CC BY
45
RM'AiX
www.antibiotic.ru/cmac/
КЛИНИЧЕСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ И АНТИМИКРОБНАЯ ХИМИОТЕРАПИЯ
Тол 20 N°1
2018
Полногеномное секвенирование штаммов Mycoplasma hominis, устойчивых к ципрофлоксацину
Колесникова Е.А., Бруснигина Н.Ф., Махова М.А., Алексеева А.Е.
ФБУН «Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной» Роспотребнадзора, Нижний Новгород, Россия
Контактный адрес:
Елена Александровна Колесникова
Эл. почта: shmelevael@yandex.ru
Ключевые слова: Mycoplasma hominis, полногеномное секвенирование, резистентность, ципрофлок-сацин, gyrA, мутации.
С целью определения молекулярного механизма резистентности к ципрофлоксацину были исследованы клинические изоляты Mycoplasma hominis (2 штамма), выделенные у женщин с воспалительными заболеваниями органов малого таза. Проведено полногеномное секвенирование на высокопроизводительном секвенаторе MiSeq (Illumina, США). Показано, что штаммы M. hominis M57 и M. hominis М45 обладают характерным для данного вида содержанием ГЦ-оснований - 27,2%. Установлена высокая степень гомологии белковых последовательностей штаммов M. hominis M57 и M. hominis М45. Филогенетический анализ показал, что штамм M. hominis M57 эволюционно ближе расположен к штамму M. hominis PG21, а M. hominis M45 к M. hominis H34. Анализ аминокислотных последовательностей генов gyrA, gyrB, parC и parE изолятов M. hominis М45 и M. hominis М57 выявил, что молекулярный механизм их резистентности к ципрофлоксацину обусловлен наличием мутационного изменения в QRDR области гена gyrA (субъединица А ДНК-гиразы) с заменой серина (Ser) на лейцин (Leu) в позиции 83. Мутаций, затрагивающих кодоны аминокислот в QRDR области генов gyrB, parC и parE, не обнаружено. Анализ структуры генов gyrA, gyrB, parC и parE показал высокую степень полиморфизма, обусловленную высокой частотой спонтанных мутаций. Определено, что в геноме штаммов M. hominis М45 и M. hominis М57 присутствуют гены семейства эффлюксной системы MATE, но на сегодняшний день их роль в развитии резистентности M. hominis экспериментально не доказана.
Whole genome sequencing of Mycoplasma hominis strains resistant to ciprofloxacin
Kolesnikova E.A., Brusnigina N.F., Makhova M.A., Alekseeva A.E.
Nizhny Novgorod Research Institute of Epidemiology and Microbiology named after I.N. Blokhina, Nizhny Novgorod, Russia
Contacts:
Elena A. Kolesnikova E-mail: shmelevael@yandex.ru
Key words: Mycoplasma hominis, whole genome sequencing, resistance, ciprofloxacin, gyrA, mutation.
In order to determine molecular mechanisms of resistance to ciprofloxacin, clinical isolates of Mycoplasma hominis (2 strains) obtained from women with pelvic inflammatory disease were investigated. Whole genome sequencing was performed using a high-performance MiSeq sequencer (Illumina, USA). M. hominis M57 and M45 isolates were found to have the proportion of GC-bases which is typical for this species (27.2%). A high degree of the protein sequences homology of the M57 and M45 isolates has been determined. Phylogenetic analysis showed that the M57 isolate is evolutionarily closer to the PG21 isolate, and M45 is evolutionarily closer to H34. Analysis of the amino acid sequences of gyrA, gyrB, parC and parE genes in M45 and M57 isolates detected that the molecular mechanism of ciprofloxacin resistance is due to the presence of mutational changes in the QRDR of gyrA gene (DNA gyrase subunit A) leading to substitution of serine for leucine at the position 83. No mutations affecting the codons in the QRDR of gyrB, parC and parE genes were detected. Analysis of the gyrA, gyrB, parC and parE genes structure showed a high degree of polymorphism due to the high spontaneous mutations rate. The genomes of M. hominis M45 and M57 isolates found to carry genes of the MATE family efflux pumps, but their role in the development of antimicrobial resistance in M. hominis has not been proved experimentally to date.
