CC BY
75
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ АЛЛЕРГОЛОГИЯ
11. Soderquest K. et al. Cutting edge: CD8+ T cell primingin the absence of NK cells leads to enchanced memory responses. J. Immunol. 2011; 186: 3304-8.
12. Brooks D.G. et al. Interleukin-10 determines viral clearance or persistence in vivo. Nature Med. 2006; 12: 1301-9.
13. Lee S.H., Kim K.S., Fodil-Kornu N. et al. Activating receptors promote Nk cell expansion for maintenance, IL-10 production, and CD8 T cell regulation during viral infection. J. Exp. Med. 2009; 206; 2235-51.
14. ArtamonovaE.V., Korotkova O.V., Zabotina T.N. et al. Rossiiskiy bioterapevticheskiy zurnal. 2005; 4(1): 96-7 (in Russian).
15. Manziuk L.V., Artamonova E.V., Kadagidze Z.G. et al. Lekarst-venniye preparaty I oborudovanie. 2005; 11: 43 (in Russian).
16. Beck-Engeser G.B., Monach P.A., MumbergD. et al. Point mutations in essential genes with loss or mutation of the second allele: relevance to the retention of tumor-specific antiges. J.Exp. Med. 2001; 194: 285-300.
17. Monach P.A., Meredith S.C., Siegel C.T. et al. A unique tumor antigen produced by a single amino acid substitution. Immunity. 1995; 2: 45-59.
18. PardollD.M., Topalian S.L. The role of CD4+ T cell responses in antitumor immunity. Curr. Opin. Immunol. 1998; 10: 588-94.
19. Beatty G.L., Paterson Y. IFN-gamma can promote tumor evasion of the immune system in vivo by down-regulating cellular levels of an endogenous tumor antigen. J. Immunol. 2000; 165: 5502-8.
20. Fujiwara H., Fukuzawa M., Yoshioka T. et al. The role of tumor-specific Lyt-1+2- T cells in eradicating tumor cells in vivo. 1. Lyt-1+2- T cells do not necessarily require recruitment of host’s cytotoxic T cell precursors for implementation of in vivo immunity. J. Immunol. 1984; 133: 1671-6.
21. Greenberg P.D., CheeverM.A., Fefer A. et al. Eradication of disseminated murine leukemia by chemoimmunotherapy with cyclophosphamide and adoptively transferred immune syngeneic Lyt-1+2- lymphocytes. J. Exp. Med. 1981; 154: 952-63.
22. Mumberg D., Monach P.A., Wanderling S. et al. CD4+ T cells eliminate MHC class II-negative cancer cells in vivo by indirect effects if IFN-gamma. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1999; 96; 8633-8.
Поступила 24.10.12
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ АЛЛЕРГОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 615.218.3.03:616-056.43].012
Ю. В. Кузьменко1, В. В. Тютяева1, И. В. Андреев2, М. Н. Санков2, Е. С. Стародубова1,
О. В. Преображенская1, А. И. Мартынов2, В. Л. Карпов1.
ВЫДЕЛЕНИЕ и иммунологические СВОЙСТВА АЛЛЕРГЕНА BETV2 ПЫЛЬЦЫ березы повислой с иммунорегуляторными сигналами
1ФГБУН Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. 119991, Москва, 2ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА, 115478, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, корп. 2)
Для изменения соотношения IgE/Ig- ответа аллерген BetV2 (профилин) пыльцы березы повислой модифицировали иммунорегуляторными пептидами. Для усиления Th1ответа использовали сигнал деградации на протеасоме орнитиндекарбоксилазы, а для Т1п2-ответа - сигнал направления в лизосомы инвариантной цепи человека. Разработали систему по наработке препаратов рекомбинантного аллергена BetV2, пригодного для иммунологических тестов. Полученные высокоочищенные препараты химерных белков эффективно связывали IgE-антитела сывороток больных аллергией на пыльцу березы.
