CC BY
35DOI https://doi.org/10.47612/1999-9127-2022-33-102-108 УДК 575.174.4+575.162
Е. Л. Романишко, А. И. Киреева, М. Е. Михайлова, Р. И. Шейко
ВЫЯВЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ДЕФЕКТА ДУПЛИКАЦИЯ РАЗВИТИЯ (DD) В БЕЛОРУССКОЙ ПОПУЛЯЦИИ АБЕРДИН-
АНГУССКОГО СКОТА
Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: lenaramanishko@mail.ru
Дупликация развития (DD) — моногенное аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное неполной пенетрантностью и вариабельной экспрессивностью гена NHLRC2 у абердин-ангусской породы крупного рогатого скота, приводящее к появлению телят с удвоением внутренних органов или конечностей. Согласно литературным данным, частота мутаций, обуславливающих дупликацию развития у абердинов очень высокая (выше 20%). Методом ПЦР-ПДРФ был исследован однонуклеотидный полиморфизм (SNP) g.34618072T > C в гене NHLRC2, вызывающий дупликацию развития. Нами проведен скрининг выборки из белорусской популяции абердин-ангусского крупного рогатого скота (n = 170 гол.), который не выявил животных-носителей мутантного аллеля (DDC) как среди исследованных коров, так и среди быков.
Ключевые слова: ДНК-тестирование, генетический дефект, дупликация развития, NHLRC2, SNP, КРС, абердин-ангусская порода.
Введение
В Беларуси выращивание и откорм крупного рогатого скота (КРС) на мясо является второй после молочной отраслью животноводства. По породной принадлежности маточное поголовье основное стада мясного скота состоит из пород: абердин-ангусской — 37%, гере-фордской — 31%, лимузинской — 30% и ша-ролезской — 2%. В популяции КРС мясного направления, так же как и у молочного скота, часто встречаются генетические дефекты [1], которые могут нанести серьезный экономический ущерб животноводству. Одним из таких дефектов является полимелия, или дупликация развития (Developmental Duplications, DD) [2].
Дупликация развития (DD) — моногенное аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное неполной пенетрантностью и вариабельной экспрессивностью гена NHLRC2 у абердин-ангусской породы. Данный генетический дефект приводит к появлению телят с удвоением внутренних органов или конечностей. Во всем мире были зарегистрированы спорадические случаи полимелии как у Bos taurus, так и у Bos indicus. Данная аномалия развития относится к генетическим дефек-
там II класса, которые не являются летальными, но имеют крайне нежелательные проявления, так как требуют дополнительных затрат на лечение больных животных. Телятам с проявлением DD требуется хирургическое вмешательство, без которого они не могут нормально развиваться и в зависимости от тяжести аномалии, могут умереть в первые месяцы жизни. Первые случаи дефекта не связывали с генетикой, а посчитали результатом сращивания близнецов во время эмбрионального развития. Однако частота встречаемости этого врожденного дефекта у телят ангусской породы была значительно выше вероятности наступления случайного события, что позволило предположить возникновение наследственного дефекта. В результате проведения широкомасштабных исследований выявлено, что это заболевание является следствием генетического дефекта и относится к моногенному рецессивному признаку. Мутантный аллель гена NHLRC2, ассоциированный с дефектом DD, передается от животных-носителей данной мутации и идентифицируется у ангусов и других помесных пород, полученных в результате скрещивания животными ангусской породы. Пер-
выми носителями мутантного аллеля считают родившихся в 1977 г. потомков быка US AI sire, Ken Caryl Mr Angus 8017. В Австралии почти все выявленные животные, скрытые носители наследственного дефекта дупликации развития, являются потомками быка US Angus, B/R New Design 036. Спорадические случаи полимелии были зарегистрированы и у других пород, включая Bos indicus, но пока неизвестно, являются ли эти случаи результатом одной и той же мутации [3-6].
