CC BY
8и 72 часа после заражения, удалось выделить возбудителя из головного мозга. Типичные для гемофилезного полисерозита поражения суставов, наблюдаемые у животных второй группы, были также подтверждены результатами бактериологического исследования.
По мнению ряда авторов [3, 4, 6], тяжесть патоморфологических изменений у свиней, экспериментально зараженных возбудителем гемофилёзного полисерозита, зависит от вирулентности штамма, заражающей дозы и способа заражения.
Выводы
1. У свиней, зараженных штаммом Н.
рагаяиЬ «ИЛ-1» в дозе 2х109 м.к. развивается септическая форма заболевания, сопровождающаяся синдромом диссеминирован-ного внутрисосудистого свертывания крови с тяжелыми нарушениями в системе го-меостаза, тромбозами и геморрагиями.
2. При септической форме заболевания возбудитель преодолевает гематоэнцефа-лический барьер, что подтверждают результаты бактериологического исследования головного мозга.
3. При заражении животных дозой 5х108 м.к. у них развивается типичная болезнь Глессера с поражением суставов конечностей.
РЕЗЮМЕ
Статья посвящена изучению патолого-анатомических и патолого-гистологических изменении у свиней, экспериментально зараженных различными дозами возбудителя гемофилёзного полисерозита свиней.
SUMMARY
Piglets at the age of 40-55 days were subjected to intraperitoneal infection by different doses of H. parasu-is «IL-1» strain. The infectious dose of 2x109 microbial cells caused death of all animals in 48-72 hours. The animals died from the septic form of the disease accompanied by the disseminated intravascular coagulation. After the inoculation with a dose of 5x10s microbial cells two animals out of four died on day 5 and 6; they demonstrated changes typical for Glasser's disease.
Литература
1. Effect on endotoxin pathogenicity in pigs with acute septicemia of Haemophilus parasuis infection / H. Amano, M. Shibata, K. Takahashi [et al.] // J. Vet. Med. Sci. 1997. Vol. 56. P. 451-455.
2. Glässer, K. Untersuchung über die Schweinseuche mit besonderer Berücksichtigung ihrer Ätiologie und Pathologic / K. Glässer // Dtsch. tierarztl. Wochen-schr. 1910. №18. S. 729-733.
3. Hoeflind, D.C. The various forms of Haemophilus parasuis / D.C. Hoeflind // J. Swine Health Production. 1994. Vol. 1, 2. P. 512-514.
4. Kielstein, P. Relationship between serology, virulence and protein patterns of Haemophilus parasuis / P. Kielstein, H. Rosner, H. Muller // Proc. Int. Pig Vet.
Soc.-Lausanne,1990. P. 180.
5. Neil, D.H. Glässer's disease of swine produced intratracheal inoculation of Haemophilus suis / D.H. Neil, K.A. McKay, C. LEcuyer // Can. J. Comp. Med. 1969. Vol. 33. P. 187-193.
6. Haemophilus parasuis septicemia in pigs / R.L. Peet, J. Fry, J. Henderson [et al.] // Australian Vet. J., 1983. Vol. 60. P. 187.
7. Rapp-Gabrielson, VJ. Haemophilus parasuis / VJ. Rapp-Gabrielson // Diseases of Swine. 8th-ed. Ames, Iowa, 1992. P. 475-482.
8. Riley, M.G. Haemophilus parasuis infection in swine / M.G.I Riley, E.G. Russel, R.B. Callinan // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1977. Vol. 171. P. 649-651.
