CC BY
27
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ СТАТТІ
УДК 577.151.6
ВИДІЛЕННЯ ТА ХАРАКТЕРИСТИКА БІОХІМІЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ ФІБРИНОГЕНАЗИ З ОТРУТИ ЕФИ БАГАТОЛУСКОВОЇ (Echis multisquamatis)
1 Київський національний університет імені Тараса Шевченка
2 Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ
E-mail: [email protected]
З отрути Echis multisquamatis очищено протеїназу, що мала фібриногеназну активність. Молекулярна маса ензиму, визначена електрофорезом у ПААГ за присутності SDS, становила 35 ± 1 кДа. Інгібіторний аналіз показав, що ензим належить до родини серинових ендопептидаз. Він гідролізував X-X-R-pNa похідні трипептидів
і розщеплював ВР-ланцюг фібриногену. Молекулярна маса відщеплюваного пептиду, що становила 3,0 кДа, дозволяє припустити, що фібриногеназа розщеплює пептидний зв’язок BPR23-E24. Кт цієї реакції становила 8 цМ.
Ключові слова: Р-фібриногеназа, фібриноген, отрута Echis multisquamatis.
Список використаних скорочень: ДФФ — діізопропілфторфосфат; ЕДТА — етилендіамінтетрааце-тат; ПААГ — поліакриламідний гель; SDS — додецилсульфат натрію; ПХМБ — парахлормер-курійбензоат; S2238 — хромогенний субстрат тромбіну (H-D-Phe-Pip-Arg-pNA); S2251 — хромогенний субстрат плазміну (D-Val-Leu-Lys-pNA); S2765 — хромогенний субстрат фактора Ха (Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA); S236 (pyro-Glu-L-Pro-L-Arg-pNA) — хромогенний субстрат протеїну С; S2302 (H-D-Pro-Phe-Arg-pNa) — хромогенний субстрат калікреїну; SDS — додецилсульфат натрію.
В. О. Чернишенко 12 М. П. М’ясникова 2 Т. М. Платонова 2 Е. В. Луговськой 2 Є. М. Макогоненко 2
Зміїна отрута є сумішшю протеїнів, пептидів і ензимів, об’єктом дії яких є переважно нервова система та система гемостазу. Дія ензимів зміїних отрут на останню спрямована головним чином на фактори зсідання крові, мембрани і рецептори ендотеліальних клітин і тромбоцитів [1].
Важливу групу ензимів зміїної отрути становлять фібриногенази, що є ендопепти-дазами прямої дії. Вони не відщеплюють фібринопептиди від фібриногену і, отже, не ініціюють утворення фібрину [2, 3]. Ці ензими належать до родини металопротеїназ або серинових протеїназ. Мішенню їхньої дії є Аа- або В^-ланцюги молекули фібрин(оген)у, тому вони поділяються відповідно на а- та в-
фібриногенази. Фібриногенази гальмують формування фібринових згустків, оскільки частково деградований фібриноген втрачає здатність швидко формувати полімерний фібрин [4].
а-Фібриногенази, як правило, є цинквміс-ними металопротеїназами, молекулярна маса яких становить 20-26 кДа. Переважна більшість металозалежних фібриногеназ гідролізують як фібриноген, так і полімерний фібрин [2, 3]. в-Фібриногенази здебільшого належать до серинових протеїназ [5, 6]. Деякі з них здатні розщеплювати як фібриноген, так і фібрин, проте фібриноге-назна активність для них переважає. Як і всім сериновим протеїназам, їм властива
амідазна та естеразна активність. Молекулярна маса серинових ß-фібриногеназ становить 23-32 кДа. Hа відміну від металопро-теїназ, вони є термостабільними протеїнами і зберігають активність у широкому діапазоні р^ Більшість серинових фібриногеназ є глікопротеїнами [2, 3].
Спостерігається висока гомологія у первинній структурі серинових фібриногеназ, екзогенних активаторів плазміногену зі зміїної отрути і тромбіну. Проте ß-фібриногена-зи не виявляють тромбіноподібної активності й не здатні активувати плазміноген [3, 7].
