CC BY
14УДК 615.322
ВЫЯВЛЕНИЕ ФАЗЫ МАКСИМАЛЬНОГО НАКОПЛЕНИЯ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ МОЛОЧНОКИСЛЫХ СТРЕПТОКОККОВ
Шахова Н.В., студент 4 курса направления подготовки «Биотехнология» Научный руководитель: к.с.-х.н., доцент Горькова И.В. ФГБОУ ВПО Орел ГАУ
АННОТАЦИЯ
В статье приведены исследования по выявлению экспоненциальной и стационарной фазы культивирования штаммов Streptococcus thermophilus ST-BODY-3, Streptococcus mesophiles CHN-19 и бактерий, содержащихся в закваске Эвиталия для получения гиалуроновой кислоты. Определены фазы максимального накопления гиалуроновой кислоты.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА
Фаза роста; бактерии; клетка; бактериальная культура; субстрат; факторы среды. ABSTRACT
The paper presents the investigations on identification of the exponential and stationary phase culture of cultivation of strains Streptococcus thermophilus ST-BODY-3, Streptococcus mesophiles CHN-19 and bacteria in Evitalia sourdough to obtain hyaluronic acid. The phases of maximum hyaluronic acid accumulation are defined.
KEY WORDS
Growth phase; bacteria; cell; bacterial culture; substrate; environmental factors.
Прогрессивным развитием общества является здоровье нации, в поддержании которого на должном уровне существенное влияние оказывает обеспечение населения лекарственными субстанциями.
При этом уже сейчас наблюдается определенный дефицит гиалуроновой кислоты (ГК) в качестве компонента различных препаратов.
Особенностью культуры бактерий р. Streptococcus является их способность образовывать капсулы из ГК. На этом свойстве основано их культивирование. Со временем биотехнологическое производство постепенно будет вытеснять получение ГК методом традиционной экстракции из животного сырья.
Поэтому исследования в области биотехнологического биосинтеза ГК микроорганизмами являются актуальными и могут лечь в основу создания биотехнологического производства ГК в России.
Цель работы - выявить фазу максимального накопления гиалуроновой кислоты при культивировании молочнокислых стрептококков.
Материалы и методика исследований
В качестве объектов исследования были выбраны следующие микроорганизмы: штаммы Streptococcus thermophilus ST-BODY-3, Streptococcus mesophiles CHN-19, закваска Эвиталия, содержащия пять штаммов микроорганизмов (Streptococcus thermophilus, Propioni bacterium freudenrei chisubsp. shermanii и лактобактерии -Lactococcus lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus).
Прирост биомассы определяли на денситометре по оптической плотности с зеленым светофильтром, длина волны 535 +/- 20 нм. Денситометр предназначен для измерения мутности клеточных суспензий в единицах Мак-Фарланда (100х106 - 150х107 клетка/мл). Наличие капсул и их количество выявляли с помощью микроскопии.
Результаты и их обсуждение
В ходе работы были изучены фазы роста бактерий и время их наступления в зависимости от наличия тех или иных компонентов в среде. Результаты микроскопического исследования бактерий в каждой фазе представлены на фото рисунков 1-3. Лаг-фаза характеризуется отдельными скоплениями микроорганизмов, представляющих собой совокупность отдельных клеток. В фазе ускоренного роста заметно начавшееся деление клеток. Клетки равномерно распределены в питательной среде и представляют собой диплококки, тетракокки. Продолжительность фазы составляет 12 часов. Затем наступает экспоненциальная фаза роста, которая является периодом интенсивного деления бактерий и образования капсул. Продолжительность ее около 5-6 ч. Величина клеток и содержание в них белка данных бактерий остаются в экспоненциальной фазе постоянными.
в)
г)
Рисунок 1 - Внешний вид бактерий, содержащихся в закваске Эвиталия: а) лаг-фаза; б) фаза ускоренного роста; в) экспоненциальная фаза;
г) стационарная фаза.
в)
г)
Рисунок 2 - Внешний вид бактерий 81гер1ососсиз ^егторИНиэ штамма ST-BODY-3: а) лаг-фаза; б) фаза ускоренного роста; в) экспоненциальная фаза;
г) стационарная фаза.
При оптимальных условиях роста бактерии могут делиться каждые 20-40 мин. Во время фазы экспоненциального роста бактерии наиболее ранимы, что объясняется высокой чувствительностью компонентов метаболизма интенсивно растущей клетки к ингибиторам синтеза белка, нуклеиновых кислот и др. Величина клеток и содержание в них белка данных бактерий остаются в экспоненциальной фазе постоянными. Бактериальная культура в этом случае состоит из «стандартных клеток». Если точно установлено, что число клеток, содержание в них белка и их сухая биомасса увеличиваются с одинаковой скоростью, то за ростом культуры можно следить, пользуясь каким-нибудь одним из этих показателей.
