CC BY
33Фізика живого, Т. 18, ^ 2, 2010. С.92-95. © Чернишенко В. О.
ІЧі>мс> оНІїс Аіпс
п » п.|іа.м‘і('іі(чмч'іисг.ін'1
УДК 577.151.45
КІНЕТИКА ГІДРОЛІЗУ АМІДНИХ СУБСТРАТІВ ФІБРИНОГЕНАЗОЮ З ОТРУТИ ECHIS
MULTISQUAMATIS
Чернишенко В.О.
ННЦ «Інститут біології»Київського національного університету імені Тараса Шевченка Інститут біохімії імені О.В. Палладіна НАН України
Надійшла до редакції 10.02.2010
Визначено кінетичні параметри амідазної активності фібриногенази із отрути Ескіз multisquamatis (ефи багатолускової). Визначено, що фермент має спорідненість до Х-Х-Я-р№ похідних трипептидів - 82302 (Н-Б-Рго-РЬе-А^-рКа, Кт = 15,1±1,4цМ), 82238 (Н-Б-РЬе-Рір-Агв-р№, Кт = 95,0±0,9цМ), 82765 (г-Б-Агв-аіу-Агв-р№, Кт = 27,2±1,7). Найбільша специфічність до амідного субстрату калікреїну 82302 свідчить про важливість для гідролізу присутності позитивно зарядженого аргініну в Р1 положенні та ароматичної амінокислоти фенілаланіну в Р2 положенні. Значення кінетичних констант та специфічність фібриногенази із отрути Ескіз multisquamatis є порівнюваними із такими для інших фібриногеназ змііїної отрути.
Ключові слова: фібриногеназа, отрута Ескіз multisquamatis, серинова протеїназа, кінетика.
ВСТУП
Серинові протеїнази привертають увагу дослідників, оскільки по-перше - залучені до більшості фізіологічних процесів, що відбуваються в організмі, а по-друге -вивчення їх функціонування є ключем до розуміння регуляції ферментативної активності та залежності структури ферменту від його активності [1]. Дослідження їх гідролітичної та фізіологічної активності показали, що маючи схожу структуру та виявляючи загальну групову специфічність до пептидних зв’язків, утворених С-групою лізину чи аргініну, вони здатні специфічно гідролізувати макромолекулярні субстрати [2]. Зокрема, серед серинових протеїназ зміїної отрути виявлено такі, що впливають на компоненти системи гемостазу: протромбін [3], протеїн С [4], плазміноген [5], інші компоненти системи гемостазу [6].
Особливим класом серед таких ферментів є фібриногенази. Фібриногенази серинової природи гідролізують насамперед Р-ланцюг молекули фібриногену [7, 8]. Раніше нами було отримано серинову Р-фібриногеназу із отрути ЕсЫз multisquamatis та показано її здатність гідролізувати амідні зв’язки, утворені С-групою аргініну [9]. Амідні субстрати є придатним інструментом для дослідження активного центру та характеристики каталітичної активності ферментів [10]. Тому метою даної роботи було визначення кінетичних параметрів гідролітичної дії фібриногенази на Х-Х-Я-р№ похідні трипептидів.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
82302 (Н-Б-Рго-РЬе-А^-рКа) були придбані у СЬгото§еп1х.
Розщеплення хромогенних субстратів вивчали в мікропланшетах, у лунки яких послідовно вносили 0,05 М трис-НСІ буфер рН 7,4 з 0,13 М ШС1, хромогенний субстрат у діапазоні концентрацій від 25 до 160 цМ. Реакцію запускали додаванням фібриногенази до кінцевої концентрації 0,010 мг/мл (у випадку 82302 - до 0,001 мг/мл) при температурі 25°С. Амідазну активність фібриногенази характеризували за швидкістю вивільнення
паранітроаніліну (рКа), яку детектували при довжині хвилі 405 нм за допомогою рідера МиІЇ^кап ЕХ [10].
Кт реакції розщеплення хромогенних субстратів та фібриногену фібриногеназою розраховували, визначаючи початкову швидкість реакції гідролізу (Уо) для кожної концентрації субстрату, і будували криві залежності Уо від 8о, Км визначали методом лінеаризації графіка у
координатах Лайнуївера-Берка [11].
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Нами було проведено порівняння гідролітичної дії амідних субстратів з аргініном (82302, 82238, 82765, 8236) та лізином (82251) у Р1 центрі. Графік залежності початкової швидкості реакції від
початкової концентрації субстратів представлено на рисунках 1 та 2.
Хромогенні субстрати 82238 (Н-Б-РЬе-Р1р-Аг§-
рКА), 82251 (Б-УаІ-Ьеи^-рКА), 82765 (г-Б-А^-01у-Аг§-рКА), 8236 (руго-01и-Ь-Рго-Ь-Аг§-рКА),
КІНЕТИКА ГІДРОЛІЗУ АМІДНИХ СУБСТРАТІВ ФІБРИНОГЕНАЗОЮ З ОТРУТИ ECHIS MULTISