CC BY
21УДК 575.174.4+575.162
Е. Л. Романишко, М. Е. Михайлова, А. И. Киреева, Р. И. Шейко
АЛЬФА-МАННОЗИДОЗ — ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ДЕФЕКТ В БЕЛОРУССКОЙ ПОПУЛЯЦИИ АБЕРДИН-АНГУССКОГО КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: lenaramanishko@mail.ru
Альфа-маннозидоз (МА) — моногенное летальное аутосомно-рецессивное лизосомальное заболевание абердин-ангусской породы крупного рогатого скота, приводящее к неонатальной смертности телят. Согласно литературным данным, частота гетерозиготных носителей альфа-маннозидоза у абердинов составляла от 2,4% в Австралии до 12,5% в Тасмании. С использованием KASP-технологии нами проведено генотипирование выборки животных для детекции однонуклеотидного полиморфизма (SNP) g.13957949T > C в гене MAN2B1, вызывающего альфа-маннозидоз. Скрининг выборки из белорусской популяции абердин-ангусского скота (n = 220 гол.) не выявил животных-носителей мутантного аллеля (МАС) как среди исследованных коров, так и среди быков.
Ключевые слова: ДНК-тестирование, генетический дефект, альфа-маннозидоз, MAN2B1, KASP, SNP, КРС, абердин-ангусская порода.
Введение
В настоящее время в Беларуси разводится крупный рогатый скот мясного направления продуктивности следующих пород: абердин-ангусской, лимузинской, герефорд-ской и шаролезской. Поэтому особый интерес представляет такая скороспелая порода, как абердин-ангусская, в связи с востребованностью получения высококачественной говядины согласно Межгосударственному стандарту ГОСТ 33818-2016 «Мясо. Говядина высококачественная». Благодаря прекрасным акклиматизационным способностям животные данной породы обладают такими ценными качествами, как быстрое физиологическое и хозяйственное созревание, хорошие воспроизводительные способности, а также высокий генетический потенциал по показателям мясной продуктивности [1].
Одной из задач Государственной программы «Аграрный бизнес» на 2021-2025 гг. (утверждена Постановлением Совета Министров Республики Беларусь от 01.02.2021 № 59) является увеличение численности поголовья племенных животных, позволяющее нарастить объемы реализации племенной продук-
ции (материала). Поэтому перед учеными и племенными службами республики наряду с улучшением селекционируемых признаков маточного поголовья и быков-производителей отечественной селекции, встала задача сохранения и совершенствования продуктивных и племенных качеств завезенного скота. Однако искусственный отбор по желательным признакам нередко приводит к тому, что полученные животные оказываются носителями генетических дефектов, приводящих к высокой смертности, снижению репродуктивных функций и снижению качества мяса. Это зачастую приводит к значительным экономическим потерям [2, 3].
Применение современных методов ДНК-тестирования животных позволяет исключить животных-носителей генетических дефектов как в племенных стадах, так и в завозимом в страну семенном материале, полученном от высокопродуктивных быков-лидеров породы. Одной из главных проблем современного животноводства в мире стало снижение фер-тильности. Значительную роль в снижении воспроизводительных качеств коров играют рецессивные мутации в последовательности
ДНК, которые в гомозиготном состоянии могут быть летальными и приводить к эмбриональным потерям. Абердин-ангусская порода не стала исключением, у животных этой породы, как и у всех мясных пород зарубежной селекции, выявлены генетические дефекты, проявление которых связано со снижением фертильности коров [4-6]. Одним из таких дефектов является альфа-маннозидоз (А^а-mannosidosis, МА) [7].