Ключевые слова: береза повислая, BetV2 профилин, иммунорегуляторные сигналы
Yu. V. Kuz’menko1, V.V.Tyutyaeva1,1. V. Andreev2, M. N. Sankov2, E. S. Starodubova1, O. V. Preobrazhenskaya,
A. I. Martynov2, V. L. Karpov1
1Of V.A. Engelhardt Institute of molecular biology RAS, 119991, Moscow, 2 " Institute of immunology of Federal medical-biological Agency, 115478, Moscow
SELECTION AND IMMUNOLOGICAL PROPERTIES OF ALLERGEN BETV2 DROOPIND BIRCH POLLEN WITH IMMUNOREGULATORY SIGNALS
To change the ratio of IgE/IgG response allergen Bet V2 (prophilin) drooping birch pollen modified immunoregulatory peptides. To strengthen the Th1 response was used signal degradation proteasome ornithindecarboxilase and Th2 response - signal direction in lisosoma invariant chains man. Developed a system running preparations of recombinant allergen Bet V2 suitable for immunological tests. Received highly purified preparations of chimeric proteins effectively bound IgE antibodies serum of patients allergic to birch pollen.
Keywords: birch, BetV2 profilin, immunoregulatory signals
Кузьменко Юлия Викторовна - мл. науч. сотр. ФГБУН Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, тел. 8 (499) 135-98-01, e-mail: [email protected]
- 211 -
ИММУНОЛОГИЯ № 4, 2013
Введение. Одним из методов лечения аллергических заболеваний является аллергенспецифическая иммунотерапия. При этом в качестве лечебного средства применяют индивидуальные белки-аллергены, полученные генно-инженерным путем [1]. Технология создания рекомбинантных аллергенов наиболее перспективна за счет дешевизны и простоты производства таких препаратов. Кроме того, в настоящее время разрабатываются различные подходы по модификации природных антигенов с целью получения на них иммунного ответа заданной специфичности. Одним из возможных подходов модификации аллергена является изменение природного пути его процессинга и презентации [2]. Введение в организм модифицированного белка в качестве лекарственного препарата может позволить изменить соотношение IgE- и IgG-ответа для данного аллергена в пользу снижения его аллергенности. Такое изменение природного пути процессинга и презентации аллергена в клетке может быть достигнуто за счет создания химерных рекомбинантных белков, в которых к белкам-аллергенам добавлены специализированные сигнальные последовательности, обеспечивающие направление на различные пути их процессинга и взаимодействия с молекулами главного комплекса гистосовместимости [3].
Белок BetV2 (профилин) содержится в пыльце березы -одном из значимых аллергенов для больных весенним пол-линозом в Центральной и Северной Европе. Профилин хотя и является минорным аллергеном пыльцы, но ответствен за перекрестное реагирование аллергенов пыльцы весенних деревьев [4]. Поэтому вопрос применения данного аллергена в терапевтических целях весьма актуальнен. В данной работе предложен подход по снижению аллергенности данного аллергена за счет изменения его пути процессинга при добавлении иммунорегуляторных пептидов. Созданы рекомбинантные белки, содержащие профилин и сигнальные пептиды, обеспечивающие протеасомный или лизосомный пути деградации белков. Предполагается, что введение в организм модифицированных белков должно снизить IgE-ответ. Однако данное снижение может быть вызвано не только измененным процессингом аллергена, но и экранированием эпитопов за счет введенной модификации. Поэтому на начальном этапе необходимо проверить узнавание модифицированных аллергенов сыворотками больных аллергией in vitro. Для этого были получены препараты рекомбинантных химерных белков на основе профилина пыльцы березы, которые протестированы иммуноферментным методом.
