CC BY
192
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ АЛЛЕРГОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 616-056.43-078.33
В. В. Тютяева* 1, А. В. Пивоварова1, И. В. Андреев2, М. Н. Санков2, Ю. В. Кузьменко1,
Е. С. Стародубова1, А. И. Мартынов2, В. Л. Карпов1
выделение рекомбинантного белка, содержащего антигенные эпитопы актуального аллергена BETV2 березы повислой
1ФГБУН Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991, г Москва, e-mail: [email protected]; 2ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА, 115478, г. Москва
Разработана система по наработке препарата рекомбинантного аллергена BetV2, пригодного для иммунологических тестов. Для этого из пыльцы березы, собранной на территории РФ, был клонирован ген аллергена BetV2. Затем ген включен в вектор для экспрессии в бактериальных клетках, при этом на С-конец белка была добавлена последовательность из шести гистидинов. Получен экспрессионный штамм клеток E. coli. Разработана методика выделения рекомбинантного белка BetV2 из телец включения с помощью одного раунда хроматографической очистки на Ni-агарозе. Полученный высокоочищенный препарат рекомбинантного аллергена был активен в иммунологических тестах ИФА и иммуноблоте.
Ключевые слова: аллерген пыльцы, береза повислая, BetV2, профилин, методика очистки
V.V. Tyutyaeva1, A.V Pivovarova1,1. V. Andrev2, M. N. Sankov2, Yu.V Kuz’menko 1, E. S. Starodubova 1, A. I. Martynov2,
V. L. Karpov 1
1 Of VA. Engelhardt Institute of molecular biology RAS, 119991, Moscow, 2 Institute of immunology of Federal medical-biological Agency, 115478, Moscow.
ALLOCATION OF RECOMBINANT PROTEIN THAT CONTAINS ANTIGENIC EPITOPES OF CONTEMPORARY ALLERGEN BETV2 BIRCH
Developed a system running the preparation of recombinant allergen BetV2 suitable for immunological tests. For this purpose from birch pollen collected on the territory of the Russian Federation, was cloned gene allergen BetV2. Then gene is turned on in the vector for the expression in bacterial cells, while at С-end of protein has been added sequence of six histidine. Retrieved expressive cell strain of E.coli. Developed a methodology for the selection of recombinant protein BetV2 of Taurus include using a single round of purification of the Ni agarose. The resulting highly purified preparation of recombinant allergen was active in immunological tests of enzyme immunodetection and immunoblot.
Keywords: allergen pollen, birch, BetV2, profilin, the procedure for cleaning
Введение. Для больных весенним поллинозом в Центральной и Северной Европе одним из значимых аллергенов является пыльца березы. Аллергены белковой природы «паналлергены», белок Betv1 и профилин Betv2 березы ответственны за перекрестное реагирование аллергенов пыльцы весенних деревьев [1]. Betv2 является минорным аллергеном пыльцы березы и принадлежит к семейству профилинов - актинсвязывающих белков, способствующих организации цитоскелета из сети актиновых филаментов. Профилины как перекрестно-реагирующие аллергены могут быть обнаружены не только в пыльце неродственных растений (деревья, травы, водоросли), но и в тканях других растений (фрукты, овощи, орехи, пряности и латекс) [2]. BetV2 узнается антителами (АТ) IgE у 10% пациентов, подверженных аллергии на березу. Соответственно BetV2 можно считать маркерным аллергеном для синдромов, включающих перекрестную реактивность с многочисленными неродственными растениями и растительными продуктами.
Для иммунодиагностики аллергии необходимы образцы аллергенов. Препараты аллергенов, получаемые из природных источников, неоднородны. Они содержат одновременно аллергенные и неаллергенные молекулы, что затрудняет их стандартизацию. Применение современных технологий молекулярного клонирования и создания рекомбинантных белков позволяет получить стандартные препараты, прекрасно характеризующиеся в иммунохимическом плане [3, 4]. Целью данной работы стала разработка иммунологически активного рекомбинантного белка-аллергена BetV2 пыльцы березы.
Материалы и методы. Получение генно-инженерной конструкции, кодирующей белок-аллерген BetV2. Из образца пыльцы березы выделили мРНК с использованием кита RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen). С помощью методики
SMART [5, 6] была получена библиотека кДНК. С помощью полимеразно-цепной реакции (ПЦР) с праймерами ТорV2/ NdeI (5’-GT CAGT CATATGT CGTGGCAAACGTACGTGGA TG-3’) и BotV2/XhoI (5’-GTGCGTCTCGAGCAGGCCCTGG TCAATAAGGTA-3’), с кДНК амплифицировали ген BetV2. Полученный ПЦР-фрагмент гена BetV2 (402 п.н.) клонировали в вектор pET-29b(+) (Novagen) по сайтам NdeI и XhoI. Нуклеотидную последовательность клонированного фрагмента подтверждали секвенированием района встройки в ЦКП «Геном» Института молекулярной биологии РАН.
