CC BY
25УДК 637.146
Lyudmila V. Krasnikova, Vladimir S. Sibirtsev,
Irina I. Skobeleva
BIOTECHNOLOGY OF FUNCTIONAL FERMENTED MILK PRODUCT WITH DIFFERENT RATIOES OF PROBIOTIC CULTURES
ITMO University, pr. Kronverksky, 49, St. Petersburg, 197101, Russia
In this paper we consider the possibility of using probiotic cultures, such as Lactobacillus acidophilus and Streptococcus salivarius subsp. Thermophilus in different ratioes. The purpose of this work was to develop the biotechnology of a functional fermented milk product on the basis of these microorganisms in the optimum ratio. As a filler, mashed cowberry with sugar was used. The introduction of a viscous strain of Streptococcus salivarius subsp. Thermophilus increased the water-binding capacity of clots and improved the rheological properties of the finished product.
Keywords: biotechnology, functional foods, probiotic cultures, cranberries, cowberry.
Л.В. Красникова[
, В.С. Сибирцев1, И.И. Скобелева2
БИОТЕХНОЛОГИЯ
ФУНКЦИОНАЛЬНОГО
КИСЛОМОЛОЧНОГО
ПРОДУКТА С РАЗНЫМ
СООТНОШЕНИЕМ
ПРОБИОТИЧЕСКИХ
КУЛЬТУР
Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики», пр. Кронверкский, 49, г. Санкт-Петербург, 197101, Россия
В данной работе рассмотрена возможность использования пробиотических культур Lactobacillus acidophilus и Streptococcus salivarius subsp. Thermophilus при разных их соотношениях. Целью работы явилась разработка биотехнологии функционального кисломолочного продукта на основе указанных культур при оптимальном их соотношении с добавлением пюре брусники с сахаром. Введение вязкого штамма Streptococcus salivarius subsp. Thermophilus повысило влагоудер-живающую способность сгустков и улучшило реологические свойства готового продукта
Ключевые слова: Биотехнология, функциональные продукты, пробиотические культуры, брусника.
Введение
Одним из важных достижений конца XX века явилась разработка концепции «Пробиотики и функциональное питание», в основу которой заложены фундаментальные и прикладные аспекты здоровья человека, пищевой биотехнологии и медицины. В настоящее время функциональное питание признано альтернативой медикаментозной терапии и определяется как «Food for Specific Healt Use - FOSHU» (продукты для питания специального оздоровительного использования). Функциональное питание подразумевает употребление таких пищевых продуктов, которые при систематическом приеме оказывают позитивное регулирующее действие на определенные системы и органы макроорганизма или их функции, улучшая физическое и психическое здоровье человека [1, 2]. К пищевым пробиотикам, нормализующим состав и жизнедеятельность кишечной микрофлоры, относятся различные кисломолочные продукты с введением специальных штаммов молочнокислых бактерий и бифидобактерий. Среди молочнокислых бактерий рода Lactobacillus особого внимания заслуживает вид Lactobacillus acidophilus, который благодаря кислото-толерантности преодолевает кислотный барьер желудка и попадает в тонкий кишечник. Штаммы L. acidophilus характеризуются высокой антагонистической активностью в отношении патогенных, условно-патогенных и технически вредных микроорганизмов, что объясняется про-
дукцией неспецифических антимикробных метаболитов (молочной кислоты, пероксида водорода, лизоцима) и специфических факторов антагонизма - бактериоцинов [3-6]. Накапливающаяся при расщеплении углеводов молочная кислота, с одной стороны, сама обладает определенным антимикробным действием, а с другой стороны, снижает рН среды до значений, при которых тормозится рост некоторых гнилостных и патогенных бактерий. В кислой среде, как правило, усиливается действие бактериоцинов, как антимикробных факторов. Штаммы L. acidophilus содержат фермент пероксидазу, способствующую образованию пероксида водорода и некоторых других перекисных соединений (тиоционата, гипотиоци-оната и др.). Эти метаболиты оказывают сильный инги-бирующий эффект на многие микроорганизмы, включая эукариоты [7].