Материалы и методы. Плазмиды. В качестве базового вектора использовали полученную ранее плазмиду pET-Betv2, кодирующую аллерген Betv2 (неопубликованные данные). В данный вектор клонировали два сигнальных пептида: С-концевой фрагмент орнитиндекарбоксилазы
(ODCsig) и N-концевой фрагмент инвариантной цепи человека (Ii). Последовательность ODCsig получали полимеразной цепной реакцией (ПЦР) c плазмиды pCIneoODC [5] с использованием смеси полимераз Taq и Pfu (Fermen-tas, ) (1:1) и праймеров TopXhoI\ODCsig (5’ - GTGGTTGC-CCTCGAGTCACGGCCAATG - 3’) и BotXhoI\ODCsig (5’ -CGATCATCGGTCTCGAGCACATTGATC - 3’). Аналогично получали фрагмент Ii на матрице pKCMVRT-Ii с праймерами Top-Nde-Ii (5’ - CATGTTCATATGGATGACCAGCG - 3’) и Bot-Nde-Ii (5’ - CAT CAT CATATGGCGGCTGCACT - 3’). Полученные ДНК-фрагменты ODCsig (162 п.н.) и Ii (93 п.н.) клонировали в вектор pET-BetV2 по сайтам XhoI и NdeI соответственно. Нуклеотидные последовательности клонированных фрагментов подтверждали секвенированием района встройки в ЦКП «Геном».
Экспрессия и выделение белков из бактериальных клеток. Рекомбинантные белки нарабатывали в E. mli штамма BL21(DE3). Бактериальные клетки трансформировали плазмидами, проверяли экспрессию белка в индивидуальном клоне, затем проводили препаративное выделение белка. Бактериальные клетки растили в среде LB с 50 мг/мл канамицина
при 37°С, индукцию проводили 0,5 мМ IPTG в течение 4 ч и затем клетки собирали центрифугированием. При отборе экспрессирующего клона осадок лизировали в буфере нанесения (50 мМ Трис-HCl рН 6,8, 2% sDs, 10% глицерин, 2% Р-меркаптоэтанол, 0,025% бромфеноловый синий), наличие рекомбинантного белка устанавливали с помощью иммуно-блоттинга. При препаративном выделении осадок замораживали или непосредственно переходили к выделению белка из телец включения.
Для выделения белка из телец включения осадок клеток суспендировали в буфере (50 мМ Трис-HCl pH 8, 0,2 М NaCl, 2% Triton Х-100, 1 мМ EDTA) из расчета 25 мл на 1л исходной культуры. Клетки разрушали обработкой на ультразвуковом приборе УЗД2-0.063/22. Клеточный дебрис осаждали центрифугированием 15 000-g 30 мин. Осадок суспендировали в лизирующем буфере (5 мМ Трис-HCl pH 8, 0,5 М NaCl, 8 М мочевина). Лизат осветляли центрифугированием и добавляли к Ni-NTA-агарозе (Qiagen, ), предварительно обработанной лизирующим буфером в течение 3 ч при 4°C. Затем полученную суспензию переносили в колонку и последовательно промывали буферами (50 мМ Трис-HCl pH 8, 0,5 М NaCl, 8 М мочевина) с 10 и 25 мМ имидазола. Целевой белок элюировали буфером (50 мМ Трис-HCl pH 7, 0,25 М NaCl, 6 М мочевины, 0,25 М имидазола, 0,02 М ЭДТА). Все фракции с колонки анализировали в 16% ПААГ в денатурирующих условиях.
Фракции, содержащие целевой белок, объединяли и диа-лизовали в буфере (50 мМ Трис-HCl pH 8, 0,2 М NaCl, 2 М мочевина). Полученный раствор белка концентрировали до 1 мл центрифугированием при 5000 об/мин, используя концентраторы Vivaspin 2 (Sartorius stedim). Фракции после колонки и готовые белковые препараты хранили на 4°С не более 24 ч. Для длительного хранения в раствор добавляли глицерин до 20% и хранили при -20°С.
Гель-электрофорез белков и иммуноблоттинг. Для разделения белков электрофорезом в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях образцы кипятили 3 мин в буфере нанесения (50 мМ Трис-HCl рН 6,8, 2% SDS, 10% глицерин, 2% Р-меркаптоэтанол, 0,025% бромфеноловый синий) и наносили на гель. Электрофорез проводили в буфере (25 мМ Трис-HCl, 250 мМ глицин, 0,1% SDS) в 5% концентрирующем геле (130 мМ Трис-HCl рН 6,8, 0,1% SDS) и 16% разделяющем геле (375 мМ Трис-HCl рН 8.8, 0,1% SDS) при постоянной силе тока 20мА.
