CC BY
28
10.21518/2079-701X-2016-05-142-145
И.А. ЭЙДЕЛЬШТЕЙН1, к.б.н., М.В. ЭЙДЕЛЬШТЕЙН1, к.б.н., Е.В. ШИПИЦЫНА2, д.б.н., Т.А. ХУСНУТДИНОВА2, М.И. ОТВАГИНА1,
А.М. САВИЧЕВА2, д.м.н., профессор, Р.С. КОЗЛОВ1, д.м.н., профессор, Ю.В. ВИННИКОВА3, О.Ю. КУЦЕВАЛОВА4, к.б.н., И.В. БОРИСОВ5, к.б.н.
1 Смоленский государственный медицинский университет Минздрава России
2 «НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта» СЗО РАМН, Санкт-Петербург
3 ООО «Клинико-диагностическая лаборатория «Здоровье», Барнаул
4 Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Минздрава России
5 Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов
СУЩЕСТВУЕТ ЛИ ПРОБЛЕМА
V V
МУТАЦИОННОМ УСТОЙЧИВОСТИ К ФТОРХИНОЛОНАМ У CHLAMYDIA TRACHOMATIS
РОССИЙСКИЕ ДАННЫЕ
До настоящего времени мутационная устойчивость C. trachomatis к фторхинолонам (ФХ), которые используются, наряду с макролидами и тетрациклинами, для лечения хламидийных инфекций, не была описана в клинической практике. Возможность селекции мутаций резистентности к ФХ (преимущественно в участке ORDR gyrA) была продемонстрирована исключительно в экспериментах in vitro. В статье описан впервые выявленный клинический случай наличия типичной мутации устойчивости к ФХ в ORDR gyrA C. trachomatis. Проведенное исследование тем не менее показывает, что классические механизмы резистентности к ФХ встречаются крайне редко в популяции клинических штаммов C. trachomatis.
Ключевые слова:
Chlamydia trachomatis фторхинолоны топоизомеразы QRDR, GyrA, мутации
ВВЕДЕНИЕ
Облигатный внутриклеточный микроорганизм Chlamydia trachomatis в настоящее время рассматривается как самый распространенный бактериальный возбудитель заболеваний, передающихся половым путем.
Внутриклеточный цикл развития хламидий предполагает использование для терапии антибиотиков, способных накапливаться в клетках и препятствовать размножению возбудителя. Данными свойствами обладают тетра-циклины, макролиды, азалиды и фторхинолоны (ФХ).
Макролиды (азитромицин) и тетрациклины (доксици-клин) являются антибиотиками выбора при лечении заболеваний, вызванных C. trachomatis. Известно, что фторхинолоны также демонстрируют высокую антихламидий-ную активность in vitro и рассматриваются как альтернативные препараты для терапии хламидийной инфекции преимущественно в сочетании с гонококковой. ФХ являются одними из наиболее широко используемых в России антимикробных препаратов (40% от общего количества
антимикробных препаратов), особенно в урологической практике. Таким образом, широкое применение ФХ создает условия селективного давления на патогенные микроорганизмы и может способствовать отбору штаммов с приобретенной устойчивостью.
До настоящего времени проблема развития анти-биотикорезистентности у хламидий изучена недостаточно хорошо, исключая случаи описательного характера и публикации, указывающие на возможное отсутствие эффекта терапии у пациентов с хламидийной инфекцией [1]. В отдельных работах эффект множественной резистентности выделенных штаммов связывают с фенотипической (гетеротипической) резистентностью, но не с генетической (мутационной) устойчивостью, поскольку молекулярные мишени для разных групп антимикробных препаратов различны. До настоящего времени, однако, случаи выделения клинических изо-лятов C. trachomatis, проявляющих стабильный фенотип резистентности вследствие наличия известных генетических механизмов, не были описаны.
Вместе с тем была продемонстрирована возможность in vitro селекции мутаций устойчивости к моксифлоксаци-ну и ципрофлоксацину у штаммов C. trachomatis LGV2 при их последовательном культивировании на среде с возрастающей концентрацией антибиотика [2].
