CC BY
46
Е. Н. Черняева, П. В. Добрынин, Н. Е. Пестова,
Н. Г. Матвеева, В. Ф. Жемков, А. П. Козлов
ОБНАРУЖЕНИЕ МУТАЦИЙ,
АССОЦИИРОВАННЫХ С УСТОЙЧИВОСТЬЮ К ОФЛОКСАЦИНУ В ГЕНАХ GYRA И GYRB,
И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ОФЛОКСАЦИН-УСТОЙЧИВЫХ ИЗОЛЯТОВ M. TUBERCULOSIS, ВЫЯВЛЕННЫХ В САНКТ-ПЕТЕРБУРГЕ В 2008 г.
Введение
Широкое распространение штаммов Mycobacterium tuberculosis (МБТ), обладающих множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), т. е. устойчивостью одновременно к двум наиболее активно применяемым противотуберкулезным препаратам (ПТП) — изониазиду и рифампицину, является серьезным препятствием в борьбе против туберкулеза (ТБ). Штаммы M.tuberculosis с МЛУ вызывают тяжелые прогрессирующие формы заболевания, требуют длительного, дорогостоящего лечения препаратами резервного ряда и часто приводят к летальным исходам. По данным ВОЗ, каждый год возникает 424 тыс. новых случаев МЛУ туберкулеза. Доля случаев МЛУ—ТБ варьирует в различных странах от 0% (некоторые страны Западной Европы) до 22,3% (Баку, Азербайджан). В 2008 г. было установлено, что более 5% случаев ТБ вызывается изо-лятами, обладающими МЛУ [1].
Недостаток контроля или неправильное лечение туберкулеза с МЛУ приводит к возникновению широкой лекарственной устойчивости (ШЛУ). ТБ с ШЛУ вызывается бактериями, устойчивыми как к двум препаратам первого ряда — изониазиду и рифам-пицину, так и к любым фторхинолонам и, по крайней мере, к одному из трех инъекционных препаратов второго ряда (канамицин, капреомицин или амикацин) [2]. По данным ВОЗ, в 2006 г. было обнаружено 0,5 млн новых случаев заболевания с МЛУ—ТБ. Распространенность случаев ШЛУ среди изолятов M. tuberculosis варьирует в различных регионах. Так, в странах бывшего Советского Союза около 10% случаев МЛУ—ТБ были отнесены к ШЛУ—ТБ. В странах Западной и Восточной Европы этот показатель варьирует от 0 до 23,7%, однако уровень распространенности штаммов МБТ с МЛУ в них значительно ниже, а случаи ШЛУ—ТБ единичны [3].
Наличие устойчивости к лекарственным препаратам значительно снижает вероятность успешного лечения, поэтому для назначения корректной терапии необходимо применять современные молекулярно-генетические методы обнаружения устойчивости M. tuberculosis к ПТП, основанные на анализе точечных мутаций. Применение этих методов позволяет сократить сроки определения лекарственной устойчивости до нескольких дней.
Фторхинолоны являются антибиотиками широкого спектра действия, активными против M. tuberculosis. Они оказывают бактерицидное действие, ингибируя активность микобактериальной ДНК-гиразы. ДНК-гираза является топоизомеразой типа II
© Е. Н. Черняева, П. В. Добрынин, Н. Е. Пестова, Н. Г. Матвеева, В. Ф. Жемков, А. П. Козлов, 2010
(КФ 5.99.1.3.), изменяющей топологическое состояние кольцевой ДНК посредством внесения двунитевых разрывов в молекулу ДНК и проведения сквозь них другого двуните-вого сегмента [4]. В результате этого происходит снятие напряжения в суперспирализо-ванной кольцевой молекуле ДНК, возникающего в репликационной вилке в результате расплетания двойной спирали ДНК в ходе репликации.
ДНК-гираза представляет собой тетрамерный белок, состоящий из субъединиц двух типов — А и B, которые кодируются генами gyrA и gyrB соответственно. Изучение механизмов связывания хинолонов с гиразой показало, что хинолоны обладают высокой аффинностью не к самому ферменту, а к молекулам ДНК [5]. При этом связывание препарата происходит с одноцепочечной ДНК, которая формируется при взаимодействии с ДНК-гиразой [6-8]. Образование тройного комплекса ДНК-фермент-фторхинолон приводит к нарушению процесса репликации бактериальной ДНК и гибели клетки. Участок фермента, в котором происходит связывание ДНК и фторхинолонов, получил название «хинолон-связывающего кармана» (quinolone-binding pocket), в формирование которого вовлечены обе субъединицы фермента. Обнаружено, что мутации в коротких областях генов gyrA и gyrB, кодирующих субъединицы фермента, приводят к формированию устойчивости к фторхинолонам у M. tuberculosis [9]. Участки генов gyrA и gyrB, в которых происходят мутации, ассоциированные с лекарственной устойчивостью, называют регионами, определяющими устойчивость к хинолонам (QRDR — quinolone resistance determining region) [4, 10].
В настоящее время проводятся работы, посвященные изучению роли мутаций, ассоциированных с устойчивостью МБТ к различным ПТП. Показано, что частоты мутаций, связанных с развитием лекарственной устойчивости (ЛУ) у микобактерий, различаются в разных популяциях. Для эффективного применения молекулярно-биологических методов диагностики ЛУ нужно знать частоты мутаций, связанных с ЛУ в конкретном географическом регионе.
Цель данной работы — изучение мутаций в генах gyrA и gyrB, ассоциированных с устойчивостью к препарату фторхинолонового ряда — офлоксацину у изолятов M. tuberculosis, а также сравнение генотипов устойчивых к офлоксацину штаммов M. tuberculosis со штаммами, обладающими МЛУ, и штаммами, чувствительными ко всем ПТП, выявленным в Санкт-Петербурге в 2008 г.
Методика исследования
Исследование проводили с культурами M. tuberculosis, выявленными в Санкт-Петербурге в 2008 г., обладающими устойчивостью к офлоксацину в концентрации 2 мкг/мл по данным метода абсолютных концентраций с использованием питательной среды Ле-венштейна—Йенсена [11].
Материалом исследования послужила геномная ДНК, полученная из чистых культур M. tuberculosis. Культуры 30 офлоксацин-устойчивых изолятов для генетического исследования M. tuberculosis были отобраны случайным образом. Для молекулярногенетического анализа также случайно были отобраны 30 изолятов M. tuberculosis, чувствительных ко всем ПТП, и 41 изолят с МЛУ.
В исследование мутаций в генах gyrA и gyrB было включено 30 образцов ДНК, полученных от M. tuberculosis, обладающих устойчивостью к офлоксацину, и 3 образца, чувствительных к данному противотуберкулезному препарату.
Клинический материал и данные по устойчивости к противотуберкулезным препаратам были предоставлены бактериологической лабораторией Городского противотуберкулезного диспансера г. Санкт-Петербурга в рамках совместного проекта.
Выделение ДНК. Геномную ДНК микобактерий выделяли методом, описанным ранее [12], предварительно инактивировав микобактерии инкубацией пробирок с МБТ, растущими на питательной среде Левенштейна—Йенсена, при температуре 90° С в течение 1 ч. Полученную ДНК использовали для амплификации фрагментов gyrA и gyrB, в которых ранее были обнаружены мутации, ассоциированные с лекарственной устойчивостью к фторхинолонам [9, 13].
ПЦР фрагментов генов gyrA и gyrB. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в объеме 50 мкл в тонкостенных полипропиленовых пробирках объемом 650 мкл, содержащих 10 мМ Tris-HCl (рН 8,8); 50 мМ KCl; 1,25 мМ MgCl2; 200 мкМ каждого из dNTP; 20 пМ каждого из праймеров и 2,5 единицы Taq-полимеразы. В качестве матрицы использовали 50 нг геномной ДНК микобактерий. Реакционную смесь прогревали 5 мин при 95°С для денатурации матричной ДНК. Реакцию амплификации осуществляли в термоциклере Eppendorf Mastercycler Personal в течение 35 следующих циклов: 0,5 мин при 95°C; 0,5 мин при 55°C; 45 с при 72°C. По окончании 35 циклов амплификации провели дополнительную инкубацию для достройки образовавшихся цепей ДНК: 5 мин при 72°C. Полученные амплификаты хранили при —20°C. Для ПЦР использовали праймеры, описанные ранее [9].