Бактериоцины лактобактерий относятся к факторам специфического антагонизма и представляют собой вещества пептидной природы, секретируемые во внеклеточную среду во время различных фаз роста клеток-продуцентов и летально действующие на чувствительные к ним бактерии. Бактериоцины, в отличие от классических антибиотиков, синтезируются на рибосомах и имеют относительно узкий спектр антимикробного действия. Различные штаммы ацидофильной палочки синтезируют разные бактериоцины: ацидофилин, лактоцидин, лактоцины B, F, ацидоцины B, J1229, CH5 [8-11].
1 Красникова Людмила Васильевна, д-р техн. наук, профессор, каф. химии и молекулярной биологии, Университет ИТМО, e-mail: krasnikoval@yandex.ru Lyudmila V. Krasnikova Dr Sci. (Eng.), Professor, Department of Chemistry and Molecular Biology, ITMO University
2 Сибирцев Владимир Станиславович, канд. хим. наук доцент информационных технологий топливно-энергетического комплекса АО «Гипрорыбфлот» ул. Инструментальная д. 8 лит. В. Санкт-Петербург, 197022, Россия vs1969r@mail.ru
Vladimir S. Sibirtsev PhD (Chem.), Associate Professor Information Technology Fuel - energy Complex) of «Giprorybflot» (Technical Microbiology Laboratory), ul. Instrumentalnaya, 8, Saint - Petersburg, 197022, Russia
3 Скобелева Ирина Игорьевна, магистрант, группа № Т4140, каф. химии и молекулярной биологии, Университет ИТМО e-mail: aveleboksi@gmail.com Irina I. Skobeleva, master of the group number T4140, Department of Chemistry and Molecular Biology ITMO University,
Дата поступления - 20 марта 2016 года
Целью работы является разработка биотехнологии функционального кисломолочного продукта на основе пробиотических культур Lactobacillus acidophilus и Streptococcus salivarius subsp. Thermophilus.
Для приготовления функционального кисломолочного продукта был использован препарат «Ви-тафлор», разработанный в Гос. НИИ особо чистых биопрепаратов и представляющий собой симбиотическую культуру двух штаммов L. acidophilus Д 75 и Д 76. Препарат оказывает комплексное действие на организм, нормализуя качественный и количественный состав микробиоценоза кишечника, и восстанавливая иммунный и нейроэндокринный статус. Штаммы, входящие в состав препарата, обладают выраженным антагонизмом в отношении бактерий Shigella flexneri, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia, Listeria monocytogenes, Citrobacter freundii, Helicobacter pilori, а также дрожжей вида Candida albicans [12].
Однако, несмотря на перечисленные положительные свойства штаммов ацидофильной палочки, следует отметить и некоторые их отрицательные стороны. Так, например, обладая высокой кислотообразующей активностью, промышленные штаммы L. aci-dophilus при культивировании в молоке или молочной сыворотке вызывают перекисание ферментированных молочных продуктов, что отрицательно сказывается на потребительских свойствах готового продукта. Предельная титруемая кислотность ферментированного молока (через 7 суток при 37 °С) может достигать 180360 °Т. Кроме того, вследствие своей высокой антагонистической активности ацидофильная палочка может вызвать подавление роста других культур микроорганизмов, входящих в состав комбинированной закваски, изменяя тем самым соотношение культур и качественные характеристики кисломолочных продуктов.
В связи с вышесказанным, в биотехнологии функционального кисломолочного продукта при ферментации молока нами была использована комбинация молочной культуры «Витафлора» и вязкого штамма Streptococcus salivarius subsp. thermophilus при разных их соотношениях.