УДК 619:616.98:579.843.96:573.6.086.83:57.083.3 Н.Б. Шадрова, О.В. Прунтова, М.А. Коржавина
ВЫЯВЛЕНИЕ АНТИТЕЛ К БАКТЕРИЯМ ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE В НЕПРЯМОМ ВАРИАНТЕ ИММУНО-ФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЛИПОПОЛИСАХАРИДНОГО АНТИГЕНА
Введение
Актинобациллезная плевропневмония свиней - респираторное заболевание, которое характеризуется при остром течении - геморрагическим воспалением легких и фибринозным плевритом, а при по-достром и хроническом — развитием оча-
говой гнойной некротизирующей плевропневмонии и фибринозным плевритом [2]. Диагноз на актинобациллезную плевропневмонию ставят на основании анализа эпизоотологических, клинических и па-тологоанатомических данных с обязательным учетом результатов бактериологи-
ческого исследования [1]. Принятая в нашей стране схема серодиагностики предусматривает выявление антител с помощью традиционных серологических реакций: реакции агглютинации, реакции непрямой гемагглютинации и реакции связывания комплемента [2]. В то же время ряд работ посвящен использованию иммунофер-ментного анализа для определения антител в сыворотке крови против бактерий A. pleuropneumoniae [4, 5, 6]. Существуют коммерческие тест-системы фирм «IDEXX» (США) и «CIVTEST» (Испания), способные выявлять антитела у инфицированных животных. В качестве антигена в перечисленных тест-системах используют реком-бинантные белки и токсины, что делает их производство дорогостоящим, поэтому целью нашей работы было создание отечественной тест-системы на основе твердофазного ИФА для выявления антител против бактерий A. pleuropneumoniae.
Материалы и методы
Бактерии A. pleuropneumoniae. В работе использовали следующие референтные штаммы бактерий, полученные из Американской коллекции типовых культур: A. pleuropneumoniae серовар 1 (штамм № 27088), серовар 2 (штамм № 27089), серовар 5 (штамм № 33377).
Сыворотки. В работе использовали сыворотки крови, полученные от вакцинированных и невакцинированных свиней.
Непрямой вариант ИФА. Выполняли по общепринятой методике. Полистироловые 96-луночные планшеты фирмы «Nunc» (Дания) сенсибилизировали липополиса-харидным (ЛПС) антигеном A. pleuropneumoniae разных серотипов в 0,1М карбонат-но-бикарбонатном буфере (pH 9,5). После 16-18 часов инкубации при 4° С содержимое лунок удаляли и вносили 1% раствор сухого обезжиренного молока для блокирования не связавшихся с антигеном свободных мест в лунках. Планшеты инкубировали 1 час при комнатной температуре. Серийные разведения контрольных (отрицательных и положительных) и испытуемых сывороток наносили по 100 мкл в лунку, начиная с разведения 1:100. Антисвиной иммунопероксидазный коньюгат (НИИ-ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи) в разведении 1:500 вносили также по 100 мкл в лунки планшета. После каждого этапа планшеты отмывали 3 раза. Для разведения тестируемых и контрольных образцов, антивидового ко-ньюгата и межэтапной промывки использовали 0,05М трис-HCl буфер с 0,2М NaCl, содержащий 0,1% твин-20 (pH 7,6). Окра-
шивали субстратной смесью ортофенилен-диамина (0,04%) в фосфатно-цитратном буфере (pH 4,9) с добавлением 0,4% Н2О2. Учитывали реакцию спектрофотометри-чески при длине волны 492 нм. По измеренным оптическим плотностям образца положительной (К+) и отрицательной (К-) контрольных сывороток рассчитывали величину (S/P) для каждого разведения, которая выражалась в виде:
S/P = (ОП - К")/( К+ - К"),
где ОП - оптическая плотность исследуемых сывороток.
Коммерческие тест-системы. В работе использовали коммерческий набор для определения антител к бактериям A. pleuropneumoniae в сыворотках крови свиней фирмы «CIVTEST» (Испания).
Результаты и обсуждение
В качестве антигена для ИФА используют как цельную бактериальную клетку, так и различные экстракты клетки [7]. На начальном этапе исследований мы сравнивали следующие антигены: прогретый при 100° С экстракт бактериальных клеток, капсульный полисахарид и липополи-сахарид, полученный путем фенольно-вод-ной экстракции. В ходе исследований получили результаты, свидетельствующие о том, что липополисахарид в большей степени отвечает требованиям, предъявляемым к антигенам для ИФА (по специфичности и активности). Кроме того, была отмечена доступность процедуры получения ЛПС антигена.