Секвенирование фрагментов генов gyrA и gyrB. Секвенирование ДНК выполняли ферментативным методом по Сэнгеру с помощью набора «DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit» (GE Healthcare) по прилагающимся к нему инструкциям, применяя автоматический секвенатор MegaBACE 500 (GE Healthcare). Для се-квенирования использовали немеченые специфические праймеры, использованные для ПЦР. Секвенирование ДНК проводили с обеих сторон ПЦР-продукта для всех ампли-фицированных фрагментов генов gyrA и gyrB. Полученные в результате секвенирова-ния нуклеотидные последовательности выравнивали для обнаружения мутаций в изучаемых генах.
Анализ полученных данных проводили с помощью программы MegaBACE Sequence Analyzer v.4.0. Выравнивание и анализ хроматограмм осуществляли в программе Se-quencher 4.8.
Молекулярно-генетический анализ изолятов M. tuberculosis. Молекулярно-генетический анализ офлоксацин-устойчивых изолятов M. tuberculosis проводили методом сполиготипирования, как было описано ранее [14], применяя коммерческий набор (Isogen Life Science). Принадлежность исследуемых штаммов МБТ к известным семействам сполиготипов устанавливали, сравнивая их со сполиготипами, внесенными в международную базу данных SpolDB-4. Кластерный анализ результатов генотипирования проводили, используя компьютерную программу R2.8.1. Принадлежность анализируемых сполиготипов к семействам штаммов M. tuberculosis была определена путем сравнения с профилями сполиготипирования штаммов, внесенных в международные базы данных (URL: http://cgi2.cs.rpi.edu/~bennek и http:// www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVITDemo/index.jsp).
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты секвенирования ДНК показали, что 17 из 30 (56,6%) изолятов M. tuberculosis, устойчивых к офлоксацину, имели мутации в регионе QRDR гена gyrA, ассоциированные с резистентностью к фторхинолонам, из них у 11 изолятов были мутации в 94-м кодоне, приводящие к замене D на G или A, 3 изолята имели мутацию A90V, еще 3 изолята имели замену S91P (табл. 1). У 28 из 30 офлоксацин-резистентных изолятов
Таблица 1. Результаты анализа мутаций региона QRDR гена дугА, ассоциированных с устойчивостью к фторхинолонам
Мутация в гене gyrA Число проанализированных изолятов %
D94G 2 6,6
D94A 9 30
A90V 3 10
S91P 3 10
Нет мутаций 13 43,4
была обнаружена замена S95T, являющаяся естественным полиморфизмом M. tuberculosis, не связанная с устойчивостью к противотуберкулезным препаратам.
Тринадцать (43,4%) офлоксацин-устойчивых изолятов M. tuberculosis не имели нуклеотидных замен в проанализированной области гена gyrA, ассоциированных с лекарственной устойчивостью (см. табл. 1).
Анализ фрагмента гена gyrB не обнаружил мутаций ни у одного из 30 изолятов M. tuberculosis, обладающих устойчивостью к офлоксацину.
В трех проанализированных образцах M. tuberculosis, чувствительных к офлоксаци-ну, не было обнаружено замен в генах gyrA и gyrB, кроме естественного полиморфизма в кодоне 95 гена gyrA.