Белки, разделенные в геле, переносили на нитроцеллюлозную мембрану (BioRad) электропереносом в буфере (48 мМ Трис, 39 мМ глицин, 0,037% SDS, 10% этанол) при силе тока 1-1,5 мА на 1 см2 мембраны в течение 2 ч. Для блокирования неспецифического связывания мембраны инкубировали ночь при 4°С в блокирующем буфере (80 мМ Na2HPO4, 20 мМ NaH2PO4, 100 мМ NaCl, 0,1% Tween-20, 5% обезжиренное молоко). Связывание антител проводили в блокирующем буфере в течение часа при комнатной температуре и покачивании. Для выявления белков использовали моноклональные антитела (АТ) на 6»His tag (Abcam) в разведении 1:1000 и вторичные АТ к IgG мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена (Jackson), в разведении 1:5000. Иммунные комплексы на мембране выявляли с помощью флюоресцентной системы детекции ECL plus™ (GE Healthcare) и сигналы регистрировали на рентгеновскую пленку (FujiFilm). Пленку сканировали и изображения обрабатывали в программе ImageJ (http://rsb. info.nih.gov/ij).
Иммунобиологические исследования специфичности рекомбинантных белков. Оценку иммунологической специфичности рекомбинантных белков проводили методом ELISA c использованием сывороток крови пациентов, страдающих аллергией на пыльцу березы [6]. Лунки иммунологических планшетов обрабатывали раствором рекомбинантного белка в концентрации 10 мкг/мл в бикарбонатно-карбонатном буфере рН 9,6-9,8 в течение 16-18 ч при 4°С. После 3-кратной
- 212 -
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ АЛЛЕРГОЛОГИЯ
н
His6
ODCsig His6
BetV2
BetV2
BetV2
BetV2-ODCsig
Рис. 1. Анализ экспрессии рекомбинантных белков в бактериальных клетках.
Схематическое изображение рекомбинантных белков на основе Bet V2 (а). Лизаты бактерий с плазмидами, кодирующими белки: Bet v2 (дорожки 1, 2), Betv2-ODcsig (дорожки 3, 4), Ii-Betv2 (дорожки 5, 6), которые обработанны и не обработанны IPTG, разделяли в 16% ПААГ Белки выявляли окрашиванием раствором Кумасси (б) и иммуноблоттингом с антителами к 6xHis tag (в). Справа указаны положения белковых маркеров молекулярных масс (в кДа).
промывки в лунку вносили 50 мкл образца сыворотки и 50 мкл буфера PBS с 0,01% Tween-20. После инкубации в течение 40 мин при комнатной температуре и 3-кратной отмывки вносили 100 мкл моноклональных АТ к IgE человека, конъюгированных с пероксидазой хрена (4H10, ООО «Сорбент», ) в разведении 1:10 000. После инкубации в течение 40 мин при комнатной температуре и 3-кратной отмывки проводили реакцию с тетраметилбензидином (ТМБ) и измеряли оптическую плотность (ОП) при длине волны 450 нм. В качестве контроля неспецифического связывания использовали значение ОП в лунках без сыворотки, которое вычитали из опытных образцов.
Результаты и обсуждение. Рекомбинантный белок-аллерген может быть изменен методами генной инженерии, обеспечивая возможность создания антигена с
— ■
Е
li-BetV2 BSA
0,25 0,5 5 2,5 1,25 0,625
“ —
= 95 -72
— 55
— 43
— 34
— 26
— 17
■ 10
мг/мл
= 95
— 72
— 55
— 43
— 34
— 26
— 17
— 10
Рис. 2. Определение качества препарата белков BetV2-ODCsig и Ii-BetV2.
Препараты белков BetV2-ODCsig (а) и Ii-BetV2 (б) разделены в 16% ПААГ и окрашены раствором Кумасси бриллиантовый синий. В качестве стандарта нанесен белок BSA (бычий сывороточный альбумин) в известной концентрации. Справа указаны положения белковых маркеров молекулярных масс (в кДа).