Фібриногенази привертають до себе увагу клінічної медицини як потенційні анти-коагуляційні агенти, які шляхом інактивації фібриногену можуть зменшувати ризик утворення тромбів у передтромботичних станах при серцево-судинних захворюваннях [S, 9].
Відомо, що до 20% протеїнового складу отрути змій родини Viperidae становлять саме протеїнази, серед яких є і фібриногенази [10]. Враховуючи унікальну специфічність протеїназ зміїної отрути в розщепленні Aa-і Вß-ланцюгів фібриногену та високу концентрацію таких ензимів у отруті, метою нашої роботи було виділити й охарактеризувати фібриногенази з отрути Echis multisquamatis.
Матеріали і методи
Очищення фібриногенази. Цільну отруту (50 мг) розчиняли в 1 мл 0,025 М трис-HCl-буфера, рH 8,9, наносили на колонку, заповнену Q-сефарозою і зрівноважену тим самим буфером. Об’єм колонки — 3 мл. Після відмивання незв’язаного протеїну адсорбований протеїн елюювали ступінчастим градієнтом 0,125; 0,2; 0,35 та 1М NaCl зі швидкістю 2,55 мл-(хв-см2)-1. Фракція, що містила фіб-риногеназу, елюювалася за іонної сили 0,125 М NaCl.
Отриману фракцію фібриногенази діалі-зували проти 0,05 М трис-HCl-буфера, рH 7,4,
і наносили на колонку, заповнену гепарин-агарозою типу II (Sigmа, CШA) і зрівноважену тим самим буфером. Об’єм колонки — 2 мл. Протеїни, адсорбовані на гепарин-агарозі, елюювали послідовно 0,1 та 0,3 М NaCl зі швидкістю 1,27 мл-(хв-см2)-1. Фібриногеназа елюювалася за іонної сили 0,3 М NaCl.
Електрофоретичний аналіз проводили в 12 та 10% ПAAГ за методом Лемлі у присутності SDS [11]. Протеїнові зони ідентифікували після фарбування Coomassi R-250.
Ензимелектрофорез здійснювали з метою ідентифікації протеїнових зон з фібри-
ногеназною активністю. ПAAГ був заполі-меризований у присутності 0,5 мг/мл фібриногену. Після електрофорезу, проведеного за вищезазначеною методикою, SDS видаляли з гелю триразовим промиванням у 2,5%-му розчині тритону Х-100. Потім гель інкубува-ли в 0,1 М гліциновому буфері, рH 8,3, упродовж 12 год. Гель забарвлювали Coomassi /R-250 та ідентифікували зони протеолітичної активності за положенням незабарвле-них плям на гелі.
Коефіцієнт екстинкції 0,1% розчину фібриногенази розраховували після визначення екстинкції при 2S0 нм та концентрації протеїну в розчині методом Бредфорда [12].
Амінокислотний склад визначали на автоматичному амінокислотному аналізаторі Т-339 Mikrotekno (Чехія), у літійцитратно-му режимі в одноколонковому циклі. Гідроліз протеїну проводили в 6 N HCl у запаяних ампулах при 120 °С протягом 4 год [13].
Амідазну активність визначали за розщепленням хромогенних субстратів S223S (H-D-Phe-Pip-Arg-pNA), S2251 (D-Val-Leu-Lys-pNA), S2765 (Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA), S236 (pyro-Glu-L-Pro-L-Arg-pNA), S2302 (H-D-Pro-Phe-Arg-pNa). Aналіз проводили в мікропланшетах, у лунки яких послідовно вносили 0,05 М трис^СЬбуфер, рH 7,4, хромогенний субстрат до 40 цМ (у випадку S2302 — до 90 цМ). Реакцію ініціювали, додаючи фібриногеназу до 0,010 мг/мл (у випадку S2302 — до 0,001 мг/мл) при температурі 37 °С. Aмідазну активність фіб-риногенази характеризували за швидкістю вивільнення паранітроаніліну (pNa), яку де-тектували при довжині хвилі 405 нм за допомогою ридера Multiskan EX [14].
Інгібіторний аналіз фібриногенази проводили, визначаючи амідазну активність з використанням хромогенного субстрату тром-біну S223S, як описано вище, за присутності інгібіторів серинових протеїназ — ДФФ, бензамідину; металопротеїназ — EДTA та цистеїнових протеїназ — ПХМБ. Інгібітори вносили в лунку безпосередньо перед додаванням фібриногенази до таких кінцевих концентрацій: EДTA, бензамідин — 16 мМ, ДФФ — S мМ, ПХМБ — 1,6 мМ.
Для визначення фібриногеназної активності у фракціях, отриманих під час хроматографії, інкубували фібриноген (1,5 мг/мл) з 0,010 мг протеїну фракції в 0,05 М трис-HCl-буфері, рH 7,4, протягом 10 хв при температурі 37 °С. Кінцевий об’єм інкубаційного середовища — 0,25 мл. Згортання фібриногену ініціювали тромбіном в кінцевій концентрації 1 NIH/мл та фіксували час утворен-
2S
ня згустку. Фібриногеназну активність одержаних фракцій визначали за подовженням часу утворення згустку і виражали у відсотках від контрольного часу згортання нативного фібриногену.
Кт реакції розщеплення фібриногену фіб-риногеназою розраховували, визначаючи початкову швидкість реакції фібриногенолі-зу в діапазоні концентрацій фібриногену від
1,5 до 7,35 цМ. Реакцію гідролізу фібриногену проводили за концентрації фібриногена-зи 0,008 мг/мл в 0,05 М трис-НСІ-буфері, рН 7,4, при температурі 25 °С. Проби відбирали через 2,5; 5; 7,5; 10; 15 хв, реакцію гідролізу зупиняли додаванням буфера для електрофоретичних зразків, що містив 5% сахарози, 2% SDS та 0,2% Р-меркаптоетанолу. Зразки піддавали електрофоретичному розділенню в ПААГ з SDS. Електрофореграми сканували і визначали наростання інтенсивності забарвлення зони частково гідролізо-ваного Р'-ланцюга фібриногену в часі за допомогою денситометричної програми Totallab ТЬ100. Знаходили початкову швидкість (¥0) для кожної концентрації фібриногену і будували криві залежності У0 від Б0, Км визначали методом лінеаризації графіка в координатах Лайнуївера-Берка [15].
Обробку фібриногеназою Е- та МББК-фраг-ментів фібрин(оген)у, взятих у концентрації (1,3 мг/мл), проводили, інкубуючи їх з фібриногеназою у кінцевій концентрації
0,08 мг/мл протягом 45 хв в 0,05М трис-НСІ-буфері, рН 7,4, при температурі 25 °С. Гідролізати аналізували електрофоретично в ПААГ з SDS, як описано вище.
Результати та обговорення
У процесі фракціонування отрути Е. тиі-tisquamatis на Q-сефарозі було отримано дві фракції протеїнів, що справляли вплив на компоненти системи гемостазу. Фракція, що елюювалася за іонної сили 0,2 М ЫаС1, була здатна активувати протромбін. Очевидно, до її складу входив виділений і описаний раніше в нашій лабораторії активатор протромбіну екамулін [16].
Протеїнова фракція, що елюювалася за іонної сили 0,125 М, виявляла фібриногеназну активність та характеризувалася здатністю гідролізувати хромогенний субстрат тромбіну 82238. Оскільки отримана фракція містила домішки інших протеїнів, її наносили на афінну колонку гепарин-агарози типу II та після відмивання елюювали 0,05 М трис-НСІ-буфе-ром, рН 7,4, що містив 0,3 М ЫаС1.
У такий спосіб з 50 мг цільної отрути Е. multisquamatis було отримано 2,04 мг електрофоретично чистого препарату фібри-ногенази (рис. 1). Молекулярна маса одержаного ензиму становила 35 ± 1 кДа. За даними денситометричних вимірювань і обчислень у програмі Tota11ab Ти00, у цільній отруті 4,5% протеїну припадало на зону фібриногенази (табл. 1).
Таблиця 1. Характеристика фракції фібриногенази на різних етапах очищення
Цільна отрута Фракція після Q-сефарози Фракція після гепа-рин-агарози
Вміст протеїну, мг 50 4,79 2,04
Фібриногеназна активність, цМ/(хв-мг) 3,9 65,3 241,4
Вихід за протеїном,% 100 9,5 4,1
Ступінь очищення 0 16,7 61,89
М
170
130
95
72
55
43
34
26
Рис. 1. Електрофореграма (1) та ензимограма (2) очищеного препарату фібриногенази після гепарин-агарози; M — маркери Fermentas #0671
Для порівняння з фібриногеназами інших зміїних отрут було визначено амінокислотний склад фібриногенази (табл. 2). Як свідчать наведені дані, він помітно відрізнявся від амінокислотних складів інших фібриногеназ, зокрема афаацитину [17] (а-фібриногенази), шедонази [18] та протеази А [19] (в-фібриногеназ).
1
2
Таблиця 2. Порівняння амінокислотного складу фібриногенази з отрути E. multisquamatis (1) та фібриногеназ: афаацитину (2), шедонази (3) та протеази А (4)
1 2 3 4
N* %** N % N % N %
Lys 12 4,24 7 2,713 13 5,4S5 24 6,575
His 7 2,66 S 3,101 7 2,954 12 3,2SS
Arg 11 4,1S 13 5,039 12 5,063 17 4,65S
Asx 29 10,4S 27 10,47 26 10,97 45 12,33
Thr 1S 6,55 15 5,S14 15 6,329 nd nd
Ser 19 7,01 1S 6,977 17 7,173 2S 7,671
Glx 23 6,63 19 7,364 16 6,751 21 5,753
Pro 16 5,SS 16 6,202 19 S,017 22 6,027
Gly 29 10,6 25 9,69 19 S,017 33 9,041
Ala 20 7,3 17 6,5S9 12 5,063 21 5,753
Cys 10 3,55 12 4,651 12 5,063 20 5,479
Val 10 3,77 15 5,S14 12 5,063 1S 4,932
Met 2 0,69 6 2,326 3 1,266 4 1,096
Ile 20 7,45 20 7,752 16 6,751 2S 7,671
Leu 25 9,25 23 S,915 1S 7,595 30 S,219
Tyr 14 5,04 5 1,93S 6 2,532 12 3,2SS
Phe S 2,S4 S 3,101 9 3,797 6 1,644
Trp nd nd 4 1,55 5 2,11 nd nd
Сума 273 25S 237 365
* N — кількість амінокислот у молекулі; **% — відсотковий вміст амінокислоти.
Aналіз р^з^ежно^ амідазної активності фібриногенази (дані не наведено) показав, що рH-оптимум ензиму становив приблизно 7,4, що вказувало на його належність до серинових протеїназ.
З метою з’ясування природи активного центру фібриногенази було досліджено вплив інгібіторів серинових, метало- та цис-теїнових протеїназ на амідазну активність препарату. Як субстрат використовували хромогенний субстрат тромбіну S223S. Було виявлено, що ПХМБ та EДTA у концентраціях, що повністю інгібують активність відповідно цистеїнових протеїназ [20] та мета-лопротеїназ [21], відчутно не пригнічували амідазну активність фібриногенази. Водночас інгібітори, що ковалентно (ДФФ) чи нековалентно (бензамідин) блокують активний центр серинових протеїназ, майже повністю пригнічували амідазну активність ензиму (рис. 2). Ці дані підтверджують припущення про належність його до родини се-ринових протеїназ.
Оскільки фібриногеназа виявляла амі-дазну активність стосовно тромбінового субстрату, було досліджено субстратну спе-
цифічність ензиму до амідних субстратів деяких ензимів плазми крові (рис. 3). Встановлено, що найбільшу активність фібриногеназа виявляла до хромогенних субстратів калікреїну, тромбіну та фактора Ха, які належали до аргінінових субстратів, загальна формула яких має вигляд: Х-Х-R-pNa. Таким чином, за специфічністю фібриногеназа належала до серинових протеїназ трипсинового типу, що більш ефективно розщеплюють амід-ні зв’язки, утворені СООН-групою аргініну.
Для визначення специфічності фібрино-генази стосовно фібриногену досліджували склад гідролізатів фібриногену, отриманих після інкубації з ензимом, методом електрофорезу в ПААГ у присутності 0,2%-го ß-мер-каптоетанолу. Як свідчать дані електрофорезу (рис. 4), мішенню гідролітичної дії фібриногенази є Bß-ланцюг фібриногену. У процесі гідролізу через 7,5 хв спостерігається зменшення інтенсивності його зони і накопичення частково деградованої ß'-форми Bß-ланцюга. За допомогою обчислень у програмі Totallab TL100 було встановлено її молекулярну масу — 51,5 кДа. Беручи до уваги, що молекулярна маса Bß-ланцюга
молекули фібриногену дорівнює 54,5 кДа, можна припустити, що в ході гідролізу від Вв-ланцюга відщеплюється пептид молекулярною масою 3 кДа.
К
а-
р-
Р’
67.5 кДа
54.5 кДа
51.5 кДа
46,5 кДа
1
Рис. 2. Вплив інгібіторів на амідазну активність фібриногенази
Рис. 3. Амідазна активність препарату фібриногенази щодо хромогенних субстратів калікреїну, тромбіну, фактора Ха, плазміну, протеїну С (зліва направо)
Щоб визначити ділянку ВР-ланцюга молекули фібриногену, що гідролізується фібриногеназою, порівнювали здатність фібриногенази розщеплювати Е-фрагмент фібрину та NDSK-фрагмент фібриногену. Досліджувані фрагменти різняться між собою ^кінцевими ділянками молекули фібриногену: NDSK-фрагмент включає послідовності Аа 1-78, Вр 1-121 і у 1-62, Е-фрагмент не містить ділянки Аа 1-17 та Вр 1-54, відповідно в Аа- та ВР-ланцюгах [22]. Результати, подані на рис. 5, свідчать про те, що Е-фрагмент фібриногену не розщеплювався фібриногеназою, однак у випадку NDSK-фрагмента гідроліз був очевидний.
Рис. 4. Електрофореграма продуктів гідролізу фібриногену фібриногеназою з отрути Е. multisquamatis:
К — нативний фібриноген; 1 — продукти фібриноге-нолізу через 7,5 хв інкубації з фібриногеназою. Співвідношення ензим-субстрат становило 1:100
11* М М 2 2*
♦ 100 100 +
■4- 72
72 *-
♦ 55
55 +■
♦ 40
40 +■
33
33 ►
24
24 ♦
Рис. 5. Електрофореграма продуктів гідролізу фрагментів Е та NDSK фібрин(оген)у фібриногеназою з отрути E. multisquamatis:
1 — Е-фрагмент фібрин(оген)у; 1* — Е-фрагмент фібрин(оген)у після інкубації з фібриногеназою;
2 — NDSK-фрагмент фібриногену; 2* — NDSK-фрагмент фібриногену після інкубації з фібриноге-назою; М — маркери Fermentas #0671. Співвідношення ензим-субстрат 1:100. Час інкубації 45 хв
Таким чином, ми дійшли висновку, що, ймовірно, пептидний зв’язок, на який спрямована дія фібриногенази з отрути E. multisquamatis, міститься в N-кінцевій ділянці BP-ланцюга, а саме в межах послідовності BP 1-54. Як було виявлено, фібриногеназа переважно гідролізує зв’язки, утворені СООН-групами аргініну, тому ймовірними ділянками гідролізу можуть бути пептидні зв’язки,
утворені амінокислотами R17, R23 та R30. Розрахунки молекулярної маси потенційно відщеплюваних пептидів, подані на рис. 6, свідчать, що пептид з молекулярною масою
3 кДа може утворитися лише в разі розщеплення зв’язку BPR23-E24.