Липополисахаридный антиген получали из 18-часовой агаровой культуры A. pleuropneumoniae серовар 1 (штамм № 27088), серовар 2 (штамм № 27089), серовар 5 (штамм № 33377) методом фенольно-водной экстракции [6]. Активность антигена проверяли в непрямом варианте ИФА с контрольными сыворотками. В качестве контрольных использовали сыворотки, полученные при иммунизации свиней монопрепаратами A. pleuropneumoniae серо-вар 1 (штамм № 27088), серовар 2 (штамм № 27089), серовар 5 (штамм № 33377). Результаты проверки активности ЛПС антигенов (АГ) отражены в графической форме на рис.. Оптимальной считали такую концентрацию антигена, при которой значение оптической плотности контрольной положительной сыворотки было в диапазоне 0,9-1,2.
Исходя из полученных данных, оптимальная концентрация антигенов при нанесении на планшеты была установлена для ЛПС АГ A. pleuropneumoniae
разведение антигена Рис. Активность ЛПС антигенов А. р1еиторпеитоп1ае в ИФА
1) ЛПС АГ A. pleuropneumoniae серовар 1;
2) ЛПС АГ A. pleuropneumoniae серовар 2;
3) ЛПС АГ A. pleuropneumoniae серовар 5
Таблица 1
Константы линии регрессии для трех разведении сывороток крови свиней
Серотип Разведение
1:100 1:200 1:400
Коэффициент корреляции Стандартная ошибка Коэффициент корреляции Стандартная ошибка Коэффициент корреляции Стандартная ошибка
1 0,7733 0,051817 0,7739 0,079103 0,8339 0,059927
2 0,7179 0,046075 0,7214 0,058317 0,7658 0,038428
5 0,8080 0,037130 0,7764 0,048507 0,8102 0,039091
Таблица 2
Статистические параметры для расчета ПНП
Статистические параметры S/P
серотип 1 серотип 2 серотип 5
Среднее значение(п=103) 0,101 0,124 0,123
Минимальное значение 0,002 0,001 0,005
Максимальное значение 0,3 0,34 0,32
Стандартное отклонение 0,069320 0,076440 0,082272
Стандартная ошибка 0,008503 0,009708 0,010127
серовар 1 - 1:6400 (log2 - 12,64), ЛПС АГ A. pleuropneumoniae серовар 2 -1:3200 (log2 - 11,64), ЛПС АГ ЛПС АГ A. pleuropneumoniae серовар 5 - 1:1600 (log2 - 10,64).
Специфичность антигенов проверяли в ИФА с сыворотками крови свиней, содержащими антитела к бактериям Pas-teurella multocida, Salmonella choleraesu-is, Haemophilus parasuis и Mycoplasma hy-opneumoniae. Выбор сывороток для контрольной панели обусловливался перечнем возбудителей, от которых необходимо дифференцировать актинобациллез-ную плевропневмонию при постановке диагноза [1]. Активность антигенов с ге-терологичными сыворотками не превы-
шала фоновый уровень, полученный в реакции с отрицательной сывороткой, что свидетельствует о высокой специфичности антигенов.
С целью определения оптимального рабочего разведения сывороток вычислили зависимость титра антител, определенного методом последовательных разведений сывороток, от значений ^(8/Р), подсчитанных для 140 сывороток в разведениях 1:100, 1:200, 1:400 (8). Для каждого разведения была построена отдельная линия регрессии. Результаты регрессионного анализа по трем серотипам представлены в табл. 1.