Альфа-маннозидоз — моногенное летальное аутосомно-рецессивное лизосомальное заболевание, вызванное дефицитом фермента лизосомальная альфа-маннозидаза (МА№В1) или лизосомальная экзогликозидаза, участвующая в упорядоченной деградации №связан-ных олигосахаридов [8]. Данное заболевание выявлено у человека [9], крупного рогатого скота [10], кошек [11] и морских свинок [12, 13]. Ген MAN2B1 кодирует полипептид, который подвергается посттрансляционной модификации в эндоплазматическом рети-кулуме. Во время созревания и эндосомаль-ного транспорта белка МА№2В1 в лизосомы он протеолитически расщепляется на три основных полипептида, получивших названия «аЬс», и «е» и имеющих молекулярную массу 70, 42 и 15 кДа соответственно. В ходе дальнейшего процессинга субъединицы массой 70 кДа образуется в общей сложности пять различных полипептидов. Наиболее высокие уровни экспрессии MAN2B1 отмечаются в легких, почках, поджелудочной железе, лейкоцитах и спинном мозге. Мутации в гене MAN2B1 приводят к нарушению функции кодируемого им фермента, что влечет за собой уменьшение расщепления гликопроте-инов, к прогрессирующему накоплению богатых маннозой олигосахаридов во всех тканях, и к нарушению нормальной функции клеток и их апоптозу. В зависимости от характера мутации гена MAN2B1 патологически измененный белок МА№В1 обнаруживается во внутриклеточных компартментах, таких как эндоплазматический ретикулум и лизосомы. Например, может быть нарушена конфор-мация белка, при которой он «застревает» в эндоплазматическом ретикулуме, если же конформация белка не нарушается, то он транспортируется в неактивном виде в лизо-сомы [14].
У крупного рогатого скота абердин-ан-гусской породы альфа-маннозидоз (ОМ1А: 000625-9913) относится к дефектам I класса, которые являются летальными и существенно нарушают или снижают репродуктивные показатели животного и приводят к неонаталь-ной смертности телят [15, 16]. У крупного рогатого скота альфа-маннозидоз обусловлен однонуклеотидной несинонимичной заменой тимина на цитозин в кодирующей области гена MAN2B1 в 7 хромосоме (7^.13957949, С.961Т > С, р^е32Шеи) [17]. Замена фенила-ланина на лейцин в 321 положении приводит к образованию функционально неактивного белка. Дефицит а-О-маннозидазы приводит к глобальным нарушениям обмена веществ у крупного рогатого скота. Гомозиготные по мутантному аллелю телята рождаются без признаков физических недостатков. Затем в течение первого года жизни развиваются прогрессирующие неврологические нарушения: атаксия, головокружение, тремор, агрессия и предсмертный паралич. Клинические проявления связаны с накоплением богатых маннозой соединений, вызванных дефицитом фермента альфа-маннозидазы [16-21].
В связи с высокой частотой встречаемости в мировой популяции ангусов мутантного аллеля гена MAN2B1, существует риск распространения данной патологии и среди абер-дин-ангусского скота в Беларуси. Согласно Положению о порядке проведения молекуляр-но-генетической экспертизы племенной продукции государств — членов Евразийского экономического союза (№ 74 от 02.06.2020 г.), рекомендовано проводить исследование биологического материала животных абердин-ан-гусской породы на выявление генетически детерминированных заболеваний, в том числе на альфа-маннозидоз. Поэтому целью нашего исследования является разработка ДНК-технологии выявления мутантного аллеля гена MAN2B1, детерминирующего альфа-маннози-доз и выявление животных-носителей данного генетического дефекта в белорусской популяции абердин-ангусского скота.
Материалы и методы
Объектом исследования являлся крупный рогатый скот абердин-ангусской породы. Материалом для исследования служила
ДНК, выделенная из биологического материала — цельной крови, проб ткани (ушной вы-щип) и спермы. Выделение ДНК проводили набором реагентов «Нуклеосорб» («Прайм-тех», Беларусь). Количество выделенной ДНК определяли с помощью флуориметра DeNovix DS 11 FS с использованием набора реагентов
для измерения концентрации ДНК DeNovix dsDNA Broad Range Kit (DeNovix, США). Для ДНК-идентификации альфа-маннозидо-за абердин-ангусского крупного рогатого скота были использованы следующие методы: KASP и секвенирование по Сэнгеру для валидации метода (табл. 1).
Таблица 1
ДНК-идентификация наследственного заболевания у абердин-ангусского скота
Наследственное заболевание Ген Хромосома Локализация Тип мутации Метод
Альфа-маннозидоз (МА) MAN2B1 7 13957949 961T > C (Phe321Leu) KASP
KASP-анализ (конкурентная аллель-специфичная ПЦР)
Полимеразную цепную реакцию проводили на приборе CFX96 (Bio-Rad, США). Реакционная смесь для ПЦР в объеме 10 мкл содержала: х2 KASP Мастер Микс, смесь специфических праймеров (KASP Assay mix), деионизированную MQ-H2O и 25 нг геномной ДНК.
Полимеразную цепную реакцию проводили по программе: 94 °С — 15 мин; 94 °С — 20 сек, 60 °С — 1 мин ((со снижением каждого цикла на 0,6 °С) 10 циклов); 94 °С — 20 сек, 55 °С — 60 сек (26 циклов).
Анализ и учет полученных результатов ПЦР осуществляли с использованием программного обеспечения Bio-Rad CFX Mаestro.
Двуаллельная дискриминация достигается за счет конкурентного связывания двух аллель-специфических прямых праймеров. Дискриминацию аллелей для определения генотипов проводили по значениям RFU (относительные единицы флуоресценции) для каналов FAM и HEX (табл. 2).
Технология KASP позволяет значительно сократить время проведения анализа, что выгодно отличает его от традиционного ПЦР-ПДРФ анализа.
Таблица 2
Последовательность нуклеотидов исследуемого локуса гена MAN2B1
Ген Последовательность ДНК FAM Аллель HEX Аллель
MAN2B1 TGCAGGGTAAGCTCTACCGCACCAAACACACTGTGATGACCATGGGC TCAGAC[T/C]TCCAGTACGAGAATGCCAACACGTGGTTCAAAAATCTT-GACAAGCTCATCCAGTTGGTCAATGCCCAGGTGAGT С Т
Секвенирование по Сэнгеру Методом прямого секвенирования последовательности ДНК проверена специфичность полученных фрагментов гена MAN2B1. Дизайн праймеров для получения специфичных фрагментов гена MAN2B1 длиной 157 п. н. осуществлялся с помощью программы Primer 3. Анализ нуклеотидной последовательности данного гена проводили с
помощью Ensembl в форматах FASTA. Реакционная смесь для ПЦР в 20 мкл содержала: 10х ПЦР буфер («Thermo Scientific», Литва), 2 ед. Taq-полимеразы («Thermo Scientific», Литва), 2 mM MgCl2 («Thermo Scientific», Литва), 0.2 mM dNTP s («Thermo Scientific», Литва), 0.5 цМ каждого праймера, MQ-H2O и по 20 нг геномной ДНК для каждого образца. Программа амплификации: 95 °С — 5 мин;
95 °С — 30 сек, 65 °С — 40 сек, 72 °С— 50 сек, 72 °С — 40 сек, 72 °С — 1 мин (35 циклов).
ПЦР-продукты контрольных образцов изучаемого локуса гена вырезали из геля и очищали с помощью набора реагентов Silica Bead DNA Gel Extraction Kit («Thermo scientific», Литва). Для постановки секвенирующей ПЦР использовали Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. Секвенирующую ПЦР проводили согласно следующим условиям:
96 °С — 1 мин; 25 циклов: 96 °С — 10 сек, 50 °С — 5 сек, 60 °С — 4 мин; 16 °С — 5 мин. ПЦР-продукты после секвенирующей ПЦР очищали от непрореагировавших флуоресцентно меченых терминаторных нуклеотидов
переосаждением этанолом/№2ЭДТА. Определение нуклеотидной последовательности ДНК проводили на приборе 3500 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США).
Результаты исследования
С помощью разработанной нами методики была исследована выборка (n = 220 гол.) крупного рогатого скота абердин-ангусской породы 3-х популяций Гомельской (n = 31 гол.), Минской (n = 70 гол.) и Брестской (n = 119 гол.) областей Республики Беларусь. Визуализация результатов KASP-анализа представлена на рисунке 1.
Согласно рекомендации American Angus
Рис. 1. Дискриминация аллелей однонуклеотидного полиморфизма 961Т > С в гене МЛЫ2В1 с использованием технологии KASP-генотипирования: 1 кластер — особи с генотипом ТТ (MAF); 2 — контроль без матрицы (^ЫТС)
Association, животных с аллелями дикого типа гена MAN2B1 обозначают MAF (свободные от мутации, здоровые). Животных-носителей мутантного аллеля в гетерозиготе обозначают MAC (носители мутации). Не жизнеспособных животных, носителей 2-х мутантных аллелей в гомозиготе, обуславливающих наследственное заболевание альфа-маннозидоз,
обозначают MAA [16].
Генотипирование контрольных образцов показало полное совпадение результатов, полученных с помощью метода KASP-анализа и секвенирования по Сэнгеру (рис. 2).
Животными-носителями альфа-маннозидо-за (MAC) могут быть как быки, так и коровы, которые ничем не отличаются от здоровых
Рис. 2. Результаты секвенирования: 1 (1-5 — ПЦР фрагмент референсных образцов для секвенирования локуса гена MAN2B1, М — маркер молекулярной длины, DNA Ladder SM1103 («Thermo scientific», EU); ОКО — отрицательный контрольный образец), 2 — гомозиготное здоровые животное (MAF)
животных (МАF). Ранее генотипирование крупного рогатого скота абердин-ангусской породы в Республике Беларусь не проводилось и, соответственно, отсутствовали данные о наличии генетического дефекта МА в белорусской популяции. Нами исследована выборка абердин-ангусского скота, отобранного из племенных хозяйств республики (табл. 3).
Согласно исследованию Неа1у Р. J. с соавторами, частота гетерозиготных носителей альфа-маннозидоза у абердинов
следуемого локуса гена MAN2B1 в популяциях ангусов разных стран и наличие животных-носителей в родословной лидеров быков-производителей этой породы подтверждает необходимость проведения молекулярно-ге-нетического тестирования племенных животных, завозимых в республику. На данном этапе не выявлено животных-носителей (МАС), несущих мутантный аллель гена MAN2B1 как среди быкопроизводящих коров, так и среди быков-производителей. Дальнейшее ДНК-типирование расширенного поголовья абердин-ангусского крупного рогатого скота позволит дать более полные данные о распространении генетического дефекта альфа-ман-нозидоз в поголовье абердин-ангусского скота в Республике Беларусь.
составляла 5,4% в Австралии [23]. Исследование Tollersrud O. K. и соавторов установило частоту гетерозиготных носителей альфа-ман-нозидоза у абердинов, которая составляла от 2,4% в Австралии до 12,5% в Тасмании [22]. Согласно исследованию Jolly R. D. c соавторами примерно 10% ангусов в Новой Зеландии были гетерозиготны по альфа-маннозидо-зу до начала массового генотипирования животных [24]. Высокая частота встречаемости животных-носителей мутантного аллеля ис-
Заключение
До недавнего времени в республике не было возможности проводить ДНК-тестирование на выявление генетических дефектов у абердин-ангусского крупного рогатого скота, а также завозимого племенного материала (животных, эмбрионов, спермы). Поэтому страна находилась в зоне риска появления и распространения генетических дефектов в популяции мясного скота. Как известно, возникновение генетических дефектов легче не допустить, чем впоследствии бороться с аномалиями, которые могут привести к серьезным экономическим потерям. Животные, в родословных которых один из родителей является носителем МА, обязательно должны быть ге-нотипированы.
