Выявление и анализ различного усеченного фрагмента аллергического белка TBb в гречихе татарской Текст научной статьи по специальности «Агробиотехнологии»

УДК 633.12:631.12

П. Ли

Ведущая лаборатория Химической Биологии и Молекулярных Разработок Министерства Образования,

Институт Биотехнологии, Университет Шаньси Р. Лин

Академия Сельскохозяйственных Наук, Шаньси. Тайюань 030006, КНР

3. Ван

Ведущая лаборатория Химической Биологии и Молекулярных Разработок Министерства Образования,

Институт Биотехнологии, Университет Шаньси

ВЫЯВЛЕНИЕ И АНАЛИЗ РАЗЛИЧНОГО УСЕЧЕННОГО ФРАГМЕНТА АЛЛЕРГИЧЕСКОГО БЕЛКА ТВЬ В ГРЕЧИХЕ ТАТАРСКОЙ

Аллергенные белки TBb (35kD) с сильной связывающей активностью иммуноглобулина Е (IgE) были выявлены в гречихе татарской. Цель этого исследования состояла в том, чтобы определить самую важную область TBb. Согласно предыдущему исследованию прогнозирования антигенной детерминанты, аллергический белок TBb был разделен на четыре фрагмента и назван F1, F2, F3, F4, соответственно. Ген фрагментов был амплифицирован методом ПЦР (полимеразная цепная реакция) с использованием праймеров, разработанных согласно TBb кДНК. Четыре экспрессионнъп вектора, содержащие ген фрагментов, были построены и затем преобразованы в Escherichia coli BL21 (DE3) в клетке хозяина. Экспрессионные продукты быти очищены Ni2 +-NTA при помощи колонки для аффинной хроматографии с использованием агарозы и проанализированы косвенным энзимсвязанныт иммуносорбентныт анализом (ELISA) с использованием сывороток от аллергенных пациентов. Очищенные белки быти получены, и иммунологические результаты показали, что F1 и F2 демонстрируют более сильное соединение иммуноглобулина Е с сывороткой пациента, чем другие фрагменты. Результат означает, что F1 и F2, вероятно, содержат важные антигенные детерминанты в гречихе татарской.

Ключевые слова: аллерген гречихи татарской, экспрессия, энзимсвязанный иммуносорбентный анализ (ELISA),

иммунологическая деятельность.

Введение

Гиперчувствительность к гречихе (Fagopyrum esculentum) является частой причиной аллергии в Японии, Корее и других азиатских странах, вызывая реакции анафилактического типа у чувствительных людей, особенно у детей (Takahashi Y, и др., 1998). Сегодня во многих европейских странах и США аллергия на гречиху становится фактором, вызывающим беспокойство здравоохранения из-за развивающейся тенденции употребления гречихи в качестве ,доровой пищи и увеличивающегося исполь,ования гречневой муки в печеньях или вместо пшеничной муки людьми, имеющими аллергию на клейковину и страдающими целиакией (Schumacher

F., Шмидт П., Wuthrich B., 1993). В дополнение, сообщается о случаях астмы на ингаляции к гречихе или ночной астмы от сна на подушках, наполненных гречишной мякиной (обычно исполь,уемых в Корее), особенно у детей (Fritz SB., и др., 2001).

Гречиха принадлежит семейству Polygonaceae и включает две культурных ра,новидности: гречиха обыкновенная посевная (CB, Fagopyrum esculentum) и гречиха татарская (TB, Fagopyrum tataricum) (Yoshioka, H.; Yasueda, N.; Adachi, T., 2004). Об аллергенных реакциях на CB сообщается во многих ра,личных областях, а число исследований,

Allergenic proteins TBb (35kD) with a strong IgE-binding activity have been identified in tartary buckwheat. The objective of this research was to determine the most important region of TBb. According to previous study on epitope prediction, allergic protein TBb was divided into four fragments and named F1, F2, F3, F4 respectively. The gene of fragments was amplified by PCR using the primers designed according to TBb cDNA. Four expression vectors containing the gene of fragments were constructed, and then transformed into the Escherichia coli BL21(DE3) host cell. The expression products were purified by Ni2+-NTA agarose affinity chromatography column, and analysed by indirect ELISA using sera from allergenic patients. The purified proteins were obtained and the immunological results showed that F1 and F2 exhibit stronger IgE binding to patient's serum than the other fragments. The fact suggests that F1 and F2 probably contain the important epitopes in tartary buckwheat.

