CC BY
128
ЗООТЕХНИЯ И ВЕТЕРИНАРИЯ
]
DOI: 10.24411/0235-2451-2018-10215
УДК 636.2
ГЕНЕТИЧЕСКИМ ДЕФЕКТ МНОЖЕСТВЕННОГО АРТРОГРИПОЗА И ЕГО ДНК-ДИАГНОСТИКА У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА АБЕРДИН-АНГУССКОЙ ПОРОДЫ*
Е.Н. КОНОВАЛОВА, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник (e-mail: konoval-elena@ yandex.ru)
О.В. КОСТЮНИНА, доктор биологических наук, руководитель лаборатории
О.С. РОМАНЕНКОВА, кандидат биологических наук, научный сотрудник
Федеральный научный центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста, пос. Дубровицы, 60, Подольский р-н, Московская обл., 142132, Российская Федерация
Резюме. Множественный артрогрипоз (АМ) - один из летальных генетических дефектов, наносящих серьезный экономический ущерб мясному скотоводству. Это врожденное наследственное заболевание крупного рогатого скота, характерное для молочных и мясных пород. Причиной заболевания животных абердин-ангусской породы служит обширная делеция (23347 п.о.) генов ISG15, HES4 и AGRN. Нашей целью была разработка молекулярно-генетической тест-системы для диагностики мутации этих генов на основе метода мультиплексной однопро-бирочной аллель-спецефичной ПЦР (STAS PCR). Материалом исследования служили пробы ДНК телят, бычков, телок, коров и быков пяти популяций (n=1205) абердин-ангусской породы: I (n=282), II (n=101), III (n=731), IV(n=60), V(n=31) и одной смешанной популяции (гибрид калмыцкой и абердин-ангусской пород) - VI (n=37), принадлежащих хозяйствам Ленинградской (I, IV), Калужской (V), Смоленской (VI), Брянской (III) и Воронежской (II) областей. Проведенный при помощи разработанной тест-системы скрининг, позволил выявить животных-носителей мутантного аллеля в одной популяции коров (II) с частотой 0,99 % и в двух популяциях быков (I и III) с частотами 1,06 и 0,94 %, соответственно. Обзор данных зарубежных породных ассоциаций за 2017 г. показал, что частота встречаемости АМС-животных остается достаточно высокой (20,7-29,2 % у коров и 1,2-10,7 % у быков) и имеет тенденцию к росту - по сведениям Американской ассоциации абердин-ангусской породы в текущем 2018 г. величина этого показателя возросла у коров с 15,5 % в 2017 г. на 5,2 %, у быков - с 0 до 1,2 %. Разработанная тест-система дает возможность раннего выявления животных-носителей АМ, что позволит снизить риск распространения множественного артрогрипоза на территории России.
Ключевые слова: крупный рогатый скот, генетический дефект, множественный артрогрипоз, АМ, абердин-ангусская порода. Для цитирования: Коновалова Е.Н., Костюнина О.В., Романен-кова О.С. Генетический дефект множественного артрогрипоза и его ДНК-диагностика у крупного рогатого скота абердин-ангусской породы//Достижения науки и техники АПК. 2018. Т. 32. №2. С. 58-61. D0I:10.24411/0235-2451-2018-10215.
Одна из задач Государственной программы развития сельского хозяйства на 2013-2020 гг. - развитие мясного скотоводства. Важнейшую роль в ее выполнении играет племенная база, практически заново сформированная с использованием лучших племенных ресурсов [1], в том числе импорта крупного рогатого скота мясного направления продуктивности.
Особый интерес представляют абердин-ангусская, герефордская и лимузинская породы. Благодаря прекрасным акклиматизационным способностям животные этих пород хорошо приспособлены к различным погодным условиям и обладают такими ценными качествами, как быстрое физиологическое и хозяйственное созревание, хорошие воспроизводительные способности, а также высокий генетический потенциал по показателям мясной продуктивности [2].