Таблица 3
Результаты ДНК-тестирования выборки из популяции абердин-ангусского крупного рогатого скота (п = 220 гол.) для выявления животных-носителей мутантного аллеля гена МАШВ1, вызывающего альфа-маннозидоз (МА)
Область Хозяйство Количество протестированных животных, гол. Частота свободных от мутации здоровых животных (МАЕ), % Частота животных-носителей мутантного аллеля (МАС), %
Всего Быков Коров Всего Быков Коров Всего Быков Коров
Гомельская Агро-Лясковичи 31 15 16 100 100 100 - - -
Минская Трайпл-Агро 7 - 7 100 - 100 - - -
КФХ «Весна-агро» 63 32 31 100 100 100 - - -
Брестская Агро-Мотоль 119 - 119 100 - 100 - - -
Разработанная нами методика обнаружения мутантного аллеля гена MAN2B1, вызывающего альфа-маннозидоз, позволяет проводить молекулярно-генетическую экспертизу племенной продукции в Республике Беларусь в порядке, установленном международно-правовыми актами, составляющими право Евразийского экономического союза, с целью профилактики распространения данного летального аутосомно-рецессивного заболевания среди племенных животных абердин-ангус-ской породы крупного рогатого скота.
Работа выполнена при финансовой поддержке ГП «Наукоемкие технологии и техника» на 2021-2025 гг., подпрограммы 1 «Инновационные биотехнологии-2020», мероприятие 2ИБ «Разработать ДНК-технологию идентификации полиморфных вариантов генов, влияющих на репродуктивные признаки, с целью повышения воспроизводительной способности КРС мясного направления».
Список использованных источников
1. Мясное скотоводство в Беларуси: перспективы развития / С. А. Гордынец, Л. П. Шалуш-кова, И. С. Петрушко [Электронный ресурс].
- Интернет журнал Продукт BY. - Режим доступа. https://produkt.by/story/myasnoe-skotovodstvo-v-belarusi-perspektivy-razvitiya.
2. Грибов А. В. Перспективы развития специализированного мясного скотоводства в республике Беларусь [Электронный ресурс]. - Научная электронная библиотека. -Режим доступа: https://cyberleninka.ru/article/n/ perspektivy-razvitiya-spetsializirovannogo-myasnogo-skotovodstva-v-respublike-belarus.
3. Эрнст, Л. К. Мониторинг генетических болезней животных в системе крупномасштабной селекции / Л. К. Эрнст, А. И. Жигачев. -М., Россельхозакадемия, СпбГАВМ. - 2006.
4. Жигачев, А. И. О накоплении груза мутаций в породах крупного рогатого скота при интенсивных технологиях воспроизводства и улучшения по целевым признакам / А. И. Жигачев, Л. К. Эрнст, А. С. Богачев.
- Сельскохозяйственная апология. - 2008. -№ 6. - С. 25-32.
5. Зиновьева, Н. А. Моногенные наследственные дефекты и их роль в воспроизводстве / Н. А. Зиновьева, Н. И. Стрекозов, А. А. Сер-
мягин. - Генетические ресурсы ОАО «Московское» по племенной работе изд. третье. - М.: ОАО «Московское» по племенной работе». -2015. - С. 19-21.
6. Жигачев, А. И. Оценка производителей на скрытые генетические дефекты / А. И. Жигачев. - Зоотехния. - 2001. - № 2. - С. 10-12.
7. [Электронный ресурс] https://www.angus.org/.
8. Aronson N. N, Kuranda M. J. 1991. Lysosomal degradation of Asn-linked glycoproteins.
- FASEB J. - № 3. - Р. 2 615-2 622.
9. Mannosidosis. In: Durand / Chester MA, Lundblad A, Ockerman P-A, et al. - Genetic errors of glycoprotein metabolism Edi-Ermes., Milan. - 1982. - P. 89 -122.
10. Hocking J. D., Jolly R. D., Batt R. D. Deficiency of a-mannosidase in Angus cattle. An inherited lysosomal storage disease / Hocking J. D., Jolly R. D., Batt R. D. - Biochem J. - 1972. -№ 128. - P. 69-78.
11. Biochemical studies on a case of feline mannosidosis / Burditt L. J., Chotai K., Hirani S. et al.
- Biochem J. - 1980. - № 189. - P. 467-473.