Streptococcus salivarius subsp. thermophilus имеет, так называемый, GRAS-статус (Generally Regarded as Safe), означающий международное признание его безопасности и разрешающий его неограниченное использование в пищевой и фармацевтической промышленности, а также безопасное применение у детей с первых дней жизни [13]. Термофильный стрептококк продуцирует бактериоцин термофилин. Вязкие и невязкие штаммы термофильного стрептококка вводят в состав заквасок, используемых в производстве йогурта, ряженки, мечниковской простокваши и некоторых видов сыров [14, 15].
Экспериментальная часть
Ферментация молока проводилась при следующих соотношениях лактобацилл «Витафлора» и S. salivarius subsp thermophilus: 1:1, 1:2 и 1:4.
Для проведения исследований в колбы со стерилизованным молоком вносили по 5 % молочной культуры на основе препарата «Витафлор» (контроль 1) и S. salivarius subsp thermophilus (контроль 2). В остальные колбы вносили определенные количества закваски на основе «Витафлора» и термофильного стрептококка в указанных соотношениях из расчета их общего количества 5 %. Ферментацию проводили при температуре (38±1) °С в течение 8 ч, до достижения титруемой кислотности 75-80 °Т. В ходе ферментации определяли титруемую кислотность, рН, а также общее число жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий (чашечным методом на среде MRS - модифицированная среда Рогозы). При этом, подсчет клеток лактобацилл и стрептококков в микроскопических препаратах проводили ме-
тодом Виноградского-Брида. [16]. А вязкость готового продукта определяли на вискозиметре «МТ 202».
Динамику роста микроорганизмов в молочной среде исследовали.на приборе <^аЫЬ (Великобритания).
Рисунок 1. Внешний вид микробиологического кондуктометрического импедансного анализатора «Rabit». Слева - два измерительно-инкубационных блока (каждый из которых может инкубироваться при отдельно задаваемой температуре, включает 32 независимо друг от друга заполняемых образцами и измеряемых ячейки, имеет габариты 400x600x400 мм и весит 35 кг). Справа -управляющий процессорный блок, к которому может быть подсоединено до 16 измерительно-инкубационных блоков.
Микробиологический кондуктометрический импеданс-анализатор «Rabit» (рисунок 1) позволяет измерять удельную линейную импедансную электропроводность X (определяемую, как величину, обратную сопротивлению потоку переменного электрического тока через проводящий материал, и вычисляемую по формуле:
X = 1 / ( l х [R2 + (2DFC)"2]1'2 ) ;
где R - активное омическое сопротивление среды; С - емкостное сопротивление среды, пФ; F - частота электрического тока, Гц; l - расстояние между электродами, см). X изменяется в результате биоконверсии присутствующих в среде питательных веществ тестируемыми микроорганизмами в процессе их жизнедеятельности.
Эти измерения на приборе «Rabit» осуществляются в течение нескольких суток в автоматическом режиме, параллельно для множества независимых жидких образцов (объемом от 2-х до 10-и мл), термостатируемых в стерильных условиях при заданной температуре (выбираемой из диапазона от +10 до + 50 °С с точностью ±0,1 °С), записывая данные, регистрируемые через каждые 6 минут отдельно для каждого образца в цифровом виде на компьютерный носитель информации, а также выводя их в реальном режиме времени в виде графика, отображаемого на мониторе управляющего компьютера. Более подробно способы применения анализатора «Rabit» к оценке общего количества клеток микроорганизмов и их жизнедеятельной активности в различных средах и в присутствии различных препаратов были описаны нами в работе [17].
Обсуждение результатов
Изменение рН молока в процессе ферментации его закваской на основе «Витафлора» и Streptococcus salivarius subsp. thermophilus раздельно и при указанных соотношениях представлено на рисунке 2. Приведенные данные свидетельствуют о более высокой кислотообразующей активности ацидофильных палочек «Витафлора» по сравнению со Streptococcus thermophilus. С увеличением в комбинации культур доли термофильного стрептококка активная кислотность молока снижалась в меньшей степени, что положительно влияло на органолептические свойства продукта. При этом, наилучшие показатели имел образец с соотношением культур 1 : 4.
