CC BY
26
свинья
УДК 619:616.98:579.843.94-078
Апробация схемы Kielstein-Rapp-Gabrielson серотипирования Haemophilus parasuis
М. Рафайи, П.Дж. Блекелл, Australasian Pig Institute, Animal Research Institute, Queensland (Австралия)
Ключевые слова: бактерии, серотипирование
Сокращения: Hp — Haemophilus parasuis; CTKRG— схема серотипирования Kielstein-Rapp-Gabrielson
Введение
Hp — возбудитель болезни Глассера, которая сопровождается фибринозными или серофибринозными менингитом, полисерозитом, плевритом, перикардитом, перитонитом и артритом. Эти симптомы могут проявляться поодиночке или в комбинации друг с другом [8].
В Северной Америке болезнь Глассера вызывает значительные экономические потери в свиноводческих хозяйствах, в которых проводят ранний отъем поросят [1]. Эту систему начинают применять австралийские фермеры. Не исключено что и они столкнутся с той же проблемой.
СТКК1 |5] стала международной схемой типирования Hp. Интерес к ней возрос из-за отсутствия единого мнения относительно того, является ли протективный иммунитет, индуцируемый инактивированными вакцинами из Hp, сероваро-или штаммо-специфичным [4, 6, 12, 13]. Предварительные исследования, проведенные в США, показали, что в Австралии циркулируют серовары Hp 1, 2, 4, 5, 9, 10/7, 12 и 13, причем 5 и 13 — встречаются наиболее часто [3].
В данной публикации сообщаем о получении антисыворотки к 15 сероварам Hp и результатах применения этих антисывороток для типирования в СТККЦ 46 австралийских полевых изолятов.
Материалы и методы
Штаммы бактерии. Референтные штаммы Hp, относящиеся к сероварам 1...15, предоставил д-р В. Рапп-Габриел-сон (Fort Dodge, США). В эксперименте также использовали 63 австралийских изолята агента, 17 из которых были ранее типированы в CTKRG [3], а 46 идентифицированы традиционным фенотипическим методом [2].
Среда. Для культивирования Hp в основном пользовались агаровой средой TM/SN [11]. На шоколадном агаре бактерию выращивали только для получения антигенов, предназначенных для гипериммунизации кроликов. На кровяном агаре, который готовили с 5 % эритроцитов барана, проверяли чистоту суспензий культур. Все штаммы выращивали при 37 °С.
Приготовление антисывороток
Свежую культуру референтного штамма после культивирования в течение ночи на среде TM/SN смывали 1 мл бульонной среды. Полученную суспензию рассевали по чашкам Петри, с которых после инкубации в течение ночи смывали бактерии 1,5 мл фосфатно-буферного раствора (pH 7,2). Суспензии, чистоту которых удалось подтвердить высевом на шоколадный агар, сливали, доводя концентрацию в пуле бактерий приблизительно до 2...4 х 10э колониеобразующих единиц/мл (по оптическому стандарту плотности МакФар-
ланда № 9) и инактивировали 0,3 % формальдегида. Полученные антигены хранили при 4 °С.
Гипериммунные антисыворотки к референтным и местным штаммам Нр получали на кроликах 12-недельного возраста по описанной ранее методике [10]. Каждым штаммом гипериммунизировали 2 кроликов. Для получения антисыворотки к некоторым сероварам понадобились 2, а иногда и 3 курса внутривенной гипериммунизации, которые проводили с 2-дневным интервалом через 10... 17 дней после первоначальной иммунизации. Пробы сыворотки получали из ушной вены кроликов через 9... 12 дней после завершающей иммунизации. Если в сыворотке обнаруживали достаточно высокий титр специфических антител, у кроликов в условиях общей анестезии брали максимальное количество крови (пункцией сердца).
Процедура серотипирования
Термостабильные экстракты референтных и местных штаммов Нр получали посредством их автоклавирования при 121 "С в течение 2 ч по описанной ранее методике [7], с той лишь разницей, что в качестве ростовой среды применяли агар TM/SN.
Серотипирование проводили в реакции иммунодиффу-зии. Для постановки теста пользовались 1%-м агаровым гелем, приготовленным на фосфатно-буферном растворе с 1 % азида натрия. В вырезанные в геле лунки вносили по 8 мл каждой антисыворотки и антигена, оставляя их при комнатной температуре (в условиях повышенной влажности) на 72 ч. Результаты учитывали по наличию полос преципитации через 24, 48 и 72 ч после внесения реагентов в лунки.