Результаты анализа сполиготипов M. tuberculosis, обладающих устойчивостью к офлоксацину. Сравнение сполиготипов офлоксацин-устойчи-вых штаммов МБТ, штаммов, обладающих МЛУ, и штаммов, чувствительных ко всем ПТП. Геномная ДНК, выделенная из изолятов M. tuberculosis, обладающих устойчивостью к офлоксацину, была использована для генетического анализа методом сполиготипирования. В результате сполиготипирования среди 30 офлокса-цин-устойчивых изолятов было выявлено 7 различных сполиготипов, представленных в табл. 2. Двадцать два изолята (73,3%) имели одинаковый сполиготип ST1, относящийся к семейству M. tuberculosis Beijing.
Таблица 2. Результаты генетического анализа изолятов M. tuberculosis, обладающих устойчивостью к офлоксацину
Сполиготип Код сполиготипа Количество % Семейство
в восьмеричном в международной изолятов
коде базе данных
000000000003371 ST265 3 10 Beijing
000000000003771 ST1 22 73,33
000000000000771 ST269 1 3,33
000000000003661 ST1651 1 3,33
775777777450771 Нет 1 3,33 Т1
357777777760771 « 1 3,33
775740003760771 ST266 1 3,33 ТЗ
Семейство M. tuberculosis Beijing было представлено четырьмя сполиготипами (к ним относилось 27 исследованных изолятов), семейство Т1—двумя сполиготипами (к ним относились 2 изолята), семейство Т3 — одним сполиготипом (один изолят).
Генетический анализ изолятов M. tuberculosis с МЛУ также показал преобладание штаммов, относящихся к пекинскому семейству (более 85%), большинство из которых относилось к варианту ST1. Среди данной группы изолятов были обнаружены представители семейства сполиготипов — LAM9, T3, T4, 33 и 36 (табл. 3).
Таблица 3. Результаты генетического анализа изолятов M. tuberculosis, обладающих множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ)
Сполиготип Код сполиготипа Количество % Семейство
в восьмеричном в международной изолятов
коде базе данных
000000000003661 ST1651 4 9,76 Beijing
000000000003671 ST255 1 2,44
000000000003771 ST1 28 68,29
000002000003671 Нет 1 2,44
000002000003771 ST1184 1 2,44
774002000760771 Нет 1 2,44 ТЗ
777761007763771 « 1 2,44 Т4
777477607700771 « 1 2,44 LAM9
777574200376071 « 1 2,44 33
777777607763771 ST124-7 1 2,44
000000007760771 ST4 1 2,44 36
Анализ сполиготипов изолятов M. tuberculosis, чувствительных ко всем противотуберкулезным препаратам (табл. 4), также показал доминирование штаммов, принадлежащих к пекинскому семейству (Beijing family). К ним относились 18 (60%) из проанализированных 30 изолятов. Однако разнообразие представленных сполиготипов было выше, чем в группе штаммов, устойчивых к офлоксацину, и группе штаммов с МЛУ. Семейство Beijing было представлено семью различными сполиготипами, также были обнаружены штаммы, относящиеся к семействам Т1, Т2, 34, 35, 36, Haarlem 1 и LAM9. Десять изолятов M. tuberculosis, принадлежащих к семейству Beijing, имели сполиготип ST1, доминирующий в группе проанализированных офлоксацин-устойчивых изолятов.
Сравнение частот обнаружения штаммов M. tuberculosis, относящихся к пекинскому семейству (тест хи-квадрат и тест Фишера на независимость) показало, что все три исследованные группы образцов M. tuberculosis достоверно отличаются по преобладанию изолятов семейства Beijing (р = 0,013). Штаммы семейства Beijing достоверно чаще обладают МЛУ (р = 0,015) и устойчивостью к офлоксацину (р = 0,007).
