CC BY
28Клиническая медицина
УДК 616-035.1
© 2011 И.С. Концевая, О.Н. Макурина, В.В. Николаевский
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ GENOTYPE® MTBDRSL В ДИАГНОСТИКЕ ЛЕКАРСТВЕННО УСТОЙЧИВОГО ТУБЕРКУЛЕЗА
В САМАРСКОЙ ОБЛАСТИ
На образцах культур Mycobacterium tuberculosis, полученных от больных туберкулезом Самарской области, с помощью тест-системы GenoType® MTBDRsl (Hain Lifescience, GmbH, Нерен, Германия) изучались мутации в генах M. tuberculosis, ассоциированные с устойчивостью к противотуберкулезным препаратам группы фторхинолонов. Полученные результаты сравнивались со стандартным методом тестирования на лекарственную чувствительность на жидких питательных средах. Высокие показатели чувствительности и специфичности метода (86,2 % и 100 % соответственно), продемонстрированные в нашем исследовании, подтверждают эффективность применимость тест-системы GenoType® MTBDRsl в областях с высокими уровнями распространенности туберкулеза и его лекарственно-устойчивых форм для ускоренной идентификации микобактерий, устойчивых к фторхинолонам.
Ключевые слова: лекарственная устойчивость, фторхинолоны, туберкулез.
Туберкулез (ТБ) остается одной из важнейших проблем здравоохранения во всем мире. По данным Всемирной организации здравоохранения, ежегодно в мире от ТБ погибает около 2 миллионов человек [1]. Считается, что около трети населения Земли являются носителями возбудителя ТБ — Mycobacterium tuberculosis.
Штаммы микобактерий с лекарственной устойчивостью вызывают наиболее тяжело протекающие формы ТБ, при этом лекарственно-устойчивый ТБ сложнее диагностируется и лечится, что обуславливает более высокую летальность по сравнению с лекарственночувствительным ТБ.
Российская Федерация считается страной с высокими уровнями заболеваемости и распространенности ТБ, в том числе, ТБ с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ ТБ), который вызывается микобактериями, устойчивыми к двум основным противотуберкулезным препаратам: «Изониазиду» и «Рифампицину» [2]. Самарская область является районом с неблагополучной обстановкой по заболеваемости ТБ: около 20 % всех впервые выявленных пациентов инфицированы штаммами МЛУ ТБ [3].
В последнее десятилетие в Российской Федерации значительно возросли уровни распространенности ТБ с обширной лекарственной устойчивостью (ОЛУ ТБ), когда микобактерии обладают устойчивостью не только к «Изониазиду» и «Рифампицину», но и к так называемым резервным препаратам: фторхинолонам (ФХ) и инъекционным препаратам [4, 5]. Лечение таких больных представляет особую проблему, а летальность, особенно у больных с со-
четанной ВИЧ/ТБ инфекцией, может достигать 100 %.
В связи с возрастанием доли МЛУ и ОЛУ ТБ в структуре заболеваемости в РФ и, в частности в Самарской области, крайне необходимо развивать и внедрять новые ускоренные методы диагностики лекарственной устойчивости у полученных от пациента микобактерий. Своевременная диагностика лекарственной устойчивости позволяет вовремя назначить адекватную химиотерапию ТБ, что в свою очередь предотвращает распространение лекарственно-устойчивых микобактерий и заражение других людей.
Внедрение в рутинную лабораторную практику автоматизированных систем культивирования бактерий с использованием жидких питательных сред значительно сократило время выполнения тестов на лекарственную чувствительность, однако такие системы достаточно дороги и сложны в обращении, а для получения результата необходимо от 7 до 10 дней [б].
Другим подходом в определении лекарственной чувствительности штаммов микобактерий является детекция мутаций в генах, ассоциированных с устойчивостью к тем или иным противотуберкулезным препаратам. Известно, что устойчивость микобактерий к лекарственным препаратам из группы ФХ определяется мутациями в генах gyrA и gyrB, кодирующих соответственно субъединицы А и В ДНК-гиразы [7]. На детекции мутаций в этих генах, а также в генах, ассоциированных с устойчивостью к другим противотуберкулезным препаратам - «Этамбутолу», аминогликозидам и циклическим пептидам основана недавно разработанная компанией Hain Lifescience (Hain Lifescience, GmbH, Нерен, Германия) тест-система GenoType® MTBDRsl. Ранее высокие показатели чувствительности и специфичности указанной тест-системы были продемонстрированы в странах с низкими уровнями распространенности ТБ [В, 9].
Таким образом, целью нашего исследования было изучение чувствительности и специфичности тест-системы GenoType® MTBDRsl для выявления устойчивости к ФХ («Офлок-сацину» и «Моксифлоксацину») на материале культур M .tuberculosis в регионе (Самарская область) с высокими уровнями заболеваемости ТБ и значительной распространенностью лекарственно-устойчивых форм ТБ.
Материалы и методы. Нами были исследованы изоляты (N=51) M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, полученные от больных ТБ в 200В году. Количество впервые выявленных и получавших лечение в прошлом составило 23 и 2В случаев соответственно. Материалом для посева служила мокрота больных; культивирование микобактерий осуществлялось при помощи автоматизированной системы жидких питательных сред BACTEC 960 (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) по рекомендуемой производителем методике [10]. Фенотипические ТЛЧ к ФХ проводились в системе BACTEC 960 по рекомендуемой производителем методике с использованием следующих концентраций антибиотиков: «Офлоксацин» 2,0 мкг/мл, «Моксифлоксацин» 0,25 мкг/мл [11]. ДНК выделялась из полученной культуры микобактерий методом нагревания при 950С с последующей обработкой ультразвуком в течение 15 минут.