Key words: tartary buckwheat allergen, expression, ELISA, immunological activity.

касающихся TB, увеличилось за последние годы (Zhang X., и др., 2008).

В данном исследовании аллергический белок TBb был разделен на четыре фрагмента при использовании сегментального экспрессионного метода и назван F1, F2, F3, F4, соответственно. Четыре экспрессионных вектора, содержащие ген фрагментов антигенных детерминант, были построены, и ,атем преобра,ованы в Escherichia coli BL21 (DE3) в клетке хозяина. Экспрессионные продукты были очищены и затем проанали,ированы косвенным эн,имсвя,анным иммуносорбентным анали,ом (ELISA) с исполь,ованием сывороток от аллергенных пациентов.

Материал ы и методы Материалы

ДНК-полимераза Taq для цепной реакции полимеразы (PCR) была получена из TaKaRa (Далянь, Китай). Эндонуклеа,ы ограничения и другие ферменты для молекулярного клона были доставлены из Sangon (Шанхай, Китай). Экспрессионный вектор pET-32m и штамм хозяина BL21 (DE3) были сохранены нашей лабораторией. Конъюгированные с пероксида,ой хрена (HRP) антитела

антиммуноглобулина Е мыши были доставлены из Southern Biotech.

Сыворотки от пациентов и контроль здоровья

Из Центра Крови Тайюаня, Китая были получены сыворотки трех пациентов с историей дыхательных, дерматологических, или желудочнокишечных

симптомов, происходящих в течение 1 часа после приема внутрь гречихи. Здоровые сыворотки от добровольцев, неаллергических на гречневую крупу, использовались как отрицательный контроль.

Клонирование различныгхусеченныгх фрагментов в TBb

Согласно предыдущему исследованию

предположения антигенной детерминанты,

аллергический белок ТВЬ был разделен на четыре фрагмента и назван Б1, Б2, БЭ, Б4, соответственно. Ген различных усеченных фрагментов был усилен

цепной реакцией полимеразы PCR от плазмиды pET-32m-TBb с использованием праймеров, перечисленных в таблице 1, и все программы цепной реакции полимеразы были представлены 30 циклами 94 °С 1 минута, 60 °С 1 минута, 72 °С продукта PCR на 1 мин. Продукты цепной реакции полимеразы (PCR) были клонированы в pGEM-T короткого праймера для построения последовательности. После того, как они, оказались правильными, вектор был скомбинирован с

Bam HI and Hind III. Полученные фрагменты были взяты от экспрессионного вектора pET-32m, чтобы прои,вести четыре рекомбинантных пла,миды (pET-32m-F1, pET-32m-F2, pET-32m-F3 и pET-32m-F4).

Таблица 1 - Праймеры, разработанные для клонирования различных обрезанных фрагментов в ТВЬ

фрагменты праймеры последовательности(5’-3’)

F1 P1 5 ’ - ATGGATCCGCGCAGCTATGGCCATGG -3 ’

P2 5 ’ - AT AAGCTTTT ACAAGAGGCCTCCT GGCT G-3 ’

F2 P3 5 ’-ATGGATCCCTTCCTTCCTACTCCAACG-3 ’

P4 5 ’ - AT AAGCTTTT AGGCGGGAGAT GGGAT GAC-3 ’

F3 P5 5 ’ -ATGGATCCGGTGTCGTGCAGTGGACT-3 ’

P6 5 ’ - AT AAGCTTTT AT GCGCCGAT AAGT GCTTC-3 ’

F4 P7 5 ’ -ATGGATCCAACATCTTGAGTGGATTCCA-3 ’

P8 5 ’ - AT AAGCTTTT AATTGCTCCTTCCGCTTCCTC-3 ’

Прямые и обратные праймеры, содержащие BamH I и Hind III участки подчеркнуты

Экспрессия и очистка белков слияния

Построенные векторы, содержащие ген различных обрезанных фрагментов в TBb, были преобразованы в