Исследование генов gyrA и gyrB офлоксацин-устойчивых штаммов M. tuberculosis, распространенных в Санкт-Петербурге, показало, что анализ небольшого региона гена gyrA позволяет обнаружить, по крайней мере, половину (56,6%) случаев устойчивости к офлоксацину. В участке QRDR гена gyrA исследованные офлоксацин-устойчивые изоляты имели точечные мутации в кодонах 90, 91, 94. Самая распространенная мутация — замена D на G или A в 94-м кодоне, была обнаружена у 30% исследованных изолятов. Относительно высокая вероятность формирования мутаций в 94-м кодоне гена gyrA, возможно, объясняется их оптимальным влиянием на формирование устойчивости к офлоксацину либо наименьшим негативным влиянием на функциональность продукта гена. Гены gyrA трех изолятов МБТ из нашей выборки, устойчивых к офлоксацину, несли мутацию A90V. В большинстве исследований была продемонстрирована корреляция между данной мутацией и устойчивостью в офлоксацину.
Мутации в кодонах 74 и 88, описанные ранее в литературе [15-18], в данном исследовании обнаружены не были. Все обнаруженные в исследовании мутации в гене gyrA
Таблица 4. Результаты генетического анализа изолятов M. tuberculosis, обладающих чувствительностью ко всем противотуберкулезным препаратам
Сполиготип Код сполиготипа Количество % Семейство
в восьмеричном в международной изолятов
коде базе данных
000000000003371 БТ265 1 3,33 Beijing
000000000003661 ЭТ1651 2 6,67
000000000003671 ЗТ255 1 3,33
000000000003771 ЭТ1 10 33,33
000002000003661 Нет 2 6,67
000002000003771 8Т1184 1 3,33
000002000103771 Нет 1 3,33
177777657760771 БТ1255 1 3,33 ТІ
777777777760771 вТ53 2 6,67
777777777700001 Нет 1 3,33 Т2
711041003760661 « 1 3,33 LAM 9
711041007740661 « 1 3,33
777741000160771 « 1 3,33
777777607760771 вТ42 1 3,33
777777644020771 Нет 1 3,33 Haarlem 1
000000000503771 « 1 3,33 36
377737670000000 « 1 3,33 34
777000000000371 ЗТ.560 1 3,33 35
были описаны для офлоксацин-резистентных изолятов M. tuberculosis ранее [17, 19]. Однако частота мутаций в участке QRDR среди исследованных изолятов отличается от полученных ранее данных, которые проводились на других выборках. В аналогичных исследованиях мутации в области QRDR гена gyrA были обнаружены у 85-89% среди офлоксацин-устойчивых изолятов МБТ [17, 20, 21], тогда как в исследованной нами выборке только 56,6% офлоксацин-устойчивых изолятов имели мутации в проанализированном регионе гена gyrA. Возможно, исследуемая нами популяция офлоксацин-устойчивых изолятов M. tuberculosis обладает мутациями, расположенными в других областях гена gyrA, оказывающих влияние на конформацию хинолонового кармана.
В проведенном исследовании офлоксацин-устойчивых изолятов МБТ, выявленных в Санкт-Петербурге, не было обнаружено мутаций в области QRDR гена gyrB, ассоциированных с ЛУ. Отсутствие мутаций в регионе gyrB в исследованной популяции штаммов МБТ снижает возможности молекулярно-генетического определения устойчивости к офлоксацину. Возможно, мутации, ответственные за формирование устойчивости к фторхинолонам, расположены в других областях гена gyrB, что необходимо дополнительно изучать. В аналогичном исследовании на территории Северо-Западного региона России мутации в гене gyrB были обнаружены в единичных случаях [17]. Частоты мутаций могут изменяться со временем, поэтому необходимо проводить молекулярно-генетический мониторинг штаммов МБТ.
В результате генетического анализа штаммов МБТ, обладающих устойчивостью к офлоксацину, была показана высокая однородность сполиготипов среди офлоксацин-устойчивых изолятов. К пекинскому семейству (Beijing family) относилось 90% всех исследованных изолятов. Этот факт, скорее всего, является следствием доминирования данного семейства на территории Санкт-Петербурга, описанного в литературе ранее [22].
Помимо пекинского семейства в исследовании были идентифицированы сполиготи-пы, принадлежащие к семействам T1, T2, Т3, T4, LAM9, Haarlem1, 33, 34, 35 и 36.