В России изучению проблемы антибиотикорезистент-ности C. trachomatis посвящен ряд работ, включая исследования in vitro чувствительности к ФХ клинических изо-
лятов, выделенных у пациентов с предполагаемой неэффективностью антибактериальной терапии, с использованием культурального метода [3-6]. В этих работах также предпринята попытка анализа молекулярно-генетиче-ских механизмов устойчивости изолятов со сниженной чувствительностью к ФХ путем прямого секвенирования генов-мишеней ФХ (gyrA и parC). Однако в ходе данного анализа были выявлены лишь мутации, приводящие к аминокислотным заменам вне участков связывания ФХ (quinoLone resistance determining regions, QRDRs), что позволяет сделать вывод о возможном наличии у хлами-дий альтернативных механизмов устойчивости к данным антибиотикам [3,4,7].
До настоящего времени проблема развития антибиотикорезистентности у хламидий изучена недостаточно хорошо, исключая случаи описательного характера и публикации, указывающие на возможное отсутствие, эффекта терапии у пациентов с хламидийной инфекцией
Выделение C. trachomatis в культуре клеток является трудоемким и длительным процессом, а изучение анти-биотикочувствительности осложняется отсутствием стандартизованной методики и критериев интерпретации данных, а также понимания взаимосвязи между результатами, полученными in vitro, и клиническим исходом терапии [8-10]. Многочисленные исследования показывают, что данные оценки уровня устойчивости к антихламидий-ным препаратам, полученные при использовании различных вариантов методов культивирования, могут существенно отличаться [11].
В последние годы интенсивно разрабатываются молекулярные методы для выявления генетических детерминант резистентности у микроорганизмов. Мутации в генах, приводящие к модификации мишени связывания с антибиотиком, описаны для различных групп препаратов. Основой формирования резистентности к ФХ у грамотри-цательных бактерий являются аминокислотные замены в QRDR участках каталитических субъединиц ДНК-гиразы (GyrA, участок между аминокислотными остатками 67 и 106, обычно в позициях 83 и 87) и топоизомеразы IV (ParC, позиции 80 и 84), приводящие к снижению их аффинности к хинолонам. Для определения мутаций устойчивости к фторхинолонам в QRDR генов-мишеней (gyrA и parC) C. trachomatis нами была использована методика на основе ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ), описанная ранее [17].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Клинические образцы. В исследование было включено 1 863 клинических образца (соскобы из цервикально-го канала женщин и уретры мужчин), полученных в 2009-2015 гг., от пациентов с инфекциями урогениталь-ного тракта различной локализации. Материал был полу-
чен из локальных лабораторий, где осуществлялся предварительный скрининг образцов на наличие ДНК C. trachomatis с использованием доступных на российском рынке коммерческих тест-систем на основе технологии ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Выделение ДНК проводили принятыми в каждой лаборатории наборами реагентов. Очищенную ДНК хранили при -70 °С до момента анализа.
ПЦР в режиме реального времени для анализа мутаций в ORDR gyrA и parC. Наличие мутаций в QRDR генов gyrA и parC определяли с помощью метода ПЦР-РВ с эффектом гашения флуоресценции зонда праймером [12]. Дизайн флуоресцентно-меченых зондов (табл. 1) обеспечивал возможность выявления последовательностей ДНК C. trachomatis «дикого типа» и любых мутаций в участках, соответствующих кодонам 81-87 gyrA и 80-85 parC (нумерация Escherichia coli), путем анализа кривых плавления зондов непосредственно после проведения амплификации. Амплификацию и анализ кривых плавления зондов проводили по методике, описанной ранее [17].
В качестве контрольной ДНК использовали препарат, выделенный из C. trachomatis (серовар L2) с последовательностями QRDR gyrA и parC «дикого типа».