Введение
Проблема резистентности микроорганизмов к антибактериальным препаратам является общепризнанной и рассматривается как социальная проблема и реальная угроза здоровью людей. Зачастую клиницисты при назначении антибактериальной терапии не обладают достаточной информацией об этиологическом агенте, спектре и степени его резистентности, что приводит к выбору неэффективных препаратов, усиливает селективное давление антибиотиков на популяцию микроор-
ганизмов, способствует возникновению и распространению полирезистентных штаммов среди населения [1-4].
Актуальность проблемы подтверждается данными литературы о снижении чувствительности генитальных микоплазм к фторхинолонам (ФХ), широко использующимся при лечении воспалительных заболеваний органов малого таза (ВЗОМТ) [5-7]. Информация о спектре и степени резистентности возбудителей различных воспалительных заболеваний, в частности, заболеваний уро-
Колесникова Е.А. и соавт.
КМАХ . 2018 . Том 20 . №1
ОПЫТ РАБОТЫ
генитального тракта, должна служить основой для назначения эффективных антибактериальных препаратов, что позволит избежать серьёзных осложнений [1, 7].
В последнее время молекулярные методы активно применяются для выявления генетических детерминант резистентности у различных микроорганизмов, в том числе Mycoplasma hominis [5, 8-10]. Мутации в генах, приводящие к модификации мишени связывания с антибиотиком, описаны для различных групп препаратов. Основой формирования резистентности к ФХ у гра-мотрицательных бактерий, в том числе и у M. hominis, являются аминокислотные замены в QRDR (Quinolone Resistance-Determing Region) участках субъединиц ДНК-гиразы (gyrA, участок между аминокислотными остатками 67 и 106, обычно в позициях 83, 84 и 87) и топоизомеразы IV (parC, позиции 80, 84, 91) [11-14].
Целью данной работы являлось изучение молеку-лярно-генетических особенностей клинических изолятов M. hominis М45 и M. hominis М57 и определение механизма их устойчивости к ципрофлоксацину.
Материалы и методы
В работе исследовали ДНК двух изолятов M. hominis, выделенных из соскобов эпителия цервикального канала у женщин с ВЗОМТ, являющихся пациентками одного из ЛПУ Нижнего Новгорода. Фенотипически изучаемые штаммы микоплазм характеризовались устойчивостью к ципрофлоксацину. Секвенирование штаммов M. hominis М45 и M. hominis М57 проводили с использованием высокопроизводительного секвенатора MiSeq (Illumina, США). Выделение и очистку ДНК проводили с использованием набора «АмплиПрайм ДНК-сорб-В» (ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия). Концентрацию ДНК в образцах определяли с помощью флуориметра Qubit (Invitrogen, Австрия). При подготовке библиотеки ДНК для секвенирования использовали набор Nextera XT Sample Preparation kit (Illumina, США), секвенирование проводили с использованием набора MiSeq reagent kit v2 (Illumina, США) на 500 циклов. Для выравнивания нуклеотидных последовательностей использовали программу Burrows-Wheeler Aligner (BWA). Визуализацию и анализ полученных данных проводили с помощью программного обеспечения UGENE Unipro и MEGA5. Аннотацию генома проводили с использованием сервера RAST (Rapid Annotation using Subsystem Technology, http://rast.nmpdr.org/rast.cgi) и NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (PGAP) (www.ncbi.nlm.nih.gov/ genome/annotation_prok/). Построение филогенетических деревьев осуществляли с использованием методов UPGMA и Neighbor Joining. В качестве эталона служила полногеномная последовательность штамма M. hominis АТСС 23114 (номер GenBank FP236530.1).
Результаты и обсуждение
Основные результаты полногеномного секвенирова-ния и аннотирования генома микоплазм представлены в Таблице 1. Данные, представленные в Таблице 1, по-
Колесникова Е.А. и соавт.