новыми заданными свойствами и потенциалами. Так, существуют подходы, включающие точечные замены, удаление фрагментов, а также включение дополнительных последовательностей. В качестве вносимых фрагментов используют различные последовательности, которые несут сигналы направления в различные компартменты клеток или к определенным клеточным рецепторам [3]. Это приводит к изменению пути процессинга антигенов. В данной работе для изменения иммунного распознавания антигена использовали сигналы направления на протеасому для усиления МНС I-презентации и в лизосому для усиления МНС II-презентации [7, 8]. Антиген березы BetV2 (профилин) модифицировали специализированными сигналами. Для усиления протеасомного процессинга и презентации в МНС I использовали сигнал деградации на протеасоме ор-нитиндекарбоксилазы (ODCsig) [9, 10]. Для повышения эффективности презентации в МНС II и усиления хэлперного ответа - сигнал направления в лизосомы инвариантной цепи человека [11, 12].
В работе созданы две генно-инженерные конструкции на основе аллергена BetV2 (рис. 1, а). Первая кодировала BetV2, несущий на С-конце 55 концевых аминокислот ODC-sig мыши. Вторая конструкция кодировала BetV2, который содержал на N-конце первые 10 аминокислот инвариантной цепи человека. Обе конструкции также имели довесок из шести гистидинов на С-конце белка, который необходим для очистки на Ni-агарозе и детектирования рекомбинантных белков АТ.
- 213 -
ИММУНОЛОГИЯ № 4, 2013
Результаты испытаний сывороток на иммунологическую активность к рекомбинантному белку BetY2
Образец сыворотки BetV2 BetV2-ODC Ii-BetV2
1-й 0,110 0,100 0,101
2-й 0,389 0,391 0,404
3-й 0,401 0,351 0,339
4-й 0,081 0,075 0,078
5-й 0,213 0,226 0,237
6-й 0,227 0,269 0,248
7-й 0,228 0,198 0,220
8-й 0,101 0,109 0,121
9-й 0,118 0,123 0,131
10-й 0,081 0,084 0,085
Бактерии штамма BL21(DE3) трансформировали полученными плазмидами. Экспрессию рекомбинантных белков-аллергенов BetV2, BetV2-ODCsig, Ii-BetV2 детектировали с помощью окрашивания Кумасси и иммуно-блоттингом (рис. 1, б, в). Обнаружили, что уровень накопления Betv2-ODcsig значительно выше, чем у остальных вариантов.
Затем применили методику выделения химерных белков в препаративных количествах. Для этого использовали одностадийную очистку на Ni-агарозе из телец включения, ранее разработанную для выделения рекомбинантного белка Betv2. Выделили белки Betv2-ODcsig и Ii-Betv2 (рис. 2), которые в дальнейшем использовали для изучения иммунологической специфичности. Из 3 л бактериальной культуры получили по 1 мл препаратов концентрацией Betv2-ODcsig 8 мг/мл и Ii-Betv2 2 мг/мл. Более высокий выход белка Betv2-ODcsig, по-видимому, связан с более высоким уровнем накопления белка в клетках, что обнаружили с помощью иммуноблот-тинга (см. рис. 1.)
Для оценки иммунологической специфичности полученных нами химерных рекомбинантных белков Betv2-ODcsig и Ii-Betv2 использовали сыворотки крови пациентов, страдающих аллергией на пыльцу березы (см. таблицу). IgE-связывающие свойства сравнивали с немодифицированным рекомбинантным белком Betv2.
Ранее показано, что IgE-связывающие свойства аллергенов напрямую зависят от метода выделения рекомбинантного белка [13]. Препараты белков, полученных в данной работе в соответствии с используемой методикой, способны к связыванию IgE-АТ из сыворотки больных. Поэтому методика, предложенная нами для выделения белка Betv2, также применима и для выделения химерных рекомбинантных белков на основе Betv2. В среднем разница в узнавании химерных белков и немодифицированного профилина составила 2%, что следует отнести к погрешности метода. Следовательно, рекомбинантные химерные белки, модифицированные сигнальными пептидами, узнаются IgE-АТ, присутствующими в крови больных-аллергиков, также хорошо, как и рекомбинантный немодифицированный белок Betv2.