Однако практически у всех мясных пород зарубежной селекции выявлены генетические дефекты, проявление которых может нанести серьезный экономический ущерб [3]. Один из летальных генетических дефектов крупного рогатого скота - врожденный множественный артрогрипоз (Аг^годпров^ тиШр!ех, АМ). Это симптоматический термин, обозначающий наследственное заболевание, характеризующееся артрогрипозом (от греч. «изогнутые» или «крючковатые» суставы) или множественной контрактурой суставов более чем одной части тела [4]. Характерными клиническими признаками служат аномальный изгиб спины (сколиоз или кифоз), мышечная гипоплазия, реже встречается умеренная гидроцефалия (рис. 1). Больные телята рождаются мертвыми или умирают вскоре после рождения [5].
Это заболевание встречается у крупного рогатого скота как молочных, так и мясных пород. В обоих случаях
«К
/ЧИЖ
f Wi
Ш
Л
Рис. 1. Мертворожденный теленок с признаками множественного артрогрипоза (АдегИо!т J.S., 2016): а - видимые клинические проявления, Ь - результат компьютерной томографии.
*Работа проведена в рамках выполнения задания Федерального агентства научных организаций (ФАНО) ГЗ № 06002018-0014 по теме: «Изучение структурной и функциональной изменчивости животных и птиц на основе использования ДНК-маркеров с целью оценки аллельного биоразнообразия и идентификации ценных генотипов для внедрения в селекционный процесс» (0600-2018-0014).
его причины обусловлены генными мутациями, для которых характерен простой рецессивный тип наследования (дефектный аллель - рецессивный). В связи с этим, для проявления заболевания животное должно унаследовать два дефектных аллеля.
У крупного рогатого скота молочного направления продуктивности множественный артрогрипоз был впервые зарегистрирован в 2016 г. у животных красной датской породы. Установлено, что дефект возникает в результате делеции одной пары нуклеотидов (c.55delG) в первом экзоне гена холинергического рецептора никотиновой субъединицы бета 1 CHRNB1 (OMIA 002022-9913). Мутация вызывает образование незрелого стоп-кодона (p.Ala19Profs47) во втором экзоне гена, что приводит к потере синтеза 96 % белка и повреждению функции ацетилхолиновых рецепторов (AChRs) плода [6].
История заболевания у крупного рогатого скота мясного направления продуктивности начинается с 2002 г., когда у одной пары телят-полусибсов абердин-ангусской породы наблюдали признаки множественного артрогри-поза, но из-за отсутствия информации о происхождении этих животных патологию не посчитали пороком развития [7]. Повторный случай заболевания был зарегистрирован в той же популяции в 2006 г., а в 2008 г. признаки заболевания наблюдали уже у 48 телят. Множественный артрогрипоз был признан генетическим заболеванием 16 сентября 2008 г. [8]. Научная группа под руководством Beever J. установила, что его причиной у ангусского скота служит обширная делеция (23347 п.о.), охватывающая три гена (полностью удаляется ген убиквитино-подобного модификатора (ISG15), 5' регуляторный регион гена волос и усилителя расщепления (HES4) и/или два первых экзона гена агрина (AGRN)) (OMIA 002135-9913) [9]. В результате сильно снижается или полностью прекращается синтез ацетилхолиновых рецепторов и других постсинап-тических белков на мышечных волокнах, необходимых для формирования и поддержания нервно-мышечного взаимодействия. С помощью анализа ДНК и изучения родословных больных телят и животных с гаплотипом АМС был выявлен общий предок-носитель дефекта - бык GAR Precision 1680 (регистрационный № 11520398) [10].
Таким образом, несмотря на различную природу мутаций у молочного и мясного скота, в результате возникает нарушение передачи нервных импульсов, что обусловливает внутриутробную потерю подвижности плода и проявление клинических признаков болезни после рождения.