Результаты
Мы получили антисыворотки к сероварам 1...15 Нр. При работе с некоторыми из них возникли трудности. Иногда требовалось проведение дополнительных циклов внутривенной гипериммунизации. Но и такого подхода оказалось недостаточно для сероваров 4 и 8: ими пришлось гиперим-мунизировать новую партию кроликов. Не удалось получить достаточно активную сыворотку к серовару 7 из референтного штамма 174. Поэтому для получения антисыворотки к этому серовару пришлось воспользоваться австралийским штаммом HS197. Не удалось получить антисыворотку к серовару 1 из референтного штамма 4. Его заменили австралийским штаммом HS 145 — оба штамма се-ротипировали в США [1].
Все полученные антисыворотки проверили в реакции им-мунодиффузии с референтными штаммами, относящимися к 15 сероварам Нр. Подтвердили специфичность антисывороток к 14 из них. Антисыворотка к серовару 4 дала перекрестную реакцию с референтным штаммом серовара 14, которая проявилась бледной полосой преципитации, расположенной приблизительно на уровне центра лунки с антисывороткой. Такой реакции между антисывороткой к серовару 14 и антигеном серовара 4 не наблюдали.
С целью оценки качества полученных антисывороток
_
свинья
провели ими повторное тестирование 15 австралийских штаммов Нр, ранее типированных в США [1]. Их отобрали по принципу соответствия наиболее распространенным в Австралии сероварам агента: 1-му (1 штамм), 2-му (1 штамм), 5-му (5 штаммов), 7-му (1 штамм), 9-му (2 штамма) и 13-му (5 штаммов). Проверка показала, что первоначальное серотипирование [1) во всех случаях было точным.
С помощью полученных антисывороток тестировали 46 австралийских штаммов Нр, чей серотип не был известен. Установили, что 27 из них относятся к сероварам 5 и 13 (таблица). Определить серотин остальных (19) штаммов не удалось.
Характеристика серотипированных австралийских штаммов Нр
Обозначения, нт — нетипированные
Обсуждение
Приготовление типоспецифических сывороток к Нр для СТккс — трудная процедура. Нам не удалось получить специфическую антисыворотку гипериммунизацией кроликов типовым для серовара 7 штаммом 174. Это подтверждает мнение В.Дж. Рапп-Габриельсон и Д.А. Габриельсон [10], столкнувшихся с тем, что упомянутый штамм мало или нестабильно экспрессирует сероваросиецифические антигены. Нам удалось получить антисыворотку с высоким титром антител к серовару 7 гипериммунизацией кроликов австралийским штаммом Н5197.
Аналогичная неудача постигла нас с референтным штаммом Нр, относящимся к серовару 1. Раньше такой проблемы при работе с данным штаммом не наблюдали. Антисыворотку к серовару 1 мы, как и в предыдущем случае, получили гипериммунизацией кроликов австралийским штаммом 118145. Таким образом, при приготовлении набора, состоящего из 15 необходимых для СТКК(. антисывороток, использовали 13 референтных и 2 местных штамма Нр. Все антисыворотки были моноспецифическими, за исключением антисыворотки к серовару 4. которая перекрестно реагировала с сероваром 14 референтного штамма. Поскольку референтный штамм, относящийся к серовару 4, не реагировал с антисывороткой к серовару 14, то данный феномен не препятствовал идентификации сероваров 4 и 14.
Имеются сообщения о том, что полученная с помощью австралийского штамма Н5197 антисыворотка реагировала с сероварами 7 и 10 [1 ]. Нам удалось получить из него антисыворотку к серовару 7, которая не реагировала с референтным штаммом, относящимся к серовару 10. Поэтому 4 австралийских изолята, которые раньше относили к серовару 7/ 10 111. следует отнести к серовару 7. Необходимо дополнительно изучить причины перекрестных реакций между этими сероварами.
Специфичность полученных нами антисывороток подтверждается правильностью серотипнрования 15 австралийских штаммов, ранее идентифицированных с помощью антисывороток, которые приготовили В.Дж. Рапп-Габриельсон и Д.А. Габриельсон [1].
При исследовании ранее нетипировавшихся 46 австралийских штаммов Нр установили их принадлежность к серо-
варам 2, 4, 5, 12 и 13, о циркуляции которых в свиноводческих хозяйствах Австралии уже сообщалось ранее [1]. Наибольшее число изолятов относилось к сероварам 5 и 13. Не удалось типировать 19 из 46 (41 %) австралийских штаммов. В США и Германии частота обнаружения нетипируемых изолятов агента значительно ниже — 15 и 26 % соответственно [5, 10]. Следует, однако, иметь ввиду, что 12 из 19 нетипи-рованных австралийских штаммов по результатам ПЦР представляли собой изоляты одного и того же нетипируемо-го штамма Нр [9].
Заключение
Проведенные нами исследования показали, что в Австралии циркулирует большое число сероваров Нр [11. Это следует учесть при создании вакцин против вызываемого этим агентом заболевания. Поскольку окончательно не решен вопрос о том, какой иммунитет создают у свиней инактивиро-ванные вакцины против инфекции Нр — сероваро- или штаммоспецифический [4, 7, 9, 12], то в их состав необходимо включать штаммы, относящиеся к сероварам, доминирующим в данной популяции свиней, или готовить их из местных изолятов. При этом надо учитывать тот факт, что в стаде свиней может одновременно циркулировать более одного серовара Нр.
На основании серотипнрования Нр в Австралии может быть осуществлена эффективная система контроля заболевания, вызываемого этим возбудителем.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Anon. Pathogenesis of disease in SEW pigs. Pig News Inform, 1997,18, 65—66.
2. Blackall P.J., PahoffJ. Characterisation of porcine haemophili isolated from Australian pigs, 1988—1992. Aust Vet J, 1995, 72, 18—21.
3. Blackall P.J., Rapp-Gabrielson V.J., Hampson D.J. Serological characterisation of Haemophilus parasuis isolates from Australian pigs. Aust Vet J, 1996. 73, 93—95.
4. Kielstein P., Rassbach A. Serologische Typisierung und Nachweis immu-nogener Kreuzreaktionen von Haemophilus parasuis. Mh Vet-Med, 1991, 46. 586—589.
5. Kielstein P., Rapp-Gabrielson V.J. Designation of 15 serovars of Haemophilus parasuis on the basis of immunodiffusion using heat-stable antigen extracts. J Clin Microbiol, 1992, 30, 862—865.
6. Miniats O.P., Smart N.L., Rosendal S. Cross protection among Haemophilus parasuis strains in immunized gnotobiotic pigs. Can J Vet Res, 1991, 55. 37—41.
7. Morozumi Т., Nicolet J. Some antigenic properties of Haemophilus parasuis and a proposal for serological classification. J Clin Microbiol, 1986. 23, 1022—1025.
8. Nicolet J. Haemophilus parasuis. In: LemanA.D. et al (Eds.). Diseases of Swine. 6,h edn. Iowa State Univ Press, Ames, 1992, 526—528.
9. Rafiee M., Вагб M.R., Stephens C.P., Blackall P.J. Application of ERIC-PCR for the fingerprinting of Haemophilus parasuis. Aust Vet J, 2000, 78, 12, 846—849.
10. Rapp-Gabrielson V.J.. Gabrielson D.A. Prevalence of Haemophilus parasuis serovars among isolates from swine. Am J Vet Res, 1992, 53, 659—664.
11.ReidG.G., Blackall P.J. Comparison of adjuvants for an inactivated infectious coryza vaccine. Avian Dis, 1987, 31, 59—63.
12. Riising H-J. Prevention of Glasser disease through immunity to Haemophilus parasuis. Zbl Vet Med B, 1981, 28, 630—638.
13. Smart N.L, Miniats O.P. Preliminary assessment of a Haemophilus parasuis bacterin for use in specific pathogen free swine. Can J Vet Res. 1989,53, 390—393.
SUMMARY
M. Rafiee, P.J. Blackall. Establishment, validation and use of the Kielstein—Rapp—Gabrielson serotyping scheme for Haemophilus parasuis. Aust Vet J, 2000, 78,172—174.
Monospecific antisera were produced for 14 of the 15 serovars of H.parasuis. Two Australian field isolates, confirmed previously as serovars 1 and 7, were used to produce monospecific antisera for serovars 1 and 7 respectively. The antiserum for serovar 4 gave a one-way cross reaction with the antigen of serovar 14. The typing antisera correctly typed all 15 H. parasuis that had been previously typed by antisera produced overseas. The 46 field isolates were shown to belong to serovars 2 (2 isolates), 4 (1 isolate), 5 (18 isolates), 12 (2 isolates) and 13 (4 isolates). The remaining 19 isolates were non-typable.
Место изоляции Серовары
2 4 5 12 13 нт всего
Новый Южный Уэльс — 1 2 — 2 1 6
Виктория 1 — 3 — — 7
Квинспанд 1 — 13 1 2 15 32
Южная Австралия 1 1
Всего 2 1 18 2 4 19 46
РВЖ СХЖ №2-2006
31