Доминирование семейства Beijing в рассмотренной выборке офлоксацин-устойчивых штаммов соответствует литературным данным, согласно которым доля семейства Beijing в России составляет более 50%. Например, на Урале в 2005 г. доля семейства Beijing составляла 54,3% [23]. Исследования штаммов M. tuberculosis в Северо-Западном федеральном округе России среди впервые выявленных больных ТБ легких также обнаружили доминирование бактериальных изолятов семейства Beijing (47,1%) [24]. Следует отметить, что в более ранних молекулярно-эпидемиологических исследованиях доля семейства Beijing в России также была высока и в некоторых регионах составляла более 40-50% [25-27].
В Архангельской области в период с 1995 по 199T г. семейство Beijing составляло незначительную часть, около 8,1%, тогда как к 1998 и 1999 гг. его доля равнялась уже 41,9 и 46,1% соответственно [28]. В связи с вышесказанным можно предположить высокую степень передачи штаммов МБТ семейства Beijing по сравнению с другими семействами. Была показана ассоциированность штаммов M. tuberculosis семейства Beijing с устойчивостью к фторхинолонам [16, 29].
Обнаруженная нами закономерность, что для штаммов МБТ семейства Beijing характерна достоверная ассоциированность с множественной и лекарственной устойчивостью и устойчивостью к офлоксацину, хорошо согласуется с литературными данными, полученными по всему миру [23, 30-36]. В статье van Soolingen и соавторов приведены данные о том, что в Европе 85% штаммов МБТ с множественной лекарственной устойчивостью принадлежат к семейству Beijing [36]. По данным S.Y. Kovalev и соавторов [23], семейство Beijing играет ключевую роль в распространении МЛУ-ТБ на Урале. В нашем исследовании 90% офлоксацин-устойчивых штаммов и более 80% штаммов с МЛУ относились к пекинскому семейству. Таким образом, авторы данной статьи еще раз подтвердили, что среди штаммов МБТ семейства Beijing, циркулировавших в Санкт-Петербурге в 2008 г., устойчивость к противотуберкулезным препаратам встречается достоверно чаще, чем среди других семейств. Высокое сходство сполиготипов офлоксацин-резистентных штаммов M. tuberculosis, обнаруженное в данном исследовании (более 70% изолятов имели сполиготип ST1, относящийся к семейству Beijing), позволяет сделать предположение о формировании устойчивости в замкнутой группе пациентов на территории Санкт-Петербурга. Вероятнее всего, исследованные офлоксацин-устойчивые изоляты МБТ не были привнесены из других географических территорий.
* * *
Данное исследование финансировалось за счет средств совместного гранта Федерального агентства по науке и инновациям РФ и Американского фонда гражданских исследований и развития.
Литература
1. Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World Fourth Global Report, the World Health Organization/International Union Against Tuberculosis and Lung Disease (WHO/UNION) Global Project on Anti-Tuberculosis Drug Resistance Surveillance 2002-2007.
2. World Health Organisation. Press release: «WHO Global Task Force outlines measures to combat XDR-TB worldwide». Centers for Disease Control and Prevention. 2006. Revised definition of extensively drug-resistant tuberculosis. MMWR 55:1176.
3. Migliori G. B., D’Arcy Richardson M., Sotgiu G., Lange C. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis in the West. Europe and United States: epidemiology, surveillance, and control // Clin. Chest Med. 2009. Vol. 30. P.637-665.
4. Champoux J. J. DNA topoisomerases: Structure, Function, and Mechanism // Annu. Rev. Biochem. 2001. Vol. 70. P. 369-413.
5. Shen L. L., Pernet A. G. Mechanism of inhibition of DNA gyrase by analogues of nalidixic acid: the target of the drugs is DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. 1985. Vol. 82. P. 307-311.
6. Shen L. L., Kohlbrenner W. E., Weigl D., Baranowski J. Mechanism of quinolone inhibition of DNA gyrase. Appearance of unique norfloxacin binding sites in enzyme-DNA complexes // J. Biol. Chem. 1989. Vol. 264. P. 2973-2978.