Таблица 1. Общие результаты полногеномного секвенирования штаммов M. hominis М45 и М57
Характеристика Штаммы Mycoplasma hominis
M. hominis М45 M. hominis М57
Количество прочтений, млн. 3,8 2,б
Общее число контигов Зб 38
Размер генома, п.н. б43 100 бЗб 500
ГЦ, % 27,1 27,2
Количество белок-кодирующих 54б 543
последовательностей
Количество уникальных белок- 14 4
кодирующих последовательностей
Количество рРНК б б
Количество тРНК 33 37
Количество генов 591 585
Количество псевдогенов 32 32
Количество белков 517 511
казывают, что оба штамма имеют сходные значения в структуре генома. Содержание GC-оснований у штамма M. hominis М45 составило 27,1%, у M. hominis М57 -27,2%, что соответствует данным о других представителях вида M. hominis, имеющихся в базе NCBI Genome. Общее число генов у изолята M. hominis М45 составило 591, псевдогенов - 32; у M. hominis М57 общее количество генов - 585, псевдогенов - 32. Результаты аннотирования геномов с использованием сервера RAST показали высокую степень гомологии белковых последовательностей исследуемых клинических изолятов, составившую 95%.
Филогенетический анализ 13 штаммов микоплазм, чьи геномы аннотированы в международную базу данных GeneBank/NCBI, показал эволюционно высокую степень родства всех штаммов микоплазм (Рисунок 1). Следует отметить, что изолят M. hominis М45 филогенетически ближе к штамму M. hominis H34, который был выделен в России (Гущин А. и соавт., 2017), а M. hominis М57 к M. hominis ATCC 23114 (Pereyre S. и соавт., 2009) и M. hominis TOA (Гущин А. и соавт., 2017).
С целью определения молекулярного механизма резистентности к ФХ проведен анализ QRDR области генов-мишеней gyrA, gyrB, parC и parE. Основные результаты сравнения структуры генов и кодирующих белков штаммов M. hominis М45 и M. hominis М57, проведенных относительно референтного штамма M. hominis АТСС 23114 (номер GenBank FP236530.1), представлены в Таблице 2 и Таблице 3.
Данные свидетельствуют о высокой степени полиморфизма генов gyrA, gyrB, parC и parE, как у M. hominis М45, так и у M. hominis М57, обусловленного большим количеством спонтанных мутаций, не затрагивающих кодоны аминокислот. Так, в гене gyrA выявлены аминокислотные замены в четырех позициях, в гене gyrB - в двух позициях, в гене parC - в восьми позициях, в гене paгЕ - в двух позициях. Размер генов, кодирующих резистентность к ФХ у исследуемых штаммов, был одинаковый. Отличия выявлены в общем количестве мутаций,
ОПЫТ РАБОТЫ
КМАХ . 2018 . Том 20. №1
Таблица 2. Характеристика генетических детерминант резистентности к фторхинолонам у штамма M. hominis М45 относительно референтного штамма M. hominis АТСС 23114
Наименование гена Длина нуклеотид-ной последовательности Длина аминокислотной последовательности Количество мутаций Количество замен Позиция и замены аминокислот
gyrA 2736 911 48 4 65 аргинин - лизин (К) 525 лизин (К) - аргинин 871 аспарагин - серин 903 глутаминовая кислота (Е) - лизин (К)
gyrB 1947 648 29 2 143 лизин (К) - аргинин 313 треонин (Т) - изолейцин (I)
parC 2802 933 44 8 542 серин - аспарагин N 632 валин (V) - изолейцин (I) 649 метионин (М) - изолейцин (I) 666 аспарагин (^ - серин 743 серин - лейцин Р 827 валин (V) - аланин (А) 828 аспарагиновая кислота Р) - аспарагин N 862 глутамин - глутаминовая кислота (Е)
parE 1920 639 14 2 387 лизин (К) - аргинин 546 лейцин Р - фенилаланин
Таблица 3. Характеристика генетических детерминант резистентности к фторхинолонам у штамма M. hominis М57 относительно референтного штамма M. hominis АТСС 23114
Наименование гена Длина нуклеотид-ной последовательности Длина аминокислотной последовательности Количество мутаций Количество замен Позиция и замены аминокислот
gyrA 2736 911 37 4 65 аргинин - лизин (К) 443 аргинин - серин 745 аспарагиновая кислота Р) - аспарагин (^ 903 изолейцин (I) - лизин (К)
gyrB 1947 648 16 2 168 валин (V) - аланин (А) 313 треонин (Т) - изолейцин (I)
parC 2802 933 34 8 144 лизин (К) - аргинин 616 аспарагин N - серин 623 метионин (М) - изолейцин (I) 633 валин (V) - изолейцин(!) 743 серин - лейцин 827 валин (V) - аланин (А) 898 аспарагиновая кислота Р) - аспарагин (^ 908 валин (V) - изолейцин (I)
parE 1920 639 16 1 387 лизин (К) - аргинин
а также в аминокислотных заменах. По данным литературы, одной из причин генетического полиморфизма M. hominis является отсутствие корректирующей 3'—5' эк-зонуклеазной активности у ДНК-полимеразы III [5, 12].
