolone-resistant mutants obtained in vitro. Antimicrob Agents Chemother 1998; 42:2474-81.
15. Nakata K., Maeda H., Fujii A., Arakawa S., Umezu K., Kamidono S. In vitro and in vivo activities of spar-floxacin, other quinolones, and tetracyclines against Chlamydia trachomatis. Antimicrob Agents Chemother 1992; 36:188-90.
16. Yoshida H., Bogaki M, Nakamura M, Yamanaka L.M., Nakamura S. Quinolone resistance-determining region in the DNA gyrase gyrB gene of Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother 1991; 35:1647-50.