Очистка рекомбинантного аллергена BetV2. Рекомбинантный белок BetV2 экспрессировали в клетках E. coli штамма BL21(DE3), трансформированных плазмидой pET29b(+)-BetV2. Отдельную колонию помещали в 100 мл ростовой среды (LB c 50 мг/мл канамицина) и растили в течение 18 ч при 200-300 об/мин 37oC. Полученную культуру переносили в 2 л ростовой среды и инкубировали при перемешивании и 37°С. При достижении оптической плотности среды OD600=0,6-0,8
о.е. проводили индукцию 0,5 мМ IPTG (изопропил-p-D-тиогалактопиранозид) и инкубировали 4 ч в тех же условиях. Затем клетки осаждали центрифугированием при 3500 об/мин в течение 30 мин при 4°С. Осадок клеток суспендировали в 50 мл буфера А (50 мM Tris-Cl pH 8, 0,2 M NaCl, 2% Triton X-100, 1 4M EDTA) и обрабатывали ультразвуком на приборе УЗД2-0.063/22. Полученный лизат центрифугировали при 15 000»g в течение 30 мин. Осадок суспендировали в лизирующем буфере (5 мМ Tris-Cl pH 8, 0,5 M NaCl, 8 M мочевина) и осветляли центрифугированием при 15 000»g в течение 30 мин. Лизат инкубировали агарозой с Ni-NTA («Amersham» His Trap FF Columns 1 мл) в течение 3 ч при 4°C при медленном покачивании. Промывали дважды буфером В (50 мM Tris-Cl pH 8, 0,5 M NaCl, 8 M мочевина), после чего использовали
- 215 -
ИММУНОЛОГИЯ № 4, 2013
буфер В с добавлением имидазола в повышающейся концентрации: 25, 50, 150 и 250 мМ. Целевой белок элюировали 5 мл буфера элюции (50 мM Tris-Q pH 7, 0,25 M NaQ, 6 M мочевины, 500 мМ имидазола, 0,02 М ЕДТА). Фракции, собранные в процессе очистки, разделяли в 16% ПААГ в денатурирующих условиях и окрашивали Кумасси. Пробы, содержащие белок Betv2, объединяли и диализовали против 50 мМ Na2HPO4 pH 7,5, 150 мМ NaCl, 3 М мочевины, 5 мМ в-меркаптоэтанола, затем против 50 мМ Na2HPO4 pH 7,5, 150 мМ NaCl, 5 мМ в-меркаптоэтанола. Нерастворимые частицы белка после диализа удаляли центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин при 4°C.
Определение иммунологической активности препарата рекомбинантного белка BetV2 осуществляли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) и иммуноблотта [2].
Для ИФА пластик сенсибилизировали раствором аллергена 10 мкг/мл в бикарбонатно-карбонатном буфере рН 9,6-9,8 в течение 16-18 ч при 4°С. После 3-кратной отмывки в лунку вносили по 50 мкл образца и 50 мкл ФСБ с твином. После инкубации в течение 40 мин при комнатной температуре и 3-кратной отмывки вносили по 100 мкл конъюгата к IgE пероксидазы хрена с моноклональными антителами к IgE человека (4H10, ООО "Сорбент") в разведении 1:10 000. После инкубации в течение 40 мин при комнатной температуре и 3-кратной отмывки реакцию проявляли тетраметилбензидином. В качестве контроля неспецифического связывания использовали результаты реакции в лунках без внесенной сыворотки. При регистрации значений оптической плотности на многоканальном спектрофотометре результаты контроля автоматически вычитали.
Иммуноблотт проводили по методике, описанной ранее [1]. А именно - препарат рекомбинантного белка и контрольного аллергена разделяли в ПААГ и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Блотт последовательно инкубировали с сыворотками больных специфическими АТ к IgG или IgE.
Результаты и обсуждение. В ходе работы была создана система по наработке препарата рекомбинантного аллергена Betv2, пригодного для иммунологических тестов. На первом этапе из пыльцы березы, собранной на территории РФ, клонировали ген аллергена Betv2. Ген был включен в вектор pET29b(+) для экспрессии в бактериальных клетках, при этом на С-конец белка добавили последовательность из шести гистидинов. С данной плазмидой получили экспрессионный штамм клеток E. coli. После индукции IPTG в бактериальных клетках активировался синтез рекомбинантного белка (см. рисунок), который накапливался в тельцах включения.