E. coli штамм BL21 (DE3), и экспрессия белка слияния была вызвана добавлением изопропил-бета-тиогалактопиранозида (IPTG) при заключительной концентрации 1 мм в жидкой среде Лурия-Бертани. После 3-х часов непрерывного встряхивания при 37°C белки слияния были очищены в условиях денатурации, с использованием комплекта HisTrap (Amersham Pharmacia Biotech, Упсала Швеция) для идентификации. Рекомбинантный обрезанный фрагмент был проанали,ирован электрофоре,ом геля сульфатного многоакриламида додецила натрия (SDS-PAGE), с использованием 12.5 % геля

многоакриламида.

Энзимсвязанный иммуносорбентный анализ (ELISA)

ELISA был выполнен, чтобы обнаружить IgE-свя,анную активность к ра,личным обре,анным фрагментам F1, F2, F3 и F4. После наполнения 96-луночных плашек каждым белком (1,0 mg/50 ml 50миллиметрового буфера карбоната натрия, 9,6) и быстрого инкубирования при 4°C они были и,влечены солевым раствором, буфери,ованным фосфатом (PBS, pH 7.5), содержащим 0,05 % полисорбата 20 (PBST), после чего последовала блокировка 1%-ым бычьим сывороточным альбумином на 1 час при 37°C. Далее плашки были обработаны фосфатно-буферным солевым раствором, быстро инкубированы при 4°C с сывороточными образцами, разбавленными из 5% (1:20 разбавлений). После дальнейшей отмывки с PBST конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) антитела антиммуноглобулина Е мыши (Southern Biotech, Бирмингем, Алабама), разбавленные PBST, были добавлены в плашки и инкубированы в течение

1 часа при 37°C, после чего они вступили в реакцию с хромогеном и ортофенуленом диамином. OD-характеристик смеси были измерены в 490 нм планшет-ридером (Био радиус, Геркулес,

Калифорния).

Результаты

Клонирование, экспрессия и очистка различных обрезанных фрагментов в TBb

Используя сегментальный экспрессионный метод, векторы, содержащие ген различных обрезанных фрагментов в TBb, были успешно построены (рис. 1, рис. 2). Аллергические белковые фрагменты (F1, F2, F3, F4) TBb были выражены как 6х Гистеговые белки в соответствии с инструкциями изготовителя (Qiagen, Inc., Валенсия, Калифорния). После того, как рекомбинантные белки были очищены хроматографией с целью идентификации, ре,ультат анали,а методом электрофоре,а в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия пока,ал, что молекулярная масса хорошо совпала с теоретическим прогнозом, и чистота была> 95 % (рис. 3).

Соотношение иммуноглобулина Е (IgE) фрагментов антигенного детерминанта ( питопа) в TBb Чтобы определить реактивность IgE фрагментов и идентифицировать самую ,начительную область в TBb, эн,имсвя,анный иммуносорбентный анали, (ELISA) был выполнен с каждым рекомбинантным белком, с использованием трех IgE-положительных сывороток и отрицательного контроля. Как пока,ано на рисунке 4, сывороточные образцы от трех пациентов, имеющих аллергию на гречиху, были реактивными с этими рекомбинантными фрагментами, в то время как нормальный сывороточный обра,ец был отрицателен. F1 и F2 пока,али самую сильную реактивность IgE среди всех тестированных фрагментов.

б5

Рисунок 1 - Анализ электрофореза геля агарозы продуктов цепной реакции полимеразы Ген различных обрезанных фрагментов был РСЯ усиленным от плазмиды рБТ-Э2ш-ТВЬ.

Г., Маркер 2000 БЬ; дорожка 1, Б1; дорожка 2, Б2; дорожка Э, БЭ; дорожка 4, Б4

kDa Mr 1

94.Q ___

67.Q

4ЗЛ

3Q.Q _

2Q.l

14.4

2

З 4

Рисунок 2 - Анализ электрофореза геля агарозы рекомбинантной идентификации плазмиды.