Экономический ущерб от множественного ар-трогрипоза обусловлен падежом телят. Для профи-
лактики заболевания необходимо раннее выявление животных-носителей дефекта АМ и предотвращение их спаривания между собой [10]. Сейчас частота встречаемости таких особей среди мясных пород крупного рогатого скота достаточно высока [10-12], что требует поиска мер по профилактике распространения этого дефекта.
Цель исследования - разработка молекулярно-генетической тест-системы для выявления скрытых носителей мутации, обусловливающей возникновение множественного артрогрипоза, и изучение распространения этой мутации в популяциях мясного скота России.
Условия, материалы и методы. При выполнении работы использовали оборудование Центра коллективного пользования научным оборудованием «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ФГБНУ ФНЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста. Материалом для исследования служили пробы ДНК крупного рогатого скота (п=1205) из пяти популяций чистопородной абердин-ангусской породы: I (п=282), II (п=101), III (п=731), IV (п=60), V (п=31) и одной смешанной популяции (гибрид калмыцкой и абердин-ангусской пород) VI (п=37) из Ленинградской (I, IV), Калужской (V), Смоленской (VI), Брянской (III) и Воронежской (II) областей. ДНК выделяли из образцов биоматериала животных (ушной выщип, сперма и кровь) при помощи наборов «ДНК-Экстран-1» и «ДНК-Экстран-2» (ЗАО «Синтол», Россия) согласно прилагаемым инструкциям.
На основании сведений о нуклеотидной последовательности делеции [9] была разработана тест-система для идентификации мутантного аллеля, ассоциированного с АМ. Подбор праймеров для амплификации целевых фрагментов ДНК осуществляли с использованием программного обеспечения Рптег3Р1ив [13]. Амплификацию проводили в соответствии с методическими рекомендациями Зиновьевой Н.А. [14]. Полученные фрагменты ДНК фиксировали на электрофореграмме в 2 %-ном агарозном геле.
Результаты и обсуждение. Дизайн праймеров был разработан так, что у животных, свободных от мутации, в ходе ПЦР была предусмотрена амплификация только нормального аллеля длиной 357 пар нуклеотидов (п.н.). У животных-носителей мутации происходила одновременная амплификация нормального (357 п.н.) и мутантного (242 п.н.) аллелей. Таким образом, у носителей множественного артрогрипоза на электрофореграмме фиксировали наличие двух фрагментов: 357 п.н. и 242 п.н., у особей, свободных от этой мутации, - только один фрагмент 357 п.н., соответствующий нормальному аллелю (рис. 2).
Рис. 2. Результаты генотипирования по дефекту АМ с использованием разработанной тест-системы: 1, 3, 4 -носители АМ, 2 - животное - не носитель АМ, 5 - положительный контроль ПЦР, 6 - отрицательный контроль ПЦР, 7 - маркер молекулярной массы (500 кб). Длины фрагментов ДНК маркера указаны справа от фотографии, а длины фрагментов ДНК, полученных в ПЦР - слева.
Преимущество разработанной тест-системы заключается в том, что фрагменты ДНК указанной длины оптимальны для амплификации и не требуют использования высокомолекулярной ДНК высокого качества. Также неоспоримым достоинством служит то, что фрагмент, соответствующий мутантному аллелю, короче фрагмента, соответствующего нормальному. Это создает лучшие условия для амплификации дефектного гена и исключает риск появления ложноотрицательных результатов.
Скрининг описанной мутации у животных посредством разработанной тест-системы показал наличие носителей дефекта АМ в одной популяции коров (II) с частотой 0,99 % и в двух популяциях быков (I и III) с частотами 1,06 и 0,94 %, соответственно. Среди телок, коров, бычков, быков и телят популяций III-VI носителей дефекта обнаружено не было (см. табл.).