Генетический дефект дупликация развития у абердин-ангусской породы КРС был картирован на 26 хромосоме (OMIA: 002103-9913) [7]. Причиной DD является однонуклеотидный полиморфизм (SNP) g.34618072T > C в гене NHLRC2, содержащем повторы NHL, который приводит к аминокислотной замене валина на аланин в 311 позиции (V311A). Такая аминокислотная замена, вероятно, приводит к образованию функционально неактивного белка, который, по всей видимости, регулирует транскрипцию генов во время нейруляции [8, 9]. Заболевание наследуется по простому рецессивному типу наследования с неполной пенетрантностью (54%), в то время как 46% от ожидаемого числа гомозигот визуально не имеют фенотипических признаков генетического дефекта, но при этом имеют субклинические поражения, характерные для полиме-лии, и могут проявиться в более позднее время [5, 10]. Дупликация развития является следствием дефекта эмбриональной нейруляции, включающей как черепной, так и спиналь-ный дизрафизм (расщепление дужек позвонков). Гомозиготные телята рождаются с дополнительными конечностями (с одной или несколькими), как правило, дублируется передняя нога, прикрепленная вдоль спинной срединной линии. Кроме того, встречается черепно-лицевой дисморфогенез (craniofacial dysmorphogenesis) различной степени тяжести (от нарушений размеров челюсти до че-репно-лицевого дублирования), а также могут возникать нарушения механизмов деления клеток соединительных тканей, приводящие к развитию доброкачественных новообразований, таких как зрелые тератомы, липомы, дермоидные кисты. Основными экономическими последствиями этого дефекта являются потери от затруднения отела (высокая смерт-
ностью телят) и стоимость хирургических ампутаций, которые необходимы для последующего нормального развития гомозиготных телят. ДНК-тестирование исследованных животных ангусской породы не выявило значительной части гомозиготных больных телят, что дает основание предполагать их гибель на ранних этапах эмбрионального развития [11], что приводит к экономическим потерям в животноводстве.
В 2013 году анализ базы данных Angus Australia показывал, что более 15% зарегистрированного в настоящее время КРС ангу-ской породы являлись носителями мутации DD (GeneProb) [5]. Обзор базы данных Американской ассоциации ангусов показал, что в 2017-2018 гг. частота животных-носителей дупликации развития составляла более 20% [10]. В связи с высокой частотой встречаемости в мировой популяции ангусов мутантного аллеля гена NHLRC2, обусловливающего генетический дефект дупликация развития, существует риск распространения данной патологии и среди абердин-ангусского скота в Беларуси.
Согласно Положению о порядке проведения молекулярной генетической экспертизы племенной продукции государств — членов Евразийского экономического союза (№ 74 от 02.06.2020 г.), рекомендовано проводить исследование биологического материала животных абердин-ангусской породы на выявление генетически детерминированного заболевания — дупликации развития. Поскольку отсутствуют данные по распространенности генетического дефекта DD в белорусской популяции, то целью нашего исследования является разработка ДНК-технологии выявления мутантного аллеля гена NHLRC2, вызывающего дупликацию развития и выявление животных-носителей данного генетического дефекта в белорусской популяции абердин-ангусского скота.
Материалы и методы
В качестве объекта исследования был использован крупный рогатый скот абердин-ан-гусской породы (n = 170 гол.). Материалом для исследования служила ДНК, выделенная из биологического материала: цельной крови, проб ткани (ушной выщип) и спермы. Выделение ДНК проводили набором реагентов «Ну-клеосорб» («Праймтех», Беларусь). Количе-
ство выделенной ДНК определяли с помощью флуориметра DeNovix DS 11 FS с использованием набора реагентов для измерения концентрации ДНК DeNovix dsDNA Broad Range Kit (DeNovix, США). Для ДНК-идентификации дупликации развития абердин-ангусского скота были использованы следующие методы:
ПЦР-ПДРФ и секвенирование по Сэнгеру для валидации метода (табл. 1).
ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция — полиморфизм длин рестрикционных фрагментов)
Полимеразную цепную реакцию проводили на приборе С-1000 (Bio-Rad, США). Дизайн
Таблица 1
ДНК-идентификация наследственного заболевания у абердин-ангусского скота
Наследственное заболевание Ген Хромосома Локализация Тип мутации Метод
Дупликация развития (DD) (полимелия) NHLRC2 26 g.34618072 экзон 5 932T>C, (Val311Ala) ПЦР-ПДРФ/ секвенирование
праймеров для получения специфичных фрагментов гена NHLRC2 длиной 199 п. н. осуществлялся с помощью программы Primer 3. Анализ нуклеотидной последовательности гена NHLRC2 проводили с помощью Ensembl в форматах FASTA.
ПЦР в объеме 20 мкл реакционной смеси содержала: 5 х ПЦР буфер (+MgCl2), по 0,5 мкМ каждого праймера, 0,2 мМ dNTP, 1U ДНК-полимеразы, деионизированную MQ-H2O и 10 нг геномной ДНК. Полимеразную цепную реакцию проводили по программе: 95 °С — 3 мин; 95 °С — 30 сек, 60 °С — 50 сек, 72 °С — 1 мин (35 циклов). Для анализа рестрикционных фрагментов использовали 1 ед. эндонуклеазы HpyF10VI.