Таким образом, в данной работе были созданы и выделены новые химерные аллергены на основе белка Betv2 пыльцы березы повислой. Модификация аллергенов сигналами ODcsig и Ii не привела к потере их узнавания IgE из сывороток больных аллергией. Поэтому полученные химерные антигены могут быть использованы для дальнейших исследований их иммунологических свойств в клеточной системе
и на лабораторных животных.
Работа проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (государственный контракт № 16.512.11.2068 от 16 февраля 2011 г.).
ЛИТЕРАТУРА
3. Стародубова Е. С., Исагулянц М. Г., Карпов В. Л. Регуляция процессинга иммуногена: сигнальные последовательности и их использование для создания нового поколения ДНК-вакцин. Acta Naturae. 2010; 2(1): 59-65.
5. Стародубова Е. С., Исагулянц М. Г., Карпов В. Л. Искусственное увеличение скорости утилизации обратной транскриптазы ВИЧ-1 по протеасомному пути. Молекулярная биология. 2006. 40(6): 983-9.
6. Бызова Н. А., Сотников Д. В., Жердев А. В., и др. Иммунохроматографический анализ уровня специфического сывороточного IgE человека для диагностики аллергии на пыльцу тимофеевки луговой. Иммунология. 2010; 1: 47-51.
REFERERNCES
1. Gafvelin G., Parmley S., Neimert-Andersson T., Blank U., Eriksson T. L., van Hage M., et al. Hypoallergens for allergen-specific immunotherapy by directed molecular evolution of mite group 2 allergens. J. biol. chem. 2007; 9: 3778-87.
2. Leifert J. A., Rodriguez-Carreno M. P., Rodriguez F., et al. Targeting plasmid-encoded proteins to the antigen presentation pathways. Immunol. Rev. 2004; 199: 40-53.
3. StarodubovaE. S., IsagulyantsM. G., Karpov VL. Acta Naturae. 2010; 2(1): 59-65 (in Russian).
4. Sirvent S., Tordesillas L., Villalba M., D^az-Perales A., Cuesta-Herranz J., Salcedo G., Rodriguez R.. Pollen and plant food profilin allergens show equivalent IgE reactivity. Ann. Allergy Asthma Immunol. 2011; 106: 429-35.
5. Starodubova E. S., IsagulyantsM. G., Karpov V L. Molekulyar-naya biologiya. 2006. 40(6): 983-9 (in Russian).
6. Byzova N. A., Sotnikov D. V., Zherdev A. V et al. Immunologiya. 2010; 1: 47-51 (in Russian).
7. Braciale T. J., Morrison L. A., Sweetser M. T., Sambrook J., Gething M. J., Braciale V L. Antigen presentation pathways to class I and class II MHC-restricted T lymphocytes. Immunol. Rev. 1987; 98: 95-114.
8. Ciechanover A. Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting. Nature Rev. Mol. Cell. Biol. 2005; 6: 79-87.
9. Murakami Y., MatsufujiS., Kameji T., HayashiS., IgarashiK., Tamura T., Tanaka K., IchiharaA. Ornithine decarboxylase is degraded by the 26S proteasome without ubiquitination. Nature. 1992; 360: 597-9.
10. Zhang M., Pickart C. M., Coffino P. Determinants of proteasome recognition of ornithine decarboxylase, a ubiquitin-independent substrate. EMBO J. 2003; 22: 1489-96.
11. Bakke O., Dobberstein B. MHC class II-associated invariant chain contains a sorting signal for endosomal compartments. Cell. 1990; 63: 707-16.
12. Odorizzi C. G., Trowbridge I. S., Xue L., Hopkins C. R., Davis C. D., Collawn J. F. Sorting signals in the MHC class II invariant chain cytoplasmic tail and transmembrane region determine trafficking to an endocytic processing compartment. J. Cell Biol. 1994; 126: 317-30.
13. Wallner M., Himly M., Neubauer A., Erler A., Hauser M., Asam C., et al. The influence of recombinant production on the immunologic behavior of birch pollen isoallergens. PloS one. 2009; 4: 8457.
Поступила 18.10.12
- 214 -