Секвенирование ORDR gyrA C. trachomatis. При выявлении с помощью ПЦР-РВ отличной от контрольного образца температуры плавления зонда, свидетельствующей о наличии мутаций в области кодонов 81-87 gyrA, внутренний фрагмент gyrA длиной 336 п.н., включающий всю область QRDR, исследовали путем дополнительной амплификации и секвенирования с внешними праймера-ми (табл. 1). Секвенирование проводили с помощью наборов BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit и генетического анализатора ABI Prism® 310 (Applied Biosystems, США).
Таблица 1. Олигонуклеотидные праймеры и зонды для выявления и характеристики мутаций в 0RDR генов дугА и рагС
Праймер/зонд Последовательность, 3-5'* Концентрация, мкМ
ПЦР-РВ
CTR_gyrA_Rpm CTR gyrA Fpm CTR_gyrA_Pb ATCCTGTGCCAGCCTTACTAAAGT ATACTTCCGGAGATTA(T-BHQ1)CACCC AAAGTAGGATAAATGACACTfTCTCC-R6G 0,2 0,8 0,2
CTR_parC_Rpm CTR parC Fpm CTR_parC_Pb TTTATTTGCCAAAACGACAAGA GCTGCACCTGCATGG(T-BHQ1)GAT AGCTTCCACGATAGGCGC-FAM 0,2 0,8 0,2
ПЦР и секвенирование
CTR gyrA SeqF CTR_gyrA_SeqR ATTAAAACCTTCTCAGCGACG GTTTCATCGTAGTTAGGGACCA 0,2 0,2
* FAM - карбоксифлуоресцеин, R6G - 6-карбоксиродамин, BH01 - темновой гаситель флуоресценции 1 (black hole quencher 1).
Рисунок 1. Пример анализа QRDR gyrA и parC C. trachomatis с помощью анализа кривых плавления зондов после проведения ПЦР-РВ
A/G (Gly-83) Тш=58,0"С / / т^Э г/ / 1 \ «ДИКИЙ тип» R6G Tm=61,7°С ЯУГА \ Ж
; Jr 7 «дикий ТИП» FAM Тт=62.0° рагС \
\
- \
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ПЦР-РВ для детекции мутаций в ORDR gyrA и parC C. trachomatis. Использованная в данном исследовании технология ПЦР-РВ обеспечивает возможность выявления различных (как известных, так и неизвестных) мутаций в области связывания олигонуклеотидных зондов и основана на эффекте переноса энергии флюоресценции между зондом и одним из праймеров [12]. В соответствии с описанным ранее дизайном, мутации в участках QRDR gyrA и parC могут быть выявлены с помощью постампли-фикационного анализа кривых плавления зондов: образ-
цы, несущие мутации в области связывания зонда, характеризуются сниженной аффинностью и, соответственно, меньшей температурой плавления (Tm) зонда.
Скрининг клинических образцов на наличие мутаций в ORDR gyrA и parC. В исследование было включено 1 863 клинических образца, положительных на наличие ДНК C. trachomatis по результатам первичного скрининга, и 200 отрицательных образцов (контроль специфичности). Все образцы были проанализированы на наличие мутаций в QRDR gyrA и parC с использованием описанной выше технологии. Пример анализа мутаций в QRDR gyrA и parC C. trachomatis с помощью ПЦР-РВ и анализа кривых плавления зондов представлен на рисунке 1. Специфические последовательности gyrA и parC C. trachomatis были выявлены, соответственно, в 1 841 и 1 839 положительных образцах (относительная чувствительность 99,8 и 98,7%), но ни в одном из отрицательных образцов (специфичность 100%). При этом следует отметить высокую чувствительность выявления хромосомных локусов gyrA и parC, несмотря на их менее высокую копийность по сравнению с криптической плазмидой C. trachomatis, которая является мишенью коммерческих диагностических систем [13]. Скрининг не выявил значимых мутаций в QRDR parC ни в одном образце. Все образцы имели профиль плавления зонда CTR_parC_Pb, идентичный «дикому типу». Факт отсутствия мутаций в parC клинических штаммов C. trachomatis является в достаточной степени ожидаемым, поскольку топоизомераза IV является вторичной мишенью ФХ у всех грамотрицательных бактерий, и мутации в области QRDR parC встречаются реже по сравнению с QRDR gyrA у различных видов данной группы [14]. В то же время у этой группы микроорганизмов наибольшее сродство ФХ проявляют к ДНК-гиразе, благодаря чему именно этот фермент является первичной мишенью их действия. ФХ, обладающие приблизительно одинаковым сродством к обеим топоизомеразам, в наименьшей степени способствуют селекции устойчивости. Это связано
Рисунок 2. Фрагмент нуклеотидной последовательности QRDR gyrA C. trachomatis «дикого типа» (сверху) и соответствующей мутантной последовательности (внизу) с указанием позиций нуклеотидных замен, а также участков связывания праймеров и зонда (цветные стрелки)
с тем, что для формирования устойчивого штамма мутации должны произойти одновременно в генах обоих ферментов, вероятность же двойных мутаций существенно ниже, чем одиночных.