Рекомбинантная плазмида была идентифицирована двойными средами (BamH I and Hind III) и цепной реакцией полимеразы (PCR). Mr, DL Маркер 2000; дорожка 1, 2, pET-32m-F1 идентификаци ; дорожка 3, 4, pET-32m-F2 идентификация; переулок 5, 6, pET-32m-F3 идентификация; переулок 7, 8, pET-32m-F4 идентификация

Рисунок 3 - Анализ методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия фрагментов в TBb. Экспрессионные продукты были очищены Ni2 +-NTA при помощи колонки для аффинной хроматографии с использованием агарозы и они были изучены на 12.5 % геле, окрашенным кумасси бриллиантовым голубым. Mr., стандартный маркер белков (Pharmacia Bitotech, Упсала Швеция); дорожка 1, F1; дорожка 2, F2; дорожка 3, F3; дорожка 4, F4

0.25

0.2

S 0.15

I

£ 0.1 3

0.05

0

TBb

■ Patient1 б Patient2

□ Patient3

□ Normal serum

F1 F2 F3

Fragments in TBb

F4

Рисунок 4 - Соотношение белков к IgE в сыворотке от пациентов, имеющих аллергию на гречиху, и здоровый контроль, измеренный энзимсвязанным иммуносорбентным анализом (ELISA). Были обнаружены статистически значительные различия между пациентами и здоровым контролем и между четырьмя фрагментами в их

реактивности иммуноглобулина Е (IgE)

бб

Дискуссия

Анали, антигенной детерминанты (эпитопа) аллергена является основополагающим методом, отражающим причину, почему ра,личные аллергены вы,ывают сверхчувствительные реакции. Как правило, антигенная детерминанта (эпитоп) состоит

и, нескольких аминокислот или областей, которые могут быть расположены на ра,личных подгруппах, формируя линейную или конформационную структуру.

Наше предыдущее исследование

идентифицировало белок под на,ванием аллерген TB в гречихе татарской и также выяснилось, что у него есть две области, у которых была та же самая структура распада, как и у других белков хранения семени. Выведенные N- и C-концевые области были названы TBb (34 kDa) и TBa (24 kDa), соответственно (Zhang X., и др., 2008). В данном исследовании, чтобы определить самую важную область TBb, мы расщепили его на четыре фрагмента и назвали F1, F2, F3, F4, соответственно, применяя сегментальный экспрессионный метод. Однако наши результаты эн,имсвя,анного иммуносорбентного анали,а (ELISA) пока,али, что у фрагментов F1 и F2 присутствует более сильная свя,ывающая реактивность иммуноглобулина Е (IgE), чем у других фрагментов. Полученные данные предполагают, что F1 и F2 вероятно содержали важные антигенные детерминанты (эпитопы) в TBb.

Тем не менее, необходимо большее количество при,наков, чтобы дока,ать это ,аключение определенно. Будут применяться ра,личные методы, такие как торможение эн,имсвя,анного иммуносорбентного анали,а (ELISA), дот-блот анализ, вестерн-блоттинг и т.д. Этот анализ фрагментов аллергенного белка TBb гречихи татарской должен помочь терапевтическим усилиям и содействию в ра,витии гипоаллергенной гречихи.

Финансирование и поддержка

Работа была выполнена при поддержке Фонда Естественных наук Китая (30671084 и 30970611) и Фонда Естественных наук Области Шаньси (2007011077).

Литература

1. Takahashi Y, Ichikawa S, Aihara Y, Yokota S, 1998. Buckwheat allergy in 90,000 school children in Yokohama. Aerugi.47:16-33.

2. Schumacher F, Schmidt P, Wuthrich B,1993. Sarrazin allergy: a contribution to buckwheat allergy. Schweiz Med Wochenschr.123:1559-62.

3. Fritz SB, Gold BL, 2003. Buckwheat pillow-induced asthma and allergic rhinitis. Ann Allergy Asthma Immunol.90:355-8.

4. Lee SY, Lee KS, Hong CH, Lee KY, 2001. Three cases of childhood nocturnal asthma due to buckwheat allergy. Allergy.56:763-6.

5. Yoshioka, H., Yasueda, N., Adachi, T., 2004. Molecular cloning and expression of a major allergenic protein Fag e 2 from buckwheat. Fagopyrum.21: 35-38.