Детекцию продуктов ПЦР проводили в 3% агарозном геле (SeaKem LE Agarose, «Lonsa») с интеркалирующим красителем ZUBR Green-1 («Праймтех», Беларусь), относительно маркера длины ДНК, SM1233 («Thermo scientific», EU) и контрольного образца. Анализ и учет полученных результатов ПЦР фрагментов гена NHLRC2 осуществляли с помощью системы гель-документирования Quantum ST4 («Vilber lourman», Франция).
Секвенирование по Сэнгеру
Методом прямого секвенирования последовательности ДНК проверена специфичность полученных фрагментов гена NHLRC2. ПЦР-продукты контрольных образцов изучаемого локуса гена вырезали из геля и очищали с помощью набора реагентов Silica Bead
DNA Gel Extraction Kit («Thermo scientific», Литва). Для постановки секвенирующей ПЦР использовали Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. Секвенирующую ПЦР проводили согласно следующим условиям: 96 °С — 1 мин; 25 циклов: 96 °С — 10 сек, 50 °С — 5 сек, 60 °С — 4 мин; 16 °С — 5 мин. ПЦР-продукты после секвенирующей ПЦР очищали от непрореагировавших флуоресцентно-меченых терминаторных нуклеотидов переосаждением этанолом/№2ЭДТА. Определение нуклеотидной последовательности ДНК проводили на приборе 3500 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США).
Результаты исследования
С помощью разработанной нами методики была исследована выборка (n = 170 гол.) крупного рогатого скота абердин-ангусской породы 3-х популяций Гомельской (n = 34 гол.), Минской (n = 68 гол.) и Брестской (n = 68 гол.) областей Республики Беларусь. Визуализация результатов ПЦР-ПДРФ анализа с помощью системы гель-документирования представлена на рисунке 1.
Размер полученных ПЦР-фрагментов исследованных образцов оценивали относительно маркера длины ДНК и ПКО (рис. 1). У здоровых животных два нормальных аллеля гена NHLRC2 (гомозигота) на электрофореграм-ме визуализируется одна полоса размером 199 п. н. (DDF). У животных-носителей мутации (гетерозигота), на электрофореграмме ви-
Рис. 1. Электрофореграмма ПЦР-продуктов локуса гена NHLRC2: М — маркер длины ДНК, SM1123; 1-8 — здоровые животные (DDF), ПЦР-продукт 199 п. н.; 9-ПКО — животное-носитель мутации (DDC); 10 — контроль
без матрицы (NTC)
зуализируются три полосы 199 п. н., 107 п. н. и 92 п. н. (DDC). Контрольный образец любезно предоставлен сотрудниками Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный исследовательский центр животноводства — ВИЖ имени академика Л. К. Эрнста».
Согласно рекомендации American Angus Association, животные с аллелями дикого типа гена NHLRC2 обозначают DDF (свободные от мутации, здоровые). Животные-носители
мутантного аллеля в гетерозиготе обозначают DDC (носители мутации) и фенотипически ничем не отличаются от животных DDF. Животные-носители мутантных аллелей в гомозиготе, обуславливающих наследственное заболевание дупликацию развития, обозначают DDA [12].
Генотипирование референтных образцов показало полное совпадение результатов, полученных с помощью методов ПЦР-ПДРФ и секвенирования по Сэнгеру (рис. 2).
В исследованной выборке, отобранной из 7
Рис. 2. Результаты секвенирования 1— гомозиготное здоровое животное (DDF), 2 — животное-носитель мутант-
ного аллеля (DDC) гена NHLRC2
хозяйств, республики не выявлено животных, несущих мутантный аллель гена NHLRC2 как среди быкопроизводящих коров, так и среди быков-производителей (табл. 2).
В исследовании Коноваловой и соавт. (2018 г.) скрининг 10 популяций абердин-ангусов из различных субъектов Российской Федерации (п = 1 342 гол.) выявил 0,9-12,8% животных-носителей мутантного аллеля гена NHLRC2 [10]. Обзор базы данных Американской ассоциации абердин-ангусской породы показал, что из выборки (п = 4 645 гол.) в 2017 году частота встречаемости животных-носителей DD составила более 20,4% [13]. В 2019 году исследование 2 585 голов КРС абердин-ан-гусской породы, в том числе 2 244 быков, 341
коровы, выявило животных-носителей DD, во всех исследованных группах с частотой 0,7-38,2% [14].