5.16K.U
Рис. 6. Локалізація місця ймовірного гідролізу фібриногеназою N-кінцевої Q1-A50 послідовності ВР-ланцюга фібриногену [24]
Дані, наведені на рис. 4, вказують на досить високу швидкість гідролізу Bß-ланцюга фібриногену ензимом. Для оцінки спорідненості ензиму до протеїнового субстрату було проаналізовано кінетику гідролізу фібриногену в діапазоні концентрацій від 1,75 до 7,3 цМ фібриногену. Гідролізати аналізували методом електрофорезу у ПААГ/SDS-Na у присутності ß-меркаптоетанолу.
За допомогою програми Totallab ТЬ100 було обраховано серію отриманих електро-фореграм гідролізатів фібриногену та обчислено кінетичні параметри розщеплення зв’язку BßR23-E24 Bß-ланцюга фібриногену фібриногеназою, як описано у методах.
Отримана величина Km = 8 цМ гідролізу Bß-ланцюга молекули фібриногену ензимом дуже близька до величин Km для реакцій
відщеплення тромбіном А- та В-фібринопеп-тидів, які знаходяться у межах 8-10 цМ [23].
Відомо, що саме в N-кінцевих ділянках Bß-ланцюга зосереджені важливі функціональні сайти молекули, зокрема центр полімеризації В (ß15-18), ділянки зв’язування з тромбоцитами (ß15-42), гепарин- та тромбінзв’язувальні ділянки (ß19-42) [25], ділянки, відповідальні за міждоменні ДД-Е взаємодії у процесі полімеризації фібрину (ß12-46) [26]. Тому використання фібрино-генази з отрути E. multisquamatis для обмеженого протеолізу [27] дозволить отримувати частково деградовані за N-кінцями Bß-лан-цюга форми фібрин(оген)у. Можна очікувати, що такі форми фібриногену зберігатимуть близьку до нативної структуру Е-домену молекули та функціональну активність негідролізованих ділянок Bß-ланцюга [2829], що є перспективним для вивчення процесу полімеризації фібрину та фібрин(оген)-клітинних взаємодій.
Отже, нами було отримано та охарактеризовано нову фібриногеназу з отрути
E. multisquamatis. Електрофоретично гомогенний препарат був ізольований завдяки послідовному застосуванню іонообмінної та афінної хроматографії на Q-сефарозі та гепа-рин-агарозі відповідно. Фібриногеназа належить до ß-фібриногеназ, оскільки гідролізує Bß-ланцюг молекули фібриногену, розщеплює амідні зв’язки, переважно утворені СООН-групою аргініну. Ймовірно, що ензим розщеплює пептидний зв’язок BßR23-E24 у Bß-ланцюзі і його можна використовувати у дослідженнях структури та функцій фібриногену-фібрину.
ЛІТЕРАТУРА
1. Braud S., Bon C., Wisner A. Snake venom proteins acting on hemostasis // Biochimie. — 2000. — V. 82, N 9-10. — P. 851-859.
2. Markland F. S. Fibrin(ogen)olytic enzymes from snake venoms / Haemostasis and Animal Venoms. Ed. Pirkle H., Markland F. S. — Marcel Dekker, Inc. — 1988. — P. 149-165.
3. Swenson S., Markland F. S. Snake venom fib-rin(ogen)olytic enzymes // Toxicon. — 2005. — V. 45. — P. 1021-1039.
4. Kini R. M. Anticoagulant proteins from snake venoms: structure, function and mechanism // Biochem. J. — 2006. — V. 397. — P. 377-387.