6. Xin Zhang, Jing Ming Yuan, Xiao Dong Cui, and Zhuan Hua Wang, 2008. Molecular Cloning, Recombinant Expression, and Immunological Characterization of a Novel Allergen from Tartary Buckwheat. J. Agric. Food Chem. 56:10947-10953.

7. Wang, Z. H., Zhang, Z., Zhao, Z. H., Wieslander,

G., Norba "ck, D., Kreft, I,2004. Purification and characterization of a 24 kDa protein from tartary buckwheat seeds. Biosci.Biotechnol. Biochem.68: 14091413.

8. Wang, Z. H.,Wang, L.,Chang, W. J.,Li, Y. Y., Zhang, Z.;Wieslander, G., Norba "ck, D,2006. Cloning, expression, and identification of immunological activity of an allergenic protein in tartary buckwheat. Biosci. Biotechnol. Biochem. 70: 1195-1199.

Перевод статьи на русский язык:

Е.В. Долгова, ст. преподаватель (ФГОУ ВПО Орёл ГАУ)

УДК 633.12: 581.19

Т.Н. Лазарева, кандидат биологических наук И.Н. Фесенко, кандидат биологических наук ГНУ ВНИИ зернобобовых и крупяных культур

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ СПЕКТРОВ БЕЛКОВ СЕМЯН

FAGOPYRUM CYMOSUM MEISN. И F. TATARICUM GAERTN.

Сделан сравнительный анализ спектров белков семян близкородственных видов F.cymosum и F.tataricum. Вы1явлена высокая консервативность индивидуальных элементов спектра как на внутри, так и на межвидовом уровнях. Обсуждается один из вероятныгх механизмов дивергенции этих видов.

Ключевые слова: SDS-PAGE, F.cymosum, F.tataricum,

запасныге белки семян.

¥. tataricum и ¥. cymosum, несмотря на ряд кардинальных различий (соответственно

самоопылитель - перекрестник, однолетник -многолетник), филогенетически достаточно близкие виды, между которыми возможна успешная гибридизация без использования культуры незрелых

The comparative analysis of seed protein spectra of closely related species F.cymosum and F.tataricum was conducted. High conservatism of individual elements of a spectrum on both intra- and interspecific levels is revealed. One of probable mechanisms of these species evolutionary divergence is discussed.

Key words: SDS-PAGE, F.cymosum, F.tataricum, seed storage protein.

зародышей. Результатом скрещивания F. tataricum с

F. cymosum на тетраплоидном уровне стало получение искусственного вида F. giganteum Krotov [1]. Фертильные гибриды на диплоидном уровне, а также гибриды F. giganteum с обоими родительскими видами также были получены бе, исполь,ования

Вестник Орел Г Ay

август

№4(25)

2010

Теоретический и научно-практический журнал. Основан в 2005 году

Учредитель и издатель: Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Орловский государственный аграрный Университет»_____________________________________________

Редакционный совет: Парахин Н.В. (председатель) Амелин А.В. (зам. председателя) Астахов С.М.

Белкин Б.Л.

Блажнов А.А.

Брыкля О.А.

Буяров В.С.

Гуляева Т.И.

Гурин А.Г.

Гущина Т.В.

Дегтярев М.Г.

Зотиков В.И.

Иващук О.А.

Козлов А.С.

Кузнецов Ю.А.

Лобков В.Т.

Лысенко Н.Н.

Ляшук Р.Н.

Мамаев А.В.

Ма(алов В.Н.

Новикова Н.Е.

Павловская Н.Е.

Попова О.В.

Прока Н.И.

Савкин В.И.

Степанова Л.П.

Хромов В.Н.

Шендаков А.И. (ответств. секретарь) Ермакова Н.Л. (редактор)

Адрес редакции: 302019, г. Орел, ул. Генерала Родина, 69. Телефон: (4862)454037 Факс:(4862)454064 E-mail: nichо[email protected] E-mail: [email protected]

Свидетельство о регистрации ПИ =ФС77-21514 от 11.07. 2005 г.