В структуре QRDR области гена gyrA, как у M. hominis М45, так и у M. hominis М57 обнаружена мутация, приводящая к аминокислотной замене в позиции 83 (замена серина (Ser) на лейцин (Leu)) (Рисунок 2). Примеры наиболее часто встречающихся аминокислотных замен в генах-мишенях (gyrA, gyrB, parC и parE) M. hominis, ответственных за снижение чувствительности к ФХ, представлены в Таблице 4. Аминокислотная замена Ser83—-Leu обуславливает возникновение резистентности к ципрофлоксацину у исследуемых штаммов мико-плазм. Мутаций с заменами в аминокислотных последовательностях QRDR области генов gyrB, parC, parE обнаружено не было.
Таблица 4. Аминокислотные замены в QRDR области генов-мишеней, ассоциированные с возникновением резистентности к фторхинолонам [10-14]
Мутации в генах M. hominis
gyrA parC parE
Ser83—Leu Ser91 —>ile Asp426—Asn
Ser83—Trp Ser91—Tyr Arg447— Lys
Ser84—Trp Arg80—Tyr Asp456— Asn
Ser84—Pro Arg84—His
Glu87—Lys Ser92—Pro
Glu87—Ala Glu95—Lys
Lys134—Arg
Колесникова Е.А. и соавт.
КМАХ • 2018 • Том 20 • №1
ОПЫТ РАБОТЫ
100
100
100
81 93
100 I Mycoplasma hominis ATCC 27545 complete genome I Mycoplasma hominis ATCC 27545
- Mycoplasma hominis strain AF3
- Mycoplasma hominis strain AF1
Mycoplasma hominis strain Sprott — Mycoplasma hominis strain M45
89
99 73
Mycoplasma hominis strain H34 — Mycoplasma hominis strain TOA Mycoplasma hominis strain M57
- Mycoplasma hominis ATCC 23114
-Mycoplasma hominis strain PL5
I Mycoplasma hominis strain 387 MHOM 107 14438 1052663
100 1 Mycoplasma hominis strain 403 MHOM 10 5714 76960
0,0020
Рисунок 1. Филогенетическое дерево, построенное методом Neighbor Joining по аннотированным в GeneBank/NCBI геномным последовательностям 13 штаммов M. hominis.