5. Jiao H.-M., Yang L.-X., Lu B. et al. Shedaoenase, a Novel Fibrinogenase from the Venom of Agkistrodon shedaoenthesis Zhao // Acta Biochim. Biophys. Sin. — 2005. — V. 37, N 12. — P. 835-842.
6. Samel M., Subban J., Siigur J., Siigur E. Biochemical characterization of fibrinogeno-lytic serine proteinases from vipera lebetina snake venom // Toxicon. — 2002. — V. 40. — P. 51-54.
7. Matsui T., Sakurai Y., Fujimura Y. et al. Purification and amino acid sequence of haly-stase from snake venom of Agkistrodon halys blomhoffii, a serine protease that cleaves specifically fibrinogen and kininogen // Eur J. Biochem. — 1998. — V. 252. — P. 569-575.
8. Gardiner E. E., Andrews R. K. The cut of the clot(h): snake venom fibrinogenases as therapeutic agents // J. Thromb. Haemost. — 2008. — V. 6, N 8. — P. 1360-1362.
9. Liu M., Counsell C., Zhao X. L. Wardlaw J. Fibrinogen-Depleting Agents for Acute Ischemic Stroke // Stroke. — 2005. — V. 36. — P.173-174.
10. Wisner A., Braud S., Bon C. Snake venom pro-teinases as tools in hemostasis studies: struc-ture-function relationship of a plasminogen activator purified from Trimeresurus stej-negeri venom // Haemostasis. — 2001. — V. 31. — P. 133-140.
11. Laemli R. V. Cleavage of structural poteins during of bacteriophage T4 // Nature. — 1970. — V. 227. — P. 680-685.
12. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein — dye binding // Anal. Biochem. — 1976. — V. 72. — P. 248-254.
13. Speckmann D., Stein W., Moore S. Automatic recording aparatus for use in the chromatography of amino acids // Anal. Chem. — 1958. — V. 30. — P. 1190-1196.
14. Гершкович А. А., Киберев В. К. Хромогенные и флуорогенные пептидные субстраты про-теолитических ензимов // Биоорг. хим. — 1988. — Т. 14, № 11. — С. 1461-1488.
15. Dixon M., Webb E. C. Enzymes. — New York: Academic Press Inc., Publishers, 1964. — 950 p.
16. Solovjev D. A., Platonova T. N., Ugarova T. P. Purification and characterization of eca-mulin — a new prothrombin activator from the Echis multisquamatis snake venom // Biochemistry. — 1996. — V. 61. — P. 785-793.
17. Lababa-Djebari F., Martin-Eauclaire M.-F. I., Mauco G., Marchot P. Afaacytin, an ap-fib-rinogenase from Cerastes cerastes (Horned Viper) venom, activates purified factor X and induces serotonin release from human blood platelets // Eur. J. Biochem. — 1995. — V. 233. — P. 756-765.
18. Jiao H. M., Yang L. X., Lu B. et al. Shedaoe-nase, a novel fibrinogenase from the venom of Agkistrodon shedaoenthesis Zhao // Acta Biochim. Biophys. Sin. — 2005. — V. 12. — P. 835-842.
19. Murayama N., Saguchi K., Mentele R. The unusual high molecular mass of Bothrops
protease A, a trypsin-like serine peptidase from the venom of Bothrops jararaca, is due to its high carbohydrate content // Biochim. Biophys. Acta. — Proteins & Proteomics. —
2003. — V. 1652, N 3. — P. 1-6.
20. Webster A., Russell W. C., Kemp G. D. Characterization of the adenovirus proteinase: development and use of a specific peptide assay // J. Gen. Virol. — 1989. — V. 70. — P. 3215-3223.
21. Marcussia S., Bernardesa C. P., Santos-Filho N. A et al. Molecular and functional characterization of a new non-hemorrhagic metal-loprotease from Bothrops jararacussu snake venom with antiplatelet activity // Peptides. — 2007. — V. 28, N 12. — P. 2328-2339.