Затем мы разработали методику выделения рекомбинантного белка Betv2 из телец включения с помощью одного раунда хроматографической очистки (см. рисунок). Так, после лизиса бактериальных клеток с помощью центрифугирования получали осадок, содержащий тельца включения, который растворяли в буфере с мочевиной. Дальнейшее выделение рекомбинантного белка проводили с помощью хроматографии на агарозе Ni. В результате получили высокоочищенный препарат рекомбинантного аллергена. Для дальнейшего использования препарат белка диализовали.
При анализе с помощью электрофореза конечного препарата рекомбинантного белка Betv2 детектировали мажорную (> 95%) индивидуальную полосу белка молекулярной массой 14 кД, что соответствует литературным данным [6]. Следует отметить высокую стабильность полученного препарата. Так, образец, хранившийся в течение года при 4°С, также проанализировали с помощью электрофореза. В пробе не были детектированы продукты деградации, обнаружили лишь незначительное образование мультимерных форм.
Полученный препарат рекомбинантного белка Betv2 проанализировали на иммунологическую ак-
Результаты испытаний сывороток на иммунологическую активность к рекомбинантному белку BetY2
ImmunoCAP Max class (kUA) - 6 ИФА (ОД) Иммуноблотт (качественно)
0 (менее 0,35) 0,212 -
2 (3,12) 0,505 -
3 (11,3) 0,273 -
3 (14,6) 0,420 -
3 (5,71) 0,380 -
3 (6,91) 0,202 -
3 (7,02) 0,236 -
4 (22,4) 0,230 -
4 (23,2) 0,420 -
4 (28,3) 0,250 -
4 (29,2) 0,320 -
5 (54,3) 0,226 -
5 (60,0) 0,266 +
6 (более 100) 0,150 -
6 (более 100) 0,211 +
тивность в ИФА и иммуноблотте. Для этого использовали вы-сокотитражные сыворотки пациентов с IgE против пыльцы березы, предварительно охарактеризованные по коммерческому тесту ImmunoCAP (Specific IgE картридж T3 - смесь аллергенов березы). В ИФА полученный препарат проявил активность в отношении всех использованных сывороток (см. таблицу). Следует отметить, что узнавание рекомбинантного белка Betv2 сыворотками различалось, что говорит о разной степени сенсибилизации пациентов к данному аллергену. В иммуноблотте препарат рекомбинантного белка Betv2 был активен только в 15% случаев. По всей видимости, активные эпитопы данного аллергена в основном конформационные и активны в ИФА, тогда как линейные эпитопы, активные в иммуноблотте, составляют малую часть. Поэтому данный препарат может быть использован для точной диагностики профиля сенсибилизации пациента с помощью ИФА и подбора специфического лечения.
Таким образом, мы создали систему для наработки препарата рекомбинантного аллергена BetV2, пригодного для иммуно-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Стадии очистки рекомбинатного белка BetV2.
1, 2 - лизаты бактерий до и после индукции 0,5 мМ IPTG соответственно: 3 - осадок, нерастворившийся в лизирующем буфере; 4 - образец, нанесенный на колонку; 5 - фракция белков, не связавшихся с Ni-агаразой; 6, 7 - промывка колонки буфером B; 8-14 - промывка колонки буфером В с имидазолом 25мМ (дорожка 8), 50 мМ (дорожки 9, 10) и 150 мМ (дорожки 11, 12); 13, 14 - элюция. Образцы с каждой стадии разделены в 16% полиакриамидном геле, белки выявлены окрашиванием геля раствором Кумасси бриллиантовый синий. Справа указаны положения белковых маркеров молекулярных масс (кД)
- 216 -
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ АЛЛЕРГОЛОГИЯ
логических тестов. Данная система включает одностадийную очистку белка на агарозе Ni из телец включения. Результаты иммунологических исследований показали пригодность данного препарата для использования в ИФА и иммуноблотте. Полученный высокоочищенный продукт может быть использован при создании современных тест-систем для диагностики аллергии.
Работа проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (государственный контракт № 16.512.11.2068 от 16 февраля 2011 г.).
ЛИТЕРАТУРА
2. Бызова Н. А., Сотников Д. В., Жердев А. В., и др. Иммунохроматографический анализ уровня специфического сывороточного IgE человека для диагностики аллергии на пыльцу тимофеевки луговой. Иммунология. 2010; 1: 47-51.
3. Казиев АХ., РайкисБ.Н., Пожарская В.О. Перспективы разработки рекомбинантных аллергенов. Аллергология. 2002; 2: 17-20.