12. Muntz F. H., Bonning L. E., Carey W. F. Alpha-mannosidosis in a guinea pig / F. H. Muntz, L. E. Bonning, W. F. Carey. - Lab Anim Sci. -1999. - № 49. - P. 424-426.
13. Identification of 83 Novel Alpha-Man-nosidosis-Associated Sequence Variants: Functional Analysis of MAN2B1 Missense Mutations / H. M. Frostad, R. Sensland, H. B. Klenow, L. V. Nguyen, et al. - Human mutation. - 2012. -Vol. 33, № 3. - P. 511-520.
14. [Электронный ресурс] https://www.al-phamannosidosis.com/ru/для-специалистов-здравоохранения/информация-о-заболевани/ механизм-развития-заболевания/.
15. [Электронный ресурс] https://www.omia. org/0MIA000625/9913/.
16. [Электронный ресурс] https://www.vgn-ki.ru/assets/files/broshyura-o-testah-aberdin-an-gusskoj-porody.pdf.
17. Тестирование на носительство наследственных заболеваний крупного рогатого скота абердин-ангусской породы. - Брошюра Министерство сельского хозяйства Российской федерации Россельхознадзор Федеральное государственное бюджетное учреждение «Всероссийский Государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»).
18. Konovalova E. N. Genetic defects of beef cattle and necessity of their managing. - RJOAS. - 2017. - № 8 (68). - P. 254 - 259.
19. Коновалова Е. Н., Костюнина О. В. Распространение генетических дефектов множественного артрогрипоза (AM) и дупликации развития (DD) среди российских популяций крупного рогатого скота абердин-ангусской породы. Генетика и разведение животных. -2019. - № 1. - С. 16-21.
20. [Электронный ресурс] http://www.flocka-ndherd.net.au/cattle/reader/developmental-dupli-cation-angus.html.
21. [Электронный ресурс] https://redangus. org/wp-content/uploads/2018/02/Alpha-Manno-sidosis_FAQ.pdf.
22. Purification of bovine lysosomal al-pha-mannosidase, characterization of its gene and determination of two mutations that cause alpha-mannosidosis / Tollersrud O. K., Berg T., Healy P., Evjen G., Ramachandran U., Nilssen O.
- Eur J Biochem. - 1997. - Jun № 1; 246(2). -C. 410-419.
23. Control of a-mannosidosis in Angus cattle / P. J. Healy, P. J. Babidge, D. H. Embury et al. -Australian Veterinary Journal. - 2008. - № 60(5).
- P. 135-137.
24. Identification of mannosidosis heterozy-gotes-factors affecting normal plasma alpha-man-nosidase levels. R. D. Jolly, K. G. Thompson, C. A. Tse. - New Zealand Veterinary Journal. -1974. - Vol. 22. - P. 155-162.
E. L. Ramanishka, M. E. Mikhailova, A. I. Kireyeva, R. I. Sheyko
ALFA-MANNOSIDOSIS — A GENETIC DEFECT IN THE BELARUSIAN ABERDEEN ANGUS CATTLE POPULATION
State Scientific Institution "Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus" 27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, the Republic of Belarus e-mail: lenaramanishko@mail.ru
Alpha-mannosidosis (MA) is a monogenic lethal, autosomal recessive, lysosomal disease of Aberdeen Angus cattle leading to neonatal mortality in calves. According to the literature, the frequency of heterozygous carriers of alpha mannosidosis in Aberdeens ranged from 2.4% in Australia to 12.5% in Tasmania. Using KASP technology, the single nucleotide polymorphism (SNP) g.13957949T > C in the MAN2B1 gene causing alpha-manasidosis was investigated. Screening of a sample from the Belarusian population of Aberdeen Angus cattle (n = 220 heads) did not reveal any animals carrying a mutant allele (MAC) — neither among the cows nor among the bulls studied.
Keywords: DNA testing, genetic defect, alpha-mannosidosis, MAN2B1, KASP, SNP, cattle, Aberdeen Angus breed.
Дата поступления в редакцию: 06 февраля 2023 г.