7. Shen L. L., Baranowski J., Pernet A. G. Mechanism of inhibition of DNA gyrase by quinolone antibacterials: specificity and cooperativity of drug binding to DNA // Biochemistry. 1989. Vol. 28. P. 3879-3885.
8. Shen L. L., Mitscher L. A., Sharma P. N., O’Donnell T. J. et al. Mechanism of inhibition of DNA gyrase by quinolone antibacterials: a cooperative drug-DNA binding model // Biochemistry. 1989. Vol. 28. P. 3886-3894.
9. Takiff H. E., Salazar L., Guerrero C., Philipp W. et al. Cloning and nucleotide sequence of Mycobacterium tuberculosis gyrA and gyrB genes and detection of quinolone resistance mutations // J. Antimicrob. Agents Chemother. 1994. Vol. 38. P. 773-780.
10. Yoshida H., Bogaki M., Nakamura M., Nakamura S. Quinolone resistance-determining region in the DNA gyrase gyrA gene of Escherichia coli // J. Antimicrob. Agents Chemother. 1990. Vol. 34. P. 1271.
11. Canetti G., Froman S., Grosset J., Hauduroy P. et al. Mycobacteria: laboratory methods for testing drug sensitivity and resistance // Bull. Org. mond. Sante. 1963. Vol. 29. P. 565-578.
12. Van Soolingen D., Hermans P., De Haas P., Soll D., Van Embden J. Occurrence and stability of insertion sequences in Mycobacterium tuberculosis complex strains: evaluation of an insertion sequence-dependent DNA polymorphism as a tool in the epidemiology of tuberculosis // J. Clin. Microbiol. 1991. Vol. 29(11). P. 2578-2586.
13. Huang T. S., Kunin C. M., Shin-Jung Lee S. et al. Trends in fluoroquinolone resistance of Mycobacterium tuberculosis complex in a Taiwanese medical centre: 1995-2003 // J. Antimicrob. Chemother. 2005. Vol. 56. P. 1058-1062.
14. Kamerbeek J., Shouls L., Kolk A., Van Agterveld M. et al. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology // J. Clin. Microbiol. 1997. Vol. 35. P. 907-914.
15. Ginsburg A. S., Sun R., Calamita H. et al. Emergence of fluoroquinolone resistance in Mycobacterium tuberculosis during continuously dosed moxifloxacin monotherapy in a mouse model // Antimicrob. Agents Chemother. 2005. Vol. 49. P. 3977-3979.
16. Duong D.A., Nguyen T.H., Nguyen T.N., Dai V. H. et al. Beijing genotype of Mycobacterium tuberculosis is significantly associated with high-level fluoroquinolone resistance in Vietnam // J. Antimicrob. Agents Chemother. 2009. Vol. 53(11). P. 4835-4839.
17. Mokrousov I., Otten T., Manicheva O. et al. Molecular characterization of ofloxacin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains from Russia // J. Antimicrob. Agents Chemother. 2008. Vol. 52. P. 2937-2939.
18. Sun Z., Zhang J., Zhang X., Wang S. et al. Comparison of gyrA gene mutations between laboratory-selected ofloxacin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains and clinical isolates // Int. J. Antimicrob. Agents. 2008. Vol. 31. P. 115-121.
19. Shi R., Zhang J., Li C., Kazumi Y., Sugawara I. Emergence of ofloxacin resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from China as determined by gyrA mutation analysis using denaturing high-pressure liquid chromatography and DNA sequencing // J. Clin. Microbiol. 2006. Vol. 44(12). P. 4566-4568.
20. Antonova O. V., Gryadunov D. A., Lapa S. A., Kuz’min A. V. et al. Detection of mutations in Mycobacterium tuberculosis genome determining resistance to fluoroquinolones by hybridization on biological microchip // Bull. Exp. Biol. Med. 2008. Vol. 145. P. 108-113.