REFERENCES
1. Zhu Y.Y., Machleder E.M., Chenchik A. et al. Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 2001; 30: 892-7.
2. Byzova N. A., Sotnikov D. V., Zherdev A. V., i dr. Immunologiya. 2010; 1: 47-51. (in Russian).
3. Kaziev A.Kh., Raykis B.N., Pozharskaya V.O. Allergologiya. 2002; 2: 17-20. (in Russian).
4. Erler A., Hawranek T., Kruckemeier L. et al. Proteomic profiling of birch (Betula verrucosa) pollen extracts from different origins. Proteomics. 2011; 11 (8): 1486-98.
5. Cromwell O., Hafner D., Nandy A. Recombinant allergens for specific immunotherapy. J. Allergy Clin. Immunol. 2011; 127(4): 865-72.
6. Schmidt W.M., Mueller M.W. CapSelect: a highly sensitive method for 5’ CAP-dependent enrichment of full length cDNA in PCR-mediated analyses of mRNAs. Nucleic Acid Res. 1999; 27: 31.
Поступила 18.10.12
© Л.И. АЛЛАХВЕРДИЕВА, У.М. ГУМБАТОВА, 2013 УДК 616.248-022.6-053.2-092:612.017.1]-078.33
Л.И. Аллахвердиева, У.М. Гумбатова
иммунные нарушения при бирусиндуциробанной бронхиальной астме У ДЕТЕЙ
Азербайджанский медицинский университет, Баку, Республика Азербайджан
Авторы определяли содержание основных субпопуляций лимфоцитов периферической крови, уровень интерферона (IFN)y, а также растворимой молекулы адгезии sICAM-1 в сыворотке крови больных вирусиндуцированной бронхиальной астмой (БА). Концентрацию IFNy и sICAM-1 определяли иммуноферментным методом. Показано, что в сыворотке крови больных снижается содержание IFNy. Это доказывает, что развитие Т-клеточного ответа при вирусиндуцированной БА происходит путем смещения равновесия популяций Th1 и Th2 в сторону T-хелперов второго типа. Оценка сывороточного уровня молекулы адгезии sICAM-1 выявила существенное его изменение при вирусиндуцированной БА. Полученные результаты позволяют говорить, что вирусиндуцированная БА у детей сопровождается выраженным увеличением сывороточного уровня молекулы адгезии ICAM-1, зависящим от степени тяжести заболевания, что указывает на разбалансированность иммунных реакций.
Ключевые слова: дети, респираторные вирусы, бранхиальная астма L.I. Allakhverdiyeva, U.M. Humbatova
IMMUNE DISTURBANCES IN CHILDREN WITH VIRUS-INDUCED BRONCHIAL ASTHMA
The content of main subpopulations of peripheral blood lymphocytes, level of interferon-gamma and also soluble molecules of adhesion sICAM-1 were identified in the blood serum of patients with virus-induced bronchial asthma. Concentration of interferon-gamma and sICAM-1 was determined by immunofermental method.
The results show a decrease of interferon-gamma content in the blood serum of patients. It demonstrates that development of T-cell response in virus-induced bronchial asthma occurs by accent the balance of Th-1 and Th-2 populations towards type 2 T-helpers. Evaluation of serum level of sICAM-1 molecule of adhesion demonstrated its significant change in virus-induced bronchial asthma.
The obtained results allow to reveal that virus-induced bronchial asthma in children is accompanied by significant increase of serum level of sICAM-1 molecule of adhesion depending on degree of severity of the disease, that points to disbalance of immune reactions.
Key words: children, respiratory viruses,bronchial astma
Одной из причин отсутствия контроля над симптомами бранхиальной астмы (БА) у детей, несмотря на проводимую базисную терапию, является рецидивирующая респираторная вирусная инфекция. Вирусные инфекции являются важным фактором возникновения дыхательной обструкции у больных БА. Это в первую очередь связано с колонизацией вирусами эпителия дыхательных путей, клетки которого продуцируют большое количество провоспалительных цитокинов и медиаторов, усиливающих воспалительный процесс [1-3]. Повторные вирусные инфекции у детей с атопией воздействуют на иммун-
ную систему, активируя ТБ2-клетки, угнетая ТЪ1-лимфоциты, а также подавляя супрессорную функцию Т-лимфоцитов, что приводит к снижению продукции у-интерферона и других противоинфекционных факторов [4].
У детей БА сопровождается изменениями иммунологической реактивности, которые связаны со степенью тяжести, периодом заболевания или наличием сопутствующего инфицирования и касаются множества мембранных белков-рецепторов, осуществляющих и регулирующих межклеточные взаимодействия, а также их растворимых форм. Растворимые формы мем-
- 217 -