Примечание: цифры в узлах дерева обозначают уровень поддержки, полученный с помощью метода Rapid Bootstrap
VEPQLLDKEINGLKPANLSKVMKTSF I E YAM SVIVSRALPD
66 68 70 72 74 76 77 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100 102 104 106
Mycoplasma hominis DNA gyrase subunit A (gyrAj PG21 V E POLL DK E 1 NG L К p AN L S К VM К T S F 1 EYAMSV 1 VS RA L Р
Mycoplasma hominis DNA gyrase subunit A (gyrAj H34 V E P Q L L DK E 1 NG L К p AN L S К VM К T S F 1 EYAMSV 1 VS RA L Р
Mycoplasma hominis M45 DNA gyrase subunit A (gyrA) V E POLL DK E 1 NG L К p AN L S К VM К T S F 1 EYAMSV 1 VS RA L Р
Mycoplasma hominis M57 DNA gyrase subunit A (gyrAj V E P Q L L DK E 1 NGL к p AN L S К VM К T S F 1 EYAMSV 1 VS RA L P
Рисунок 2. Выравнивание аминокислотной последовательности QRDR области гена gyrA штаммов M. hominis PG21, H34, M57, M45 с помощью программного обеспечения BLAST и UGENE Unipro
0,0011
0,0011
0,0011
0,0005
0 0021
—!-Mycoplasma hominis M57 DNA gyrase subunit A (gyrA)
0 0021
-'■-Mycoplasma hominis DNA gyrase subunit A (gyrA) PG21
Mycoplasma hominis DNA gyrase subunit A (gyrA) H34 Mycoplasma hominis M45 DNA gyrase subunit A (gyrA)
Рисунок 3. Филогенетическое дерево, построенное c помощью программного обеспечения UGENE Unipro и MEGA5
по аннотированным в GeneBank/NCBI последовательностям генов штаммов M. hominis PG21, H34, M57, M45
Колесникова Е.А. и соавт.
ОПЫТ РАБОТЫ
КМАХ • 2018 • Том 20- №1
Результаты филогенетического анализа гена gyrA свидетельствуют о высоком уровне гомологии гена gyrA между штаммами M. hominis M57 - M. hominis PG21, а также между штаммами M. hominis M45 - M. hominis H34, что коррелирует с данными филогенетического анализа полногеномных последовательностей изученных штаммов микоплазм (Рисунок 3).
В геноме M. hominis M57 и M. hominis M45 обнаружены гены, относящиеся к семейству MATE эффлюксной системы. Биоинформационный анализ этих генов показал, что длина их нуклеотидной (1809 нуклеотидов) и аминокислотной последовательностей (602 аминокислоты) не отличалась у исследуемых штаммов. На сегодняшний день роль эффлюкса в развитии резистентности ми-коплазм к антибактериальным препаратам при помощи генов семейства MATE экспериментально не доказана.
Заключение
Впервые в Нижнем Новгороде проведено полногеномное секвенирование клинических изолятов M. hominis, выделенных у женщин с ВЗОМТ. Определен молекулярный механизм резистентности к ципрофлокса-
цину, обусловленный заменой серина (S) на лейцин (L) в 83 позиции QRDR области гена gyrA. Следует отметить высокий уровень полиморфизма генов gyrA, gyrB, parC и parE, достигающийся за счёт большого количества нуклеотидных замен. Клинические изоляты M. hominis M57 и M. hominis M45 обладают характерным для данного вида содержанием GC-оснований - 27,2%. Показана высокая степень гомологии их белковых последовательностей. В геноме исследуемых штаммов обнаружены гены семейства MATE, но их роль в развитии антимикробной резистентности M. hominis на сегодняшний день экспериментально не доказана. Филогенетический анализ генома микоплазм показал, что штамм M. hominis M57 эволюционно ближе расположен к M. hominis PG21, а M. hominis M45 - к M. hominis H34. Подобные исследования позволяют определять природу и механизмы формирования резистентности к различным группам антибактериальных препаратов.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Литература
1. Gerasimova N.M., Evstigneeva N.P., Kuznetsova Yu.N. Urogenital infections as an interdisciplinary problem. Modern approaches to diagnosis and treatment. Vestnik poslediplomnogo meditzinskogo obrazovanija. 2009;(1):17-19. Russian. (Герасимова Н.М., Евстигнеева Н.П., Кузнецова Ю.Н. Урогенитальные инфекции как междисциплинарная проблема. Современные подходы к диагностике и лечению. Вестник последипломного медицинского образования. 2009;(1):17-19.).
2. Savicheva A.M. Modern ideas about genital mycoplasms. Mat' i ditja. 2010;18(4):183-186. Russian. (Савичева А.М. Современные представления о генитальных микоплазмах. Мать и дитя.
2010;18(4):183-186.).