Таблица. Частота встречаемости носителей дефекта АМ в российских популяциях абердин-ангусского скота
Популяция Группа животных Количество, гол. AMC*, %
I быки 282 1,06
II коровы 101 0,99
телки 59 0
III коровы 39 0
быки 633 0,94
IV бычки 60 0
V быки 31 0
VI телята 37 0
*АМС - носители множественного артрогрипоза
Анализ коров и быков, зарегистрированных в Американской ассоциации абердин-ангусской породы [15], проведенный по данным 2008-2018 гг., показал, что частота встречаемости животных-носителей множественного артрогрипоза в разные годы варьировала. Максимальный пик носительства был зарегистрирован в 2009 г. (21,3 % - у быков, 17,8 % - у коров). Постепенно частота встречаемости носителей патологии сократилась. Однако, если среди быков дефект множественного артрогрипоза был практически полностью элиминирован к
2017 г., то среди коров частота этой аномалии оставалась на стабильно высоком уровне (12,0 %). На начало февраля
2018 г. показана тенденция роста частоты встречаемости животных-носителей множественного артрогрипоза [10]. Почти за один год величина этого показателя у быков выросла на 1,2 %, а у коров - на 5,2 % (рис. 3).
Анализ частоты встречаемости дефекта АМ в 2017 г. среди животных, зарегистрированных в Канадской ассоциации абердин-ангусской породы крупного рогатого скота, показал, что носителями этой мутации были 29,2 % коров и 10,7 % быков [12].
Данные североамериканского фонда породы лимузин (NALF) тоже свидетельствуют о высокой частоте встречаемости животных-носителей АМ. В 2010 г. среди коров величина этого показателя составила 36,2 %, среди быков - 28,1 %. К сожалению,
после этого данные по указанной ассоциации не обновлялись и сейчас проследить распространение носительства порока АМ среди животных, зарегистрированных в NALF, не представляется возможным [11].
Сведения породных ассоциаций крупного рогатого скота мясного направления продуктивности Америки и Канады согласуются между собой, показывая, что частота встречаемости животных-носителей порока множественного артрогрипоза за рубежом сейчас достаточно высока (20,7-29,2 % у коров и 1,2-10,7 % у быков), а носителями аномалии - это преимущественно коровы.
На сегодняшний день большинство наиболее крупных породных ассоциаций за рубежом обязывают проводить ДНК-тестирование животных на наличие дефектного аллеля, обусловливающего проявление порока множественного артрогрипоза, а статус по этому дефекту отмечают в родословных и племенных сертификатах [10-12, 16-20].
Частота встречаемости животных-носителей множественного артрогрипоза в российских популяциях крупного рогатого скота во много раз ниже величин, полученных при анализе сведений американских и канадских породных ассоциаций. Однако сам факт наличия таких животных в совокупности с зарубежными данными свидетельствует о существовании риска распространения множественного артрогрипоза на территории России, в частности, в результате ввоза дефектного материала из-за рубежа.
Выводы. Несмотря на существующие меры контроля, частота встречаемости животных-носителей множественного артрогрипоза в проанализированных зарубежных популяциях остается достаточно высокой (20,7-29,2 % у коров и 1,2-10,7 % у быков в 2017 г.) и имеет тенденцию к росту.
Разработанная тест-система позволяет идентифицировать животных-скрытых носителей мутации, обусловливающей множественный артрогрипоз. Результаты предварительного скрининга, полученные с ее помощью, показали относительно низкую частоту встречаемости животных-носителей множественного артрогрипоза в исследованных российских популяциях крупного рогатого скота - 0-0,99 % среди коров и 0-1,06 % среди быков.
Однако отсутствие контроля за этим генетическим дефектом может привести к увеличению их количества
%
25,0 20,0 15,0
10,0
5,0
0,0
0,0
2008 2009
2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017
2018 годы
Рис. 3. Динамика проявления носительства множественного артрогрипоза в 2008-2018 гг. (по сведениям Американской ассоциации абердин-ангусской породы крупного рогатого скота): -•- - коровы; - быки.
из-за беспорядочного в отношении порока АМ разведения и ввоза дефектного биоматериала из-за рубежа. Самая неблагоприятная перспектива заключается в том, что при отсутствии контроля возможно появление клинических случаев множественного артрогрипоза и потеря 25 % телят вследствие их ранней смертности.