ФХ, обладающие приблизительно одинаковым сродством к обеим топоизомеразам, в наименьшей степени способствуют селекции устойчивости. Это связано с тем, что для формирования устойчивого штамма мутации должны произойти одновременно в генах обоих ферментов, вероятность же. двойных мутаций существенно ниже, чем одиночных
Во всех, за исключением одного образца, были также обнаружены последовательности QRDR gyrA «дикого типа» в соответствии с профилем плавления зонда CTR_gyrA_Pb. Единственный образец продемонстрировал характерное снижение температуры плавления зонда (DTm = 3,7 0С), свидетельствующее о наличии мутации в QRDR gyrA (рис. 1).
Последующий анализ с использованием секвениро-вания подтвердил наличие однонуклеотидной транзи-ции A/G в области связывания зонда, которая соответствует аминокислотной замене Ser-83/GLy в QRDR GyrA (рис. 2). Известно, что данная мутация приводит к нарушению связывания ФХ с ДНК-гиразой и тем самым к формированию устойчивости к препаратам данной группы у различных видов грамотрицательных бактерий. В частности, замены аминокислотного остатка в позиции
83 GyrA, включая GLy-83, широко распространены у ФХ-резистентных штаммов энтеробактерий (E. coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp., и др.). Во многих исследованиях показана четкая корреляция между наличием замен в позициях 83 и 87 GyrA и повышенным уровнем устойчивости к ФХ [15, 16]. Более того, в исследовании Dessus-Babus et aL. культивированиe штаммов C. trachomatis in vitro в присутствии субингибирующих концентраций офлоксацина и ципрофлоксацина приводило к селекции мутантов с аминокислотными заменами именно в позиции 83 GyrA, которые обусловливали повышение минимальных подавляющих концентраций ФХ в 256 и более раз [14]. Таким образом, роль замены Ser-83/GLy в QRDR GyrA в формировании устойчивости C. trachomatis к ФХ является однозначно установленной.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В ходе проведенного молекулярно-генетического скрининга большой коллекции урогенитальных образцов, содержащих ДНК C. trachomatis, нами был выявлен единичный случай наличия типичной мутации в QRDR gyrA, связанной со снижением чувствительности к ФХ. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможности формирования «классических» механизмов устойчивости к ФХ у C. trachomatis, встречающихся у других видов грамотрицательных бактерий. Вместе с тем следует отметить крайне низкую (0,05%) частоту встречаемости подобного механизма устойчивости в исследованной популяции штаммов C. trachomatis - возбудителей инфекций урогенитального тракта.
ЛИТЕРАТУРА
1. Somani J, BhuLLar VB, Workowski KA, Farshy CE, Black CM. Multiple drug-resistant Chlamydia trachomatis associated with cLinicaL treatment faiLure. J Infect Dis, 2000, 181: 1421-1427.
2. Morrissey I, SaLman H, Bakker S, FarreLL D, Bebear CM, Ridgway G. SeriaL passage of Chlamydia spp. in sub-inhibitory fLuoroquinoLo-ne concentrations. J Antimicrob Chemother, 2002, 49: 757-761.