Полученные данные показывают, что все представленные разведения име-
Таблица 4
Результаты исследования сывороток свиней с использованием разработанной тест-системы (п=25)
Таблица 3
Пороговые значения S/P
Серотип Группы сывороток
отрицательные сомнительные положительные
1 0-0,240 0,240-0,310 0,31 и выше
2 0-0,280 0,280-0,350 0,35 и выше
5 0-0,290 0,290-0,370 0,37 и выше
Статус животных Средние значения S/P
серотип 1 серотип 2 серотип 5
До вакцинации 0,024+0,01 0,28+0,025 0,1+0,05
После 1- й вакц. 0,024+0,01 0,36+0,04 0,27+0,03
После 2- й вакц. 0,43+0,04 1,02+0,1 0,47+0,04
Таблица 5
Результаты исследований сывороток в двух тест-системах
Результаты в наборе CIVTEST Положительные результаты в Н-ИФА Отрицательные результаты в Н-ИФА
Положительные 149 140 9
Отрицательные 36 1 35
Всего 185 141 44
ют сильную корреляционную связь, однако оптимальные значения коэффициента корреляции и стандартной ошибки имеет разведение 1:400. Это разведение было принято в качестве рабочего.
Для объективной оценки иммунного ответа установили позитивно-негативный порог (ПНП). Предварительно протестированные в реакции агглютинации и в коммерческом наборе «CIVTEST APP» (Испания) 103 отрицательные сыворотки крови свиней исследовали в непрямом ИФА в разведении 1:400 с антигенами трёх серотипов. ПНП определяли, рассчитывая средние значения S/P отрицательных сывороток, прибавляя три значения стандартного отклонения (для расчета верхней границы ПНП) и два значения стандартного отклонения (для расчета нижней границы ПНП) [8]. Значения S/P, лежащие в диапазоне между нижней и верхней границей ПНП, признавали сомнительными.
В итоге установили пороговые значения S/P для разных групп сывороток, которые приведены в табл. 3.
Одним из этапов нашей работы было тестирование сывороток крови свиней, полученных до и после иммунизации животных, с применением иммуно-ферментной тест-системы на основе ЛПС антигенов. Животных иммунизировали двукратно с интервалом в 21 день вакциной, содержащей три сероварианта A. pleuropneumoniae: серовариант 1, серова-риант 2, серовариант 5. Результаты иссле-
дований представлены в табл. 4.
Из данных таблицы видно, что сыворотки до вакцинации, по всем трем серо-типам, показали себя как отрицательные. После первой вакцинации значение S/P для 5 серотипа достигло уровня сомнительных, а для 2 серотипа - слабоположительных результатов. После второй вакцинации сыворотки, по всем трем серотипам, были оценены как положительные.
Полученные данные позволяют сделать заключение, что разработанные нами тест-системы пригодны для оценки уровня накопления антител после вакцинации.
Кроме того, мы проанализировали полевые сыворотки (n=185) параллельно в разработанных нами тест-системах (Н-ИФА) и в коммерческом наборе «CIVTEST APP» (Испания), что позволило рассчитать чувствительность и специфичность набора относительно коммерческого теста. Результаты исследований представлены в табл. 5.
Чувствительность метода вычисляли как:
А/Вх100%, где
А - количество положительных проб при тестировании в разработанном варианте ИФА, совпадающее с количеством положительных проб в «CIVTEST АРР»;
В - количество положительных проб в «CIVTEST АРР».
Специфичность вычисляли как C/Dx100%, где
С - количество отрицательных резуль-
татов в разработанном варианте ИФА, совпадающее с количеством отрицательных проб в «С1УТЕ8Т АРР»;
D - количество отрицательных проб в «С1УТЕ8Т АРР».
Чувствительность разработанного метода относительно коммерческой тест-системы составила 94%, специфичность - 97%.
Таким образом, сравнительный анализ данных, полученных при тестировании сы-
вороток крови свиней в двух реакциях, показал высокую специфичность и чувствительность разработанного метода при анализе полевых сывороток.