21. Alcaide F., Telenti A. Molecular techniques in the diagnosis of drug-resistant tuberculosis // Ann Acad Med Singapore. 1997. Vol. 26. P. 647-650.
22. Surikova O. V., Voitech D. S., Kuzmicheva G., Tatkov S. I. et al. Efficient differentiation of Mycobacterium tuberculosis strains of the W-Beijing family from Russia using highly polymorphic VNTR loci // Eur. J. Epidemiol. 2005. Vol. 20 P. 963-974.
23. Kovalev S. Y., Kamaev E. Y., Kravchenko M. A. et al. Genetic analysis of mycobacterium tuberculosis strains isolated in Ural region, Russian Federation, by MIRU-VNTR genotyping // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2005. Vol. 9. P. 746-752.
24. Baranov A. A., Mariandyshev A. O., Mannsaker T. et al. Molecular epidemiology and drug resistance of widespread genotypes of Mycobacterium tuberculosis in northwestern Russia // Int. J. Tuberc. Lung. Dis. 2009. Vol. 13. P. 1288-1293.
25. Норкина О. В., Киншт В. Н., Мокроусов И. В. и др. Генетическое разнообразие Mycobacterium tuberculosis и оценка факторов риска распространения заболевания туберкулезом в Сибирском регионе России методами молекулярной эпидемиологии // Молекулярная генетика, микробиология, вирусология. 2003. №3. С. 9-12.
26. Mokrousov I., Narvskaya O., Otten T., Vyazovaya A. et al. Phylogenetic reconstruction within Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype in northwestern Russia // Res Microbiol. 2002. Vol. 153. P. 629-637.
27. Bifani P. J., Mathema B., Kurepina N. E., Kreiswirth B. N. Global dissemination of the Mycobacterium tuberculosis W-Beijing family strains // Trends Microbiol. 2002. Vol. 10. P. 45-52.
28. Toungoussova O., Sandven P., Mariandyshev A. et al. Spread of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains of the Beijing genotype in the Archangel Oblast, Russia // J. Clin Microbiol. 2002. Vol. 40(6). P.1930-1937.
29. Sun Z., Chao Y., Zhang X., Zhang J., Li Y. et al. Characterization of extensively drug-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates in China // J. Clin. Microbiol. 2008. Vol. 46(12). P. 4075-4077.
30. Kriiiiner A., Hoffner S. E., Sillastu H., Danilovits M. et al. Spread of drug-resistant pulmonary tuberculosis in Estonia // J. Clin. Microbiol. 2001. Vol. 39(9). P. 3339-3345.
31. Caminero J.A., Pena M. J., Campos-Herrero M.I., Rodriguez J. C. et al. Epidemiological evidence of the spread of a Mycobacterium tuberculosis strain of the Beijing genotype on Gran Canaria Island // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2001. Vol. 164(7). P. 1165-1170.
32. Toungoussova O. S., Caugant D. A., Sandven P., Mariandyshev A. O., Bjune G. Drug resistance of Mycobacterium tuberculosis strains isolated from patients with pulmonary tuberculosis in Archangels, Russia // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2002. Vol. 6(5). P. 406-414.
33. Kubica T., Rusch-Gerdes S., Neimann S. The Beijing genotype is emerging among multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains from Germany // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2004. Vol. 8(9). P. 1107-1113.
34. Drobniewski F., Balabanova Y., Nikolayevsky V., Ruddy M. et al. Drug-resistant tuberculosis, clinical virulence, and the dominance of the Beijing strain family in Russia // JAMA. 2005. Vol. 293(22). P. 2726-2731.
35. Lavender C., Globan M., Sievers A. et al. Molecular characterization of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates collected in Australia // Antimicrob. Agents Chemother. 2005. Vol. 49(10). P. 4068-4074.
36. Van Soolingen D., Kremer K. Findings and ongoing research in the molecular epidemiology of tuberculosis // Kekkaku. 2009. Vol. 84(2). P. 83-89.
Статья поступила в редакцию 28 июня 2010 г.