3. Лазарев В.Н., Говорун В.М., Савичева А.М. Анализ точечных мутаций в генах ygeD, gyrA и parC клинических изолятов Chlamydia trachomatis, устойчивых к фторхинолонам. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2004, (3): 3-7.
4. Мисюрина О.Ю. Дисс.канд. биол. наук. Молеку-лярно-генетические особенности клинических изолятов Chlamydia trachomatis, in vitro устойчивых к фторхинолонам или макролидам. М., 2002. 73.
5. Шипицина Е.В. Савичева А.М. Хуснутдинова ТА. Устойчивость Chlamydia trachomatis к антибиотикам in vitro: методологические аспекты и клиническое значение. Клин Микробиол Антимикроб Химиотер, 2004, 6(1): 54-64.
6. Shkarupeta MM, Lazarev VN, Akopian TA, et aL. AnaLysis of antibiotic resistance markers in Chlamydia trachomatis cLinicaL isoLates obtained after ineffective antibiotic therapy. Bull Exp Biol Med, 2007, 143: 713-7.
7. Николаева О.Ю. Дисс.канд. биол. наук. Резистентность к терапии урогенитального хламидиоза: механизмы устойчивости к антибактериальным препаратам. М., 2004. 83.
8. HoLmes K, SparLing P, Stamm W et aL. SexuaLLy Transmitted Diseases. 4-th ed. McGraw-HiLL MedicaL, 2008.
9. Lorian V, Ed. Antibiotics in Laboratory medicine. 5-th ed. WiLLiams & WiLLrins, BaLtimore, 2005.
10. Ridgway GL, Bebear C, Bebear CM, FeLmingham D, et aL. Sub-committee on SusceptibiLity Testing of IntraceLLuLar and CeLL-associated Pathogens of the European Committee for AntimicrobiaL SusceptibiLity Testing (EUCAST) of the European Society of CLinicaL MicrobioLogy and Infectious Diseases (ESCMID). AntimicrobiaL susceptibiLity testing of intraceL-LuLar and ceLL-associated pathogens. EUCAST discussion document E.Dis 6.1 March 2001. Clin. Microbiol. Infect, 2001, 7(12): 1-10.
11. SuchLand RJ, GeisLer WM, Stamm WE. MethodoLogies and ceLL Lines used for antimicrobiaL susceptibiLity testing of Chlamydia spp. Antimicrob Agents Chemother, 2003, 47(2): 636-42.
12. Эйдельштейн М.В., Алексеев Я.И., Романов А.В. и др. Способ детекции специфических нуклеотид-ных последовательностей и нуклеотидных замен с помощью ПЦР в режиме реального времени с эффектом гашения флуоресценции зонда прай-мером. Патент на изобретение №RU 2451086.
13. Lee SH, VigLiotti VS, Pappu S. DNA sequencing vaLidation of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae nucLeic acid tests. Am J Clin Pathol, 2008, 129: 852-859.
14. Dessus-Babus S, Bebear CM, Charron A, Bebear C & de Barbeyrac B. Sequencing of gyrase and topoisomerase IV quinoLone-resistance-deter-mining regions of Chlamydia trachomatis and characterization of quinoLone-resistant mutants obtained in vitro. Antimicrob Agents Chemother, 1998, 42: 2474-2481.
15. Nakata K, Maeda H, Fujii A, Arakawa S, Umezu K, Kamidono S. In vitro and in vivo activities of sparfLoxacin, other quinoLones, and tetracy-cLines against Chlamydia trachomatis. Antimicrob Agents Chemother, 1992, 36: 188-90.
16. Yoshida H, Bogaki M, Nakamura M, Yamanaka LM, Nakamura S. OuinoLone resistance-determining region in the DNA gyrase gyrB gene of Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother. 1991, 35: 1647-50.
17. Эйдельштейн И.А., Эйдельштейн М.В., Шипи-цына Е.В., Хуснутдинова Т.А., Савичева А.М., Козлов Р.С. Оценка распространенности «классических» механизмов устойчивости к фторхинолонам у Chlamydia trachomatis связанных с мутациями в генах топоизомераз. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия, 2014, 4(16).