3. Fofanova I.Yu. Edited by Prilepskaya V.N. Sexually Transmitted Infections. Moscow: GEOTAR-Media, 2014. 157 p. Russian. (Фофанова И.Ю. Под ред. Прилепской В.Н. Инфекции, передающиеся половым путем. Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2014. 157 с.).
4. Rakhmatullina M.R., Kirichenko S.V. Current concepts of genetic variability of genital mycoplasms and their role in the development of inflammatory diseases of the urogenital system. Vestnik dermatologii i venerologii. 2013;(3):17-25. Russian. (Рахматулина М.Р., Кириченко С.В. Современные представления о генетической вариабельности генитальных микоплазм и их роли в развитии воспалительных заболеваний мочеполовой системы. Вестник дерматологии и венерологии. 2013;(3):17-25.).
5. Chernova O.A., Medvedeva E.S., Muzykantov A.A., Baranova N.B., Chernov V.M. Mycoplasma and their resistance to antibiotics: problems and prospects for controlling mycoplasma infections and contamination of cell cultures. ACTA NATURE. 2016;8 (2Pt29):27-38. Russian. (Чернова О.А., Медведева Е.С., Музыкантов А.А., Баранова Н.Б., Чернов В.М. Микоплазмы и их устойчивость к антибиотикам: проблемы и перспективы контроля микоплазмен-ных инфекций и контаминаций клеточных культур. ACTA NATURE. 2016;8(2Pt29):27-38.).
6. Taylor-Robinson D. Infections due to species of Mycoplasma and Ureaplasma: an update. Clin Infect Dis. 2014;18:671-684.
7. Savicheva A.M., Shipitsyna E.V., Bashmakova M.A. Genital
mycoplasms - problems of diagnosis and treatment. Clinicheskaja dermatologija i venerologija. 2008;(6):80-90. Russian. (Савичева А.М., Шипицына Е.В., Башмакова М.А. Генитальные микоплаз-мы - проблемы диагностики и лечения. Клиническая дерматология и венерология. 2008;(6):80-90.).
8. Yoshida H., Bogaki M., Nakamura M., Yamanaka L.M., Nakamura S. Quinolone resistance-determining region in the DNA gyrase gyrB gene of Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother.
1991;35(8):1647-1650.
9. Yoshida H., Bogaki M., Nakamura M., Yamanaka L.M., Nakamura S. Quinolone resistance-determining region in the DNA gyrase gyrA gene of Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother. 1990;34(6):1271-1272.
10. Bebear С.М., Renaudin J., Charron A., et al. Mutations in the gyrA, parC, and parE genes associated with fluoroquinolone resistance in clinical isolates of Mycoplasma hominis. Antimicrob Agents Chemother. 1999;43(4):954-956.
11. Gushchin A.E. The role of point mutations in the topoisomerase IV and DNA gyrase genes in developing fluoroquinolone resistance in Mycoplasma hominis. PhD thesis. Moscow, 1999. 102 p. Russian. (Гущин А.Е. Роль точечных мутаций в генах топоизомеразы IV и ДНК гиразы в формировании резистентности Mycoplasma hominis к фторхинолонам. Дисс. канд. биол. наук. Москва, 1999. 102 с.).
12. Govorun V.M. Molecular mechanisms of resistance to tetracyclines and fluoroquinolones in mollikut. PhD thesis. Moscow, 2000. 59 p. Russian. (Говорун В.М. Молекулярные механизмы формирования резистентности к тетрациклинам и фторхинолонам у молликут. Автореф. дисс. докт. биол. наук. Москва, 2000. 59 c.).
13. Bebear С.М., Bove J.M., Bebear C., Renaudin J. Characterization of Mycoplasma hominis mutations involved in resistance to fluoroquinolones. Antimicrob Agents Chemother. 1997;41(2):269-273.
14. Meng D.Y., Sun C.J., Yu J.B., et al. Molecular mechanism of fluoroquinolones resistance in Mycoplasma hominis clinical isolates. Braz J Microbiol. 2014;45(1):239-242.
Колесникова Е.А. и соавт.