Идентификация полученной культуры, а также молекулярно-генетическое определение чувствительности к противотуберкулезным препаратам производились с помощью тест-системы GenoType® MTBDRsl согласно рекомендациям производителя. Прочтение и интерпретация результатов проводились независимо двумя операторами, не знакомыми с результатами фенотипического ТЛЧ. Если исследуемый образец давал плохой результат на тест-
системе GenoType® MTBDRsl, тест повторялся еще раз, и если результат не улучшался, он учитывался как нечитаемый.
Статистический анализ данных проводился с использованием критерия Фишера с уровнем значимости P=0,05.
Результаты и обсуждение. Фенотипически устойчивость к ФХ была определена у 32 из 51 исследуемого МЛУ ТБ штамма (б2,7 %). Между результатами чувствительности к «Офлоксацину» и «Моксифлоксацину» было полное совпадение, что подтверждает хорошо известное явление перекрестной устойчивости к препаратам группы ФХ.
Из 51 протестированного с помощью системы GenoType® MTBDRsl штамма 4В дали читаемый результат, что составило 94,1 %. Устойчивость к ФХ по результатам молекулярногенетических тестов была выявлена у 25 из 32 фенотипически устойчивых штаммов. У 3 штаммов были определены смешанные генотипы: присутствовали и дикие, и мутантные аллели гена gyrA. Согласно рекомендациям производителя, такие штаммы были интерпретированы как устойчивые к ФХ. Четыре фенотипически устойчивых штамма не имели мутаций в гене gyrA, тогда как фенотипические результаты и результаты MTBDRsl для чувствительных штаммов полностью совпали.
В целом чувствительность и специфичность тест-системы GenoType® MTBDRsl по сравнению со стандартным методом ТЛЧ составила Вб,2 и 100 % соответственно. Тем не менее, результаты молекулярно-генетического метода для трех фенотипически устойчивых штаммов (5,9 %) остались нечитаемыми даже после двух повторов.
Наши данные согласуются с предыдущими исследованиями, показывающими эффективность применения тест-системы GenoType® MTBDRsl в областях с высокими уровнями лекарственной устойчивости, особенно, первоначального скрининга пациентов и экспресс-диагностики случаев ОЛУ ТБ [12].
Одним из факторов, лимитирующих чувствительность тест-системы GenoType® MTBDRsl, является ограниченное количество ДНК-проб и генов, включенных в тест-систему. Так, 4 фенотипически устойчивых штамма, давшие чувствительный результат на системе GenoType® MTBDRsl, могут иметь мутации в других кодонах гена gyrA или в гене gyrB, не исследуемых тест-системой GenoType® MTBDRsl, что дало разногласие между фенотипическим и молекулярным результатами.
Таким образом, можно сделать вывод, что тест-система GenoType® MTBDRsl является достаточно точной и быстрой методикой определения устойчивости бактерий M. tuberculosis к ФХ со 100 % специфичностью (несмотря на то, что 5,9 % анализируемых штаммов не дали читаемого результата), однако для подтверждения ее результатов и исключения случаев ОЛУ ТБ по-прежнему необходимы основанные на культивации микобактерий бактериологические методы диагностики.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Organization W.H., Anti-tuberculosis drug resistance in the world, fourth global report. World Health Organization: Geneva, Switzerland, 200В.
2. Drobniewski F., et al. Drug-resistant tuberculosis, clinical virulence, and the dominance of the Beijing strain family in Russia. Jama, 2005. 293(22): p. 272б-31.
3. Nikolayevsky V. et al. Detection of mutations associated with isoniazid and rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates from Samara Region, Russian Federation. J Clin Microbiol, 2004. 42(10): p. 4498-502.
4. Punga V.V. et al. Prevalence of extensively drug-resistant tuberculosis in Vladimir and Orel regions, Russia. Int J Tuberc Lung Dis, 2009. 13(10): p. 1309-12.
5. Balabanova Y. et al. Survival of civilian and prisoner drug-sensitive, multi- and extensive drug- resistant tuberculosis cohorts prospectively followed in Russia. PLoS One, 2011. 6(6): p. e20531.
6. Piersimoni C. et al. Current perspectives on drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis complex: the automated nonradiometric systems. J Clin Microbiol, 2006. 44(1): p. 20-8.
7. Von Groll A. et al. Fluoroquinolone resistance in Mycobacterium tuberculosis and mutations in gyrA and gyrB. An-timicrob Agents Chemother, 2009. 53(10): p. 4498-500.
8. Brossier F. et al. Detection by GenoType MTBDRsl test of complex mechanisms of resistance to second-line drugs and ethambutol in multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis complex isolates. J Clin Microbiol, 2010. 48(5): p. 1683-9.
9. Hillemann D., S. Rusch-Gerdes, and E. Richter, Feasibility of the GenoType MTBDRsl assay for fluoroquinolone, amikacin-capreomycin, and ethambutol resistance testing of Mycobacterium tuberculosis strains and clinical specimens. J Clin Microbiol, 2009. 47(6): p. 1767-72.
10. Ministry of Health of the Russian Federation, P., Prikaz of the Ministry of Health of the Russian Federation # 109 from 21 March 2003 "On improvement of TB control activities in the Russian Federation".
11. Kruuner A., M.D. Yates, and F.A. Drobniewski, Evaluation of MGIT 960-based antimicrobial testing and determination of critical concentrations of first- and second-line antimicrobial drugs with drug-resistant clinical strains of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol, 2006. 44(3): p. 811-8.
12. Mokrousov I. et al., Molecular characterization of ofloxacin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains from Russia. Antimicrob Agents Chemother, 2008. 52(8): p. 2937-9.