а)
б)
Рисунок 3 - Внешний вид бактерий Streptococcus mesophiles штамма CHN-19: а) лаг-фаза; б) фаза ускоренного роста; в) экспоненциальная фаза;
г) стационарная фаза.
В экспоненциальной фазе роста клетки периодической культуры претерпевают изменения, так как постепенно изменяется среда: уменьшается концентрация субстрата, увеличивается плотность клеточной суспензии и накапливаются продукты обмена. В связи с тем, что в экспоненциальной фазе скорость деления клеток относительно постоянна, эта фаза наиболее удобна для определения скорости деления (и скорости роста). Изучая влияние факторов среды (рН, окислительно-восстановительного потенциала, температуры, аэрации и т.д.), а также пригодность различных субстратов, следят за увеличением числа клеток или за мутностью (экстинкцией) клеточной суспензии во время экспоненциального роста.
Затем, в силу постепенного истощения источника энергии и других жизненно важных метаболитов, скорость размножения бактерий уменьшается, наступает фаза стационарного роста, при которой количество жизнеспособных клеток остается без изменений, составляя максимальный уровень (М-концентрация). Ее продолжительность выражается в часах и колеблется в зависимости от вида бактерий, их особенностей и культивирования.
В стационарной фазе наступает период некоторого равновесия, количество вновь образующихся клеток становится сопоставимым с числом погибающих клеток. В стационарной фазе могут еще происходить такие процессы, как использование запасных веществ, распад части рибосом и синтез ферментов. Наблюдаемая картина зависит от того, какой именно фактор лимитирует рост. Быстро гибнут лишь очень чувствительные клетки; другие еще долго сохраняют жизнеспособность - до тех пор, пока есть возможность получать необходимую для этого энергию в процессе окисления каких-либо запасных веществ или клеточных белков.
Количество биомассы, достигнутое в стационарной фазе, называют выходом или урожаем. Урожай зависит от природы и количества используемых питательных веществ, а также от условий культивирования.
Стадии роста бактерий, содержащихся в закваске Эвиталия, Streptococcus thermophilus и Streptococcus mesophiles представлены на рисунках 4-6.
Рисунок 4 - Стадии роста бактерий, содержащихся в закваске Эвиталия
при культивировании
Рисунок 5 - Стадии роста бактерий Streptococcus thermophilus при культивировании
Рисунок 6 - Стадии роста бактерий Streptococcus mesophiles при культивировании
Из графиков видно, что экспоненциальная фаза бактерий Streptococcus mesophiles наступает значительно позже, нежели бактерий содержащихся в закваске Эвиталия и бактерий Streptococcus thermophilus.
Выводы
1. Выявлено, что наступление фазы максимального накопления ГК колеблется в зависимости от штамма бактерий Streptococcus.
2. У бактерий Streptococcus mesophilus экспоненциальная фаза наступает значительно позже, нежели у бактерий, содержащихся в закваске Эвиталия и бактерий Streptococcus thermophilus.
3. Наличие капсул и их толщина меняется по ходу культивирования.
4. При структурном анализе Streptococcus mesophiles CHN-19 видно, что капсулированные клетки есть во всех фазах. Это говорит о том, что данный штамм характеризуется стабильностью формируемых капсул и мукоидной морфологией колоний. Вследствие проявления штаммом гиалуронатлиазной активности не происходит выход ГК в культуральную жидкость, что делает данный штамм перспективным для дальнейшей селекции.
Библиография
1. Белодед, А. В. Культивирование Streptococcus zooepidemicus - продуцента гиалуроновой кислоты на средах, содержащих мясные экстракты / А. В. Белодед, И. Г. Филиппов, Н. С. Марквичев, И. И. Самойленко // Успехи в химии и хим. технол. - 2005. -Т. XIX. - № 5. - С. 82-85.
2. Белодед, А. В. Культивирование мукоидного штамма Streptococcus equi subsp.zooepidemicus - продуцента гиалуроновой кислоты / А. В. Белодед, Н. С. Марквичев, И. И. Самойленко // Тез. докл. IV-го Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 12-16 марта 2007. - М. : «Экспо-Биохим-Технологии», 2013. - Ч. 2. - С. 44-45.
3. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. / Б. Глик, Пастернак Дж Пер. с англ. ISBN 5-03-003328-9. - М. : Мир, 2012.
4. Каленов, C. B. Культивирование дрожжей и галобактерий в условиях контролируемого окислительного стресса . : автореф. дис. на соиск. уч. степ. канд. техн. наук. - М. , 2013, 195 с.
5. Сазыкин, О. Ю. Биотехнология: учеб.пособие для студентов высш. учеб. заведений / Ю. О. Сазыкин, С. Н. Орехов, И. И. Чакалева; под ред. А. В. Катлинского. - 3-е изд., стер. - М. : Издательский центр «Академия», 2013.