Считаем, что на территории Российской Федерации необходим контроль этого дефекта, а разработка мер по профилактике его распространения актуальна и своевременна. Генетическая диагностика племенного
поголовья по множественному артрогрипозу позволит получать сведения о его носительстве и учитывать их в селекционно-племенной работе. Это будет способствовать профилактике распространения указанной мутации путем постепенной очистки стад от животных-носителей дефекта АМ без необходимости их выбраковки, и, в конечном итоге, приведет к снижению количества мертворожденных и нежизнеспособных телят, что положительно скажется на повышении эффективности отрасли мясного скотоводства России.
Литература.
1. Государственная программа развития сельского хозяйства и регулирования рынков сельскохозяйственной продукции, сырья и продовольствия на 2013-2020 годы (утверждена Постановлением Правительства Российской Федерации от 14 июля 2012 г. № 717) // Собрание законодательства Российской Федерации. 06.08.2012. № 32. ст. 4549.
2. Генетические дефекты мясных пород крупного рогатого скота и стратегии их контроля / Е.Н. Коновалова, Е.А. Гладырь, О.В. Костюнина и др. // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2017. № 7. С. 42-51.
3. Gholap P.N., Kale D.S., Sirothia A.R. Genetic Diseases in Cattle: A Review// Research Journal of Animal, Veterinary and Fishery Sciences. 2014. Vol. 2. No. 2. Рр. 24-33.
4. Arthrogryposis Multiplex Questions and Answers. American Angus Association. 2008. [Электронный ресурс]. URL: http://www. angus.org/aaa_am_faq1.pdf (дата обращения: 10.03.2017).
5. Beever J.E. Likely presence of lethal genetic defect in a specific line of Angus cattle.2008. [Электронный ресурс]. URL: http:// www.angus.org/pub/am/aaa_notice.pdf (дата обращения: 05.03.2017).
6. A CHRNB1 frameshift mutation is associated with familial arthrogryposis multiplex congenita in Red dairy cattle / J.S. Agerholm, F.J. McEvoy, F. Menzi, etc. // BMC Genomics. 2016. Vol. 17. No. 479. Рр. 1.
7. Steffen D., Laughlin D. Reporting Abnormal Calves is an Opportunity for Proactive Breeders 2008. [Электронный ресурс]. URL: http://www.angus.org/aaa_request.pdf (дата обращения: 21.01.2016).
8. American Angus Association® Arthrogryposis Multiplex (AM) Fact Sheet. [Электронный ресурс]. URL: http://www.angus.org/ pub/AM/AMFactSheet.pdf (дата обращения: 12.02.2018).
9. OMIA - Online Mendelian inheritance in animals. [Электронный ресурс]. URL: http://omia.org/0MIA002135/9913 (дата обращения: 21.01.2016).
10. Genetic Conditions and Factors. American Angus Association. [Электронный ресурс]. URL: http://www.angus.org/Pub/ GeneticConditions.aspx(дата обращения: 15.03.2016 и 12.02.2018).
11. North American Limousin Foundation. [Электронный ресурс]. URL: http://nalf.org/wp-content/uploads/2016/08/arthrogry posismultiplexamtestresults.pdf (дата обращения: 26.03.2017 и 12.02.2018).
12. Canadian Angus Association. [Электронный ресурс]. URL: https://cdnangus.ca/wp-content/uploads/2017/11/758045-1-Animal-Genetic-Defect-Report-AM-Free.pdf (дата обращения: 26.03.2017и 12.02.2018).
13. Primer3Plus. [Электронный ресурс]. URL: http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi. (дата обращения: 15.02.2016).
14. Введение в молекулярную генную диагностику сельскохозяйственных животных / Н.А. Зиновьева, Е.А. Гладырь, Л.К. Эрнст и др. Дубровицы: ВИЖ, 2002. 112 с.