Выводы
На основе липополисахаридных антигенов разработан непрямой вариант ИФА для определения антител к бактериям A. pleuropneumoniae серотип 1, се-ротип 2, серотип 5 в сыворотках крови свиней.
РЕЗЮМЕ
Разработана тест-система на основе непрямого варианта иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием липополисахаридных антигенов A. pleuropneumoniae серотипов 1, 2 и 5 для выявления антител в сыворо тках крови свиней. SUMMARY
A test-system on the basis of indirect ELISA using lipopolysaccharide antigens of A. pleuropneumoniae serotypes 1, 2 and 5 for detection of antibodies in porcine sera was developed.
Литература
1. Лабораторные исследования в ветеринарии. Бак- rological profiles / K. Chiers, E. Donne, I. Overbeke
териальные инфекции: Справочник / Б.И. Анто- [et al.] // Vet. Microbil. 2002. V85, №4. Р. 343-352. нов, В.В. Борисова, П.М. Волкова [и др.] М.: Аг- 6. Serodiagnosis of Swine Pleuropneumonia due to
ропромиздат, 1986. С. 240-243.
2. Сидоров, М.А. Гемофилезы животных / М.А. Сидоров, Д.И.Скородумов. М.: Агропромиздат, 1986. С. 50-51.
3. Шадрова, Н.Б. Получение специфических компонентов Actinobacillus pleuropneumoniae для иммуноферментного анализа / Н.Б. Шадрова, О.В. Прунтова, О.И. Ручнова // Ветеринарная патология. (В печати)
4. Detection of antibodies to Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 12 in pig serum using a blocking enzyme-linked immunosorbent assay / L.O. Andresen, J. Klausen, K. Barfod, V Sorensen // Vet. Microbiol. 2002. V89. P. 61-67.
5. Chiers, K. Actinobacillus pleuropneumoniae infections in closed swine herds: infection patterns and se-
Actinobacillus pleuropneumoniae Serotype 7 and 4 Using Long-Chain Lipipolysaccharides / M. Gott-schaik, E. Altman, N. Charland [et al.] // Can. J. Vet. Res. 1997. V61. P. 62-65.
7. Evaluation of saline boiled extract, capsular poly-saccharides and long-chain lipopolysaccharides of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1 as antigens for serodiagnosis of swine pleuropneumonia / M. Gottschaik, E. Altman, N. Charland [et al.] // Vet. Microbiol. 1994. V42. P. 91-104.
8. Rapid serological profiling by enzyme - linked immun-jsorbent assay. 2.Comparison of computation methods for measuring antibody titers in a single serum dilution / D.B. Snyder, WW Marquardt, E.T. Malison, E. Russec // Avian Dis. 1982. Vol.27. P. 474-484.
УДК 619:616.98:579.843.94:615.371
Ф.А. Ширяев, А.В. Потехин, В.С. Русалеев
РАЗРАБОТКА ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГЕМОФИЛЕЗНОГО ПОЛИСЕРОЗИТА СВИНЕЙ
Введение
В настоящее время респираторная патология свиней остается одной из наиболее актуальных и экономически значимых проблем ветеринарии. В этой категории ведущее место занимают болезни бактериальной этиологии, в частности гемофилез-ный полисерозит свиней (болезнь Глессе-ра). Заболевание широко распространено на территории Российской Федерации [3, 5] и характеризуется серозно-фибринозным воспалением перикарда, плевры, брюшины, а также артритом и негнойным менин-гоэнцефалитом [7, 9].
Основополагающим в комплексе ме-
роприятий по борьбе с гемофилезным полисерозитом является профилактическая иммунизация животных [7, 8]. В качестве средств иммунопрофилактики за рубежом предложен ряд сорбированных и эмульсионных инактивированных вакцин. Однако имеющиеся биопрепараты из-за высокой стоимости не нашли широкого применения в нашей стране, что вызывает необходимость изыскания новых средств специфической профилактики данного заболевания.
В технологии изготовления противо-бактериальных вакцин главное место отводится этапу получения микробной мас-