22. Gardlund B. Human fibrinogen amino acid sequence of fragment E and of adjacent structures in the Aa- and Bp-chains // Thromb. Res. — 1977. — V. 5. — P. 689-702.
23. Higgins D. L., Lewis S. D., Shafer J. A. Steady state kinetic parameters for the thrombin-catalysed conversion of human fibrinogen to fibrin // J. Biol. Chem. — 1983. — V. 258, N 15. — P. 9276-9282.
24. Watt K. W. K., Takashi Takagi, Doolittle R.
F. Amino acid sequence of the p-chain of human fibrinogen: Homology with the y-chain // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1987. — V. 75, N 4. — P. 1731-1735.
25. Mosesson M. W. Fibrinogen and fibrin structure and function // J. Thromb. Haemost. — 2005. — V. 3. — P. 1894-1904.
26. Lugovskoy E. V., Gritsenko P. G., Kapustia-nenko L. G. et al. Functional role of Bp-chain N-terminal fragment in the fibrin polymerization process // FEBS J. — 2007. — V. 274. — P. 4540-4549.
27. Fontana A., Polverino de Laureto P., Spolaore B. et al. Probing protein structure by limited proteolysis // Acta Biochim. Polonica. —
2004. — V. 51, N 2. — P. 299-321.
28. Fontana A., Fassina G., Vita C. et al. Correlation between sites of limited proteolysis and segmental mobility in thermolysin // Biochemistry. — 1986. — V. 25, N 8. — P. 1847-1851.
29. Zappacosta F., Pessi A., Bianchi E. et al. Probing the tertiary structure of proteins by limited proteolysis and mass spectrometry: the case of Minibody // Prot. Sci. — 1996. — V. 5. — P. 802-813.
ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ФИБРИНОГЕНАЗЫ ИЗ ЯДА ЭФЫ МНОГОЧЕШУЙЧАТОЙ
(Echis multisquamatis)
В. А. Чернышенко 12 М. П. Мясникова 2 Т. Н. Платонова 2
Э. В. Луговской 2 Е. М. Макогоненко 2
1 Киевский Национальный университет имени Тараса Шевченко
2 Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев
E-mail: [email protected]
Из яда Echis multisquamatis очищена про-теиназа с фибриногеназной активностью. Молекулярная масса энзима, определенная с помощью электрофореза в ПААГ в присутствии SDS, составляла 35 ± 1 кДа. Ингибиторный анализ показал, что энзим принадлежит к семейству сериновых эндопептидаз. Он гидролизировал X-X-R-pNa производные трипептидов и расщеплял ВР-цепь фибриногена. Молекулярная масса отщепляемого пептида, составляющая 3,0 кДа, позволяет предположить, что фибриногеназа расщепляет пептидную связь BPR23-E24. Кт этой реакции составляла 8 дМ.
Ключевые слова: Р-фибриногеназа, фибриноген, яд Echis multisquamatis.
PURIFICATION AND BIOCHEMICAL CHARACTERIZATION OF FIBRINOGENASE FROM VENOM OF Echis multisquamatis
V. O. Chernyshenko 1 2 M. P. Myasnikova 2 T. M. Platonova 2 E. V. Lougovskoi 2 E. M. Makogonenko 2
1 National Taras Shevchenko University, Kyiv
2 Palladin Institute of Biochemistry of National
Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: [email protected]
Proteinase that demonstrated fibrinogenase activity from the venom of Echis multisquamatis was purified. Molecular weight of enzyme determined by SDS PAGE was 35 ± 1 kDa. Inhibitory assay showed that fibrinogenase belonged to the serine type of proteinases. It hydrolyzed X-X-R-pNa derivatives of tripeptides and splitted BP-chain of fibrinogen. Molecular weight of removed peptide of BP-chain allowed to suppose that fibrinogenase splitted BPR23-E24 peptide bound. The Km value of this reaction was 8 pM.
Key words: P-fibrinogenase, fibrinogen, venom of Echis multisquamatis.