15. Congenital defects of beef cattle breeds and general principles of their prevention / E.N. Konovalova, E.A. Gladyr', O.V. Kostiunina, etc.// Journal of Agriculture and Environment. 2017. No. 2 (3). Рр. 3.
16. Австралийская ассоциация абердин-ангусской породы [Электронный ресурс]. URL: http://www.angusaustralia.com.au (дата обращения: 22.01.2017).
17. Австралийская ассоциация герефордской породы [Электронный ресурс]. URL: http://www.herefordaustralia.com.au (дата обращения: 22.01.2017).
18. Американская ассоциация герефордской породы [Электронный ресурс]. URL: http://www.hereford.org (дата обращения: 24.01.2017).
19. Канадская ассоциация герефордской породы [Электронный ресурс]. URL: http://www.hereford.ca (дата обращения: 24.01.2017).
20. Американская ассоциация ангусов красной масти [Электронный ресурс]. URL: http://redangus.org (дата обращения: 24.01.2017).
GENETIC DEFECT OF ARTHROGRYPOSIS MULTIPLEX AND ITS DNA-DIAGNOSTICS
IN ABERDEEN-ANGUS CATTLE
E.N. Konovalova, O.V. Kostiunina, O.S. Romanenkova
Federal Scientific Center for Animal Husbandry named after Academy Member L.K. Ernst, pos. Dubrovitsy, 60, Podol'skii r-n, Moskovskaya obl., 142132, Russian Federation
Abstract. Arthrogryposis multiplex (AM) is one of the lethal genetic defects causing serious economic damage to beef cattle breeding. It is a congenital hereditary disease of cattle, which is characteristic for dairy and beef breeds. The cause of the disease in Aberdeen-Angus breed is an extensive deletion (23,347 bp) of ISG15, HES4 and AGRN genes. The aim of our investigations was to develop a molecular genetic test system for the diagnostics of the mutation of these genes based on the multiplex single tube allele-specific PCR method (STAS-PCR). The material for the study were DNA samples of calves, steers, heifers, cows and bulls from five population of purebred Aberdeen Angus (n = 1205): I (n = 282), II (n = 101), III (n = 731), IV (n = 60), V (n = 31) and one mixed population (hybrid of Kalmyk and Aberdeen Angus breeds) VI (n = 37), belonging to the farms of Leningrad (I, IV), Kaluga (V), Smolensk (VI), Bryansk (III) and Voronezh (II) regions. The mutation screening carried out by the developed test system allowed to identify animals-carriers of the mutant allele in one population of cows (II) with a frequency of 0.99% and in two populations of bulls (I and III) with frequencies of 1.06 and 0.94%, respectively. A review of the data of foreign breed associations for 2017 showed that the frequency of occurrence of AMC animals remains high enough (20.7-29.2% in cows and 1.2-10.7% in bulls) and tends to increase - according to the American Association of Aberdeen-Angus breed over the past year, this figure increased in cows by 5.2%, and in bulls by 1.2%. These facts indicate the existence of a risk of arthrogryposis multiplex spread in Russia. The developed test system allows early detection of AM-carriers, which will contribute to the prevention of the spread of this defect. Keywords: cattle, genetic defect, arthrogryposis multiplex, AM, Aberdeen-Angus breed.
Author Details: E.N. Konovalova, Cand. Sc. (Biol.), senior research fellow (e-mail: konoval-elena@yandex.ru); O.V. Kostiunina, D. Sc. (Biol.), head of laboratory; O.S. Romanenkova, Cand. Sc. (Biol.), research fellow.
For citation: Konovalova E.N., Kostiunina O.V., Romanenkova O.S. Genetic Defect of Arthrogryposis Multiplex and Its DNA-Diagnostics in Aberdeen-Angus Cattle. Dostizheniya naukii tekhnikiAPK. 2018. Vol. 32. No. 2. Pp. 58-61 (in Russ.). DOI: 10.24411/0235-24512018-10215.