По литературным данным показана высокая частота встречаемости животных-носителей мутантного аллеля исследуемого локуса гена NHLRC2 в популяциях ангусов в разных странах [3-14]. Генотипирование КРС абердин-ангусской породы в Республике Беларусь не проводилось и, соответственно, отсутствовали данные по распространению генетического дефекта DD в белорусской популяции. С использованием разработанной ДНК-технологии выявления мутантного аллеля гена NHLRC2, детерминирующего дупликацию развития, было протестировано 170 голов КРС
Таблица 2
Результаты ДНК-тестирования выборки из популяции абердин-ангусского крупного рогатого скота (п=170 гол.) для выявления животных-носителей мутантного аллеля гена NHLRC2, вызывающего дупликацию развития (DD)
Область Хозяйство Кол-во протестированных жив., гол. Частота свободных от мутации здоровых животных ^Б), % Частота животных- носителей мутантного аллеля ^С), %
Всего Быков Коров Всего Быков Коров Всего Быков Коров
Гомельская Агро-Лясковичи 31 15 16 100 100 100 - - -
Гомельго сплемпредприятие 3 3 - 100 100 - - - -
Минская Трайпл-Агро 7 - 7 100 - 100 - - -
КФХ «Весна-агро» 61 34 27 100 100 100 - - -
Брестская Молодово-Агро 33 - 33 100 - 100 - - -
Агро-Мотоль 24 - 24 100 - 100 - - -
Брестплемпредприятие 11 11 - 100 100 - - - -
из 7 сельскохозяйственных предприятий республики. В исследуемой популяции животных-носителей мутантного аллеля (DDC) выявлено не было. Для получения более полных данных о наличии и распространении генетического дефекта DD в поголовье абердин-ан-гусского скота белорусской селекции исследования будут продолжены на более широкой выборке животных.
Заключение
Внедрение методов ДНК-диагностики в практику животноводства позволяет повышать экономическую эффективность отрасли за счет понижения эмбриональной смертности телят путем исключения животных-носителей рецессивных наследственных аномалий из популяций сельскохозяйственных животных.
Разработанная нами методика выявления мутантного аллеля гена NHLRC2, вызывающе-
го дупликацию развития, позволила провести исследование выборки из белорусской популяции абердин-ангусского скота из трех областей Республики Беларусь. Животных носителей мутантного аллеля моногенного аутосомно-ре-цессивного заболевания дупликации развития в исследованной выборке из белорусской популяции ангусского скота не выявлено. В дальнейшем будет продолжено ДНК-типирование абердин-ангусского крупного рогатого скота для получения полных данных о распространении генетического дефекта дупликации развития данного поголовья. Учитывая повсеместное использование искусственного осеменения спермой лучших быков-производителей и высокую частоту данного генетического дефекта, которая в разных странах варьирует от 0,7 до 38,2%, существует вероятность распространения дупликации развития в белорусской популяции. Разработанная ме-
тодика позволяет проводить молекулярно-ге-нетическую экспертизу племенной продукции (животные, эмбрионы, сперма) в Республике Беларусь, в порядке установленном международно-правовыми актами, составляющими право Евразийского экономического союза, с целью предупреждения распространения дупликации развития среди племенных животных абердин-ангусской породы КРС.
Работа выполнена при финансовой поддержке ГП «Наукоемкие технологии и техника» на 2016-2020 годы, подпрограммы 1 «Инновационные биотехнологии-2020», мероприятие 2ИБ «Разработать ДНК-технологию идентификации полиморфных вариантов генов, влияющих на репродуктивные признаки, с целью повышения воспроизводительной способности КРС мясного направления».
Список использованных источников
1. Романишко, Е. Л., Михайлова, М. Е., Ки-реева, А. И. Выявление гаплотипов фертиль-ности в белорусской популяции крупного рогатого скота голштинской породы / Е. Л. Романишко, М. Е. Михайлова, А. И. Киреева, Р. И. Шейко // Молекулярная и прикладная генетика. - 2021. - Т. 31. - С. 7-21.
2. Beever, J. E., Marron, B. M., Parnell P. F. Developmental Duplications (DD): 1. Elucidation of the underlying molecular genetic basis of polymelia phenotypes in Angus cattle // J. E. Beever, B. M. Marron, et all // P. F. Parnell. Proc. XXVIII World Buiatrics Congress, Cairns Australia. - 2014.