Технический редактор Мосина А.И. Сдано в набор 21.07.2010 Подписано в печать 28.07.2010 Формат 60x84/8. Бумага офсетная. Гарнитура Таймс.

Объём 11 усл. печ. л.

Тираж 300 эк,. Издательство Орел ГАУ, 302028, г. Орел, бульвар Победы, 19. Лицензия ЛР№021325 от 23.02.1999 г.

Журнал рекомендован ВАК Минобрнауки России для публикаций научных работ, отражающих основное научное содержание кандидатских и докторских диссертаций

Содержание номера

Актуальные вопросы выращивания и переработки гречихи

Романенко Г.А. 30 лет Международной ассоциации исследователей гречихи

(IBRA) - вехи и тенденции...................................................... 2

Парахин Н.В. Гречиха: биологические возможности и пути их реализации........... 4

Инг Ванг, Дзя Чен, Ибаили Фенг. Состояние процесса производства и разработка

стратегий в отношении продуктов из гречихи в Китае........................... 9

Крефт Иван, Икеда Кийоказу, Икеда Саеко, Вомбергар Бланка. Разработка функционально новых продуктов питания на основе гречихи обыкновенной и

татарской.......................... ........................................... 15

Зотиков В.И., Наумкина Т.С., Сидоренко В.С. Современное состояние и

перспективы развития производства гречихи в России............................. 18

Брунори А., Бавиелло Г., Колонна М., Рисси М., Иззи Г., Тотх М., Вегвари Г. Современное понимание перспектив во,делывания и исполь,ования гречихи в

Центральной и Южной Италии..................................................... 23

Пак Чеол Хо, Хонг Сун Кван, Лим Ионг Суп, Ли Мун Хеон, Британия Ксоксион. Применимость различных сортов гречихи в провинции Луангпрабанг

республики Лаос................................................................ 30

Новиков В.М., Глазова З.И. Оптимизация технологических адаптеров

возделывания гречихи........................................................... 34

Басов Ю.В., Басов А.Ю. Особенности аккумуляции тяжёлых металлов гречихой в

условиях техногенеза........................................................... 39

Степанова Л.П., Хрипкова Н.А., Степанова Е.И., Шамараева В.С.

Закономерности синергического взаимодействия ионизирующего излучения, гумата калия и цеолита на растениях гречихи..........................................43

Актуальные вопросы селекции гречихи

Фесенко Н.В., Фесенко А.Н., Романова О.И. Морфологическая структура популяций как основной элемент функциональной системы экологической

адаптации гречихи обыкновенной Fagopyrum esculentum moench.....................47

Ониши Оми. Детализированная картина географического распространения дикорастущих прототипов гречихи обыкновенной, Fagopurum esculentum ssp.

ancestral...................................................................... 53

Мартыненко Г.Е., Фесенко Н.В., Фесенко А.Н., Шипулин О.А. Биологические

принципы и методы селекции мутантных сортов гречихи............................ 57

Ли П., Лин Р., Ванг З. Выявление и анализ различного усеченного фрагмента

аллергического белка TBb в гречихе татарской...................................64

Лазарева Т.Н., Фесенко И.Н. Сравнительный анализ электрофоретических

спектров белков семян Fagopyrum cymosum meisn. и F. tataricum gaertn........... 67

Хрунгу Н.К., Деватасан Набенита, Крефт Иван, Лисен Мария. Идентификация и молекулярная характеристика гранулированно-связанной синтазы крахмала,

извлечённой из гречихи......................................................... 70

Шипулин О.А., Фесенко А.Н., Мазалов В.И., Мартышенко Г.Е. О результатах экологического сортоиспытания гречихи и при,наках, характери,ующих урожай

зерна.............................. ...........................................76

Фесенко И.Н., Фесенко Н.Н. Новая видовая форма гречихи - Fagopyrum hybridum 78 Гуринович И.А., Фесенко А.Н., Фесенко И.Н. Мутантная форма гречихи с

блокированным ветвлением: наследование и продукционные особенности............. 82

Мартышенко Г.Е., Фесенко Н.В., Фесенко А.Н., Гуринович И.А. Создание холодостойкого детерминантного сорта гречихи Девятка......................... 85

© ФГОУ ВПО Орел ГАУ, 2010