Изменение pH ^-витафлор
0 2 4 6 8
Время, ч
Рисунок 2. Динамика рН при ферментации молока закваской на основе препарата «Витафлор», Streptococcus thermophilus и их соотношений 1:1,1:2 и 1:4.
Результаты исследования изменения удельной импендансной электропроводности молочной среды как чистыми культурами препаратов «Витафлор» и S. salivarius subsp. thermophilus, так и их комбинациями в различных соотношениях представлены на рисунках 3-5.
Рисунок 3. Изменение удельной линейной импендансной электропроводности молочной среды (Dc, мкСм/см), относительно начального её значения при Dx,, при культивировании в этой среде ацидофильных палочек и термофильного стрептококка в монокультуре при 37 °С. Сплошной линией (1) обозначено стерилизованное молоко. Пунктирными линиями (2) - максимальные и минимальные значения Dx, полученные при культивировании 6-и параллельных образцов, содержавших молоко с закваской «Витафлор». Сплошными линиями (3) - аналогичные данные, полученные для молока, сквашиваемого чистой культурой S. thermophilus. При < 15 ч верхняя линия 2, и нижняя линия 3 сливались.
Из рисунка 3 следует, что в первые часы ферментации штаммы L. acidophilus препарата «Витафлор» размножались несколько активнее, чем S. salivarius subsp. thermophilus. Но после 10-12 ч инкубации отмечалось достоверное снижение активности жизнедеятельности лактобацилл по сравнению с термофильным стрептококком, что можно объяснить подавлением лактобацилл роста в результате избыточного накопления в среде молочной кислоты.
Расположение кривых на рисунке 4 свидетельствует о том, что в период экспоненциальной фазы пробиоти-ческие культуры при исследуемых соотношениях размножаются практически одинаково с небольшим отставанием при соотношении 1 : 1. При этом наибольшие различия в жизнедеятельности клеток комбинаций данных культур отмечаются после 18-20 ч инкубации. Причем, по активности их можно расположить в следующем порядке: 1 : 4 > 1 : 2 > 1 : 1. Возможно, это имело место вследствие того, что в связи с образованием бактериоцинов и некоторых других продуктов метаболизма ацидофильная палочка в некоторой степени подавляет рост термофильного стрептококка, что отмечалось и другими авторами [18, 19].
0 20 40 60 Т, Ч
Рисунок 4. Изменение удельной линейной импендансной электропроводности молочной среды (Dc, мкСм/см), относительно начального её значения при t=0, при совместном культивировании в течение 3-х суток при 37 °С в этой среде штаммов L. acidophilus
и S. salivarius subsp. thermophilus с начальными соотношениями оных в закваске: 1: 1 (сплошные линии 1), 1: 2 (пунктирные линии 2) и 1: 4 (штриховые линии 3). При этом, двумя разными линиями с одинаковым цифровым обозначением показаны максимальные и минимальные значения Dx, полученные при культивировании 6-и параллельных образцов, содержавших молоко с одинаковым соотношением в закваске L. acidophilus и S. thermophilus.
т-1-1-1
0 7 14 21 Т,Ч
Рисунок 5. Изменение удельной линейной импендансной электропроводности молочной среды (Dx,, мкСм/см), относительно начального её значения при t=0, при совместном культивировании в течение 1-х суток при 37 °С в этой среде штаммов L. acidophilus и S. thermophilus с начальными соотношениями оных в закваске.
В таблице приведены физико-химические и микробиологические показатели функционального продукта, полученного путем ферментации молока комбинацией культур L. acidophilus и S. salivarius subsp. thermophilus с разным соотношением между ними.