3. Denholm, L. J., Martin, L. E. Polymelia (supernumerary limbs) in Angus calves Flock and Herd case notes. - 2011. Электронный ресурс: http://www.flockandherd.net.au/cattle/reader/ polymelia.html
4. A number of different congenital anomalies are known to occur in domestic cattle / M. R. Alam, J. I. Lee, H. B. Lee, et all. // Veteri-narni Medicina. - 2007. - № 52 (5). - Р. 202-206.
5. Denholm, L. J., Martin, L. E. Developmental duplications in Angus calves Flock and Herd case notes. - 2013. Электронный ресурс: http:// www. flockandherd .net. au/cattl e/reader/devel op-mental-duplication-angus.html
6. McClure M. Genetic Disease and Trait Information for IDB / M. McClure, J. McClure //
Genotyped Animals in Ireland. - 2016. - 43 p.
7. Электронный ресурс: https://omia.org/ OMIA002103/9913/
8. Denholm, L. J., Martin, L. E., Teseling, C. F., Parnell, P. F., Beever, J. E. Developmental Duplications (DD): 2. Mutation of the NHLRC2 gene causes neural tube defects in Angus cattle with multiple congenital malformation phenotypes that include axial and limb duplications, heter-opagus conjoined twins, midbrain and forebrain malformations including pseudoholoprosenceph-alon, craniofacial dysmorphogenesis, microphthalmia, diprosopus, embryogenic teratomas, der-moid cysts, myolipomas, split cord malformation and cranial and spinal dysraphism. // Proc. XXVIII World Buiatrics Congress, Cairns Australia.
- 2014. - Abstract 0100.
9. DNA analysis of the Russian populations of Aberdeen Angus, Hereford and Belgian Blue cattle / L. N. Konovalova, O. S. Romanenkova, V. V. Volkova et all. // Archives Animal Breeding.
- 2020. - № 63(2). - Р. 409-416.
10. Коновалова, Е. Н. ДНК-диагностика генетического дефекта дупликации (DD) у крупного рогатого скота абердин-ангусской породы / Е. Н. Коновалова, О. В. Костюнина // Молочное и мясное скотоводство. - 2018. - № 4. -С.20-24.
11. Тестирование на носительство наследственных заболеваний крупного рогатого скота абердин-ангусской породы // Министерство сельского хозяйства Российской Федерации Россельхознадзор Федеральное Государственное бюджетное учреждение «Всероссийский Государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ») Электронный ресурс: https://www.vgnki.ru/assets/files/ broshyura-o-testah-aberdin-angusskoj-porody.pdf
12. Электронный ресурс : https://www.angus.org
13. Konovalova E. N. Genetic defects of beef cattle and necessity of their managing // RJOAS.
- 2017. - № 8(68). - P. 254-259.
14. Коновалова Е. Н., Костюнина О. В. Распространение генетических дефектов множественного артрогрипоза (AM) и дупликации развития (DD) среди российских популяций крупного рогатого скота абердин-ангусской породы. Генетика и разведение животных. 2019. - № 1. - С. 16-21.
E. L. Ramanishka, M. E. Mikhailova, A. I. Kireyeva, R. I. Sheyko
IDENTIFICATION OF THE GENETIC DEFECT OF DEVELOPMENTAL DUPLICATION (DD) IN THE BELARUSIAN POPULATION OF ABERDEEN ANGUS CATTLE
State Scientific Institution "Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus" 27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, Republic of Belarus e-mail: lenaramanishko@mail.ru
Developmental duplication (DD) is a monogenic autosomal recessive disease with incomplete penetrance and variable expressivity of Aberdeen Angus cattle, resulting in calves with twice the number of various organs and limbs of the animal. According to the literature, the frequency of mutations that cause developmental duplications in Aberdeen is high (above 20%). Single nucleotide polymorphism (SNP) g.34618072T > C in the NHLRC2 gene, which causes developmental duplication, was studied by PCR-RFLP. We screened a sample from the Belarusian population of Aberdeen-Angus cattle (n = 170 heads), which did not reveal animals carrying the mutant allele (DDC) both among the studied cows and among bulls.
Keywords: DNA testing, genetic defect, duplication developmental, NHLRC2, SNP, cattle, Aberdeen Angus.
Дата поступления в редакцию: 02 сентября 2022 г.