Таблица. Показатели кисломолочного продукта с разным соотношением пробиотических культур
Показатели (через 8 ч ферментации) Соотношения культур палочки/ кокки
1 : 1 1 : 2 1 : 4
1.Титруемая кислотность, °Т 2. Общее число клеток молочнокислых бактерий, х109, КОЕ/см3 3. Соотношение числа клеток лактобациллы/трептококки, % 4. Эффективная вязкость, мПа/с 102±4 0,85±0,04 60/40 2058,4±5 92±3 1,24±0,06 40/60 2058,0±5 80±3 1,57±0,07 25/75 2058,5±5
Из приведенных данных следует, что при соотношении культур 1 : 1 число лактобацилл в 1,5 раза превышало число стрептококков, за счет чего и титруемая кис-
лотность продукта достигала высоких значений - более 100 °Т. При соотношении культур 1 : 4 число клеток стрептококков в продукте было в три раза больше, чем лактобацилл, поэтому титруемая кислотность не повышалась более 85 °Т. Общее число клеток лактобактерий постепенно увеличивалось с повышением соотношения культур в сторону стрептококков.
При исследовании реологических свойств сквашенного молока выяснилось, что наименьшей вязкостью обладал продукт, приготовленный с использованием закваски на основе препарата «Витафлор» (контроль 1), а наибольшей - продукт, полученный при сквашивании молока термофильным стрептококком (контроль 2). Образцы, сквашенные комбинацией «Витафлора» и S. salivarius subsp thermophilus при разных их соотношениях по вязкости практически не отличались друг от друга (рисунок 6).
Вязкость
"5 с S
w
Рисунок 6. Вязкость образцов молока, ферментированного препаратом «Витафлор»
и S. salivarius subsp thermophilus раздельно и их комбинацией при соотношениях 1:1; 1:2; 1:4.
Для улучшения органолептических качеств кисломолочного продукта в него вносили 10-15 % пюре брусники с сахаром, в результате чего готовый продукт приобретал привлекательный розовый цвет, приятный кисло-сладкий вкус и дополнительные функциональные свойства. В ягодах брусники содержится до 12-13 % легко усваиваемых сахаров (в том числе, 4 % глюкозы, 5 % фруктозы и 4 % сахарозы); и целый ряд биологически активных веществ: витамины (в частности, аскорбиновая кислота и бета-каротин); около 2,5 % различных органических кислот (лимонная, яблочная, уксусная, бензойная); до 9 % фенольного гликозида арбутина; до 3 % дубильных веществ; около 0,63 % растворимых пектинов. Известны также лечебные свойства брусники. Например, она обладает мочегонным, вяжущим, противовоспалительным, седативным, антисептическим действием. Ягоды брусники употребляют при гастритах с пониженной кислотностью, мочекаменной и гипертонической болезнях, колитах, полиартритах, авитаминозе и т.п. [20, 21]. Важную роль играет и присутствие в ягодах брусники такого естественного консерванта, как бензойная кислота, что позволяет продлить сроки хранения готового продукта.
Выводы
Установлено, что наиболее благоприятным для совместного развития штаммов L. acidophilus и S. salivarius sub-sp. thermophilus является соотношение между ними 1 : 4, о чем свидетельствуют данные изменения импендансной электропроводности среды, а также непосредственного подсчета количества клеток лактобактерий, содержащихся в конечном продукте. В то же время, при соотношении указанных культур 1 : 1 было отмечено снижение их активности, а также уменьшение общего числа клеток молочнокислых бактерий в продукте.
Показано, что использование закваски вязких штаммов S. salivarius subsp. thermophilus при ферментации молока позволило улучшить структурно-механические свойства функционального кисломолочного продукта и в 4 раза повысить его вязкость.
В качестве наполнителя растительного происхождения было предложено пюре брусники с сахаром, что позволи-
ло дополнительно улучшить потребительские качества готового продукта и повысить его функциональные свойства.
Литература
1. Шевелева С.А. Пробиотики, пребиотики и пробио-тические продукты. Современное состояние вопроса // Вопросы питания. 1999. № 2. С. 32-40.
2. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т. 3. Пробиотики и функциональное питание. М.: ГРАНТЪ, 2001. 288 с.
3. Егоров Н.С., Баранова И.П. Бактериоцины: образование, свойства и применение // Антибиотики и химиотерапия. 1999. № 6. С. 33-40.
4. Klaenhammer T.R. Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria // FEMS Microbiology Reviews. 1993. Vol. 12. Р. 39-86.
5. Garneau S.. Martin N.I., Vederas J.C. Two-peptide bacteriocins produced by lactic acid bacteria // Biochemie. 2002. Vol. 84. Р. 577-592.
6. McAuliffe O., Ross R.P., Hill C. Lantibiotics: structure, biosynthesis and mode of action // FEMS Microbiology Reviews. 2001. Vol. 23. Р. 285-308.
7. Иркитова А.Н., Каган Я.Р., Соколова Г.Г. Антагонистическая активность молочных культур Lactobacillus acidophilus по отношению к тест-штаммам Escherichia coli // Биологические науки. 2012. Т. 3 . Вып. 1. С. 41-44.
8. Иркитова А.Н., Каган Я.Р., Сергеева И.Я. Свойства, экологические аспекты и практическое значение ацидофильной палочки. 3. Антагонистическая активность //Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока. 2011. Вып. 8. С. 216-222.
9. Leer R.J., van der Vossen J.M.B.M., van Giesen M.[et a].] Genetic analysis of acidocin B, a novel bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus // Microbiology. 1995. V. 141. P. 1629-1635.
10. Muriana P.M., Klaenhammer T.R. Purification and partial characterization of lacticin F, a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus 11088 // J. Bacteriol. 1991. V. 57. P. 114-121.
11. Lewis C.B., Montville T.J. Detektion of bacteriocins produced by lactic acid bacteria // J. of Microbiol. Meth. 1991. V. 13. № 2. P. 145-150.
12. Петров Л.Н., Вербицкая Н.Б., Добрица В.П., Галкин Г.Н., Петров Н.Л. Бактериальные пробиотики: биотехнология, клиника, алгоритмы. СПб.: ФГУП Гос НИИ ОЧБ, 2008. 136 с.
13. "Streptococcus thermophilus: A Bacterium Which Is Harmless to Health." International Research Associates. 14 Nov. 2006. Web. 25 Apr. 2011.
14. Степаненко П.П. Микробиология молока и молочных продуктов: учеб. для вузов. М.: ООО Все для Вас-Под-московье, 1999. 415 с.
15. Тамим А.И., Робинсон Р.К. йогурт и другие кисломолочные продукты / пер. с англ. под ред. Л.А. Забодаловой СПб.: Профессия, 2003. 682 с.
16. Пименова М.Н., Гречушкина Н.Н., Азова Л.Г. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: малый практикум. М.: МГУ, 1971. 220 с.
17. Сибирцев В.С., Красникова Л.В., Шлейкин А.Г., Строев С.А., Наумов И.А., Олехнович Р.О., Терещенко В.Ф., Шабанова Э.М., Мусса Аль-Хатиб. Новый метод биотестирования с применением современных импедансных технологий. // Научно-технический вестник информационных технологий, механики и оптики. 2015. Т. 15. № 2. С. 275-284.
18. Глушанова Н.А., Блинов А.И., Бакаев В.В. Об антагонизме пробиотических лактобацилл // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2004. № 6. С. 3719. Вахитов Т.Я., Вербицкая Н.Б. Добролеж О.В., Полевая Е.В., КобатовА.И. Влияние метаболитов пробиотических и патогенных культур на антагонистическую активность Lactobacillus // Научный журнал КубГАУ 2013. № 92(08). С. 338-356
20. Большая иллюстрированная энциклопедия. Лекарственные растения / под ред. С. Афонькина. СПб.: СЗКЭО, 2014. 224 с
21. Носов А.М. Лекарственные растения. М.: ЭКС-МО-Пресс. 2000. 350 с.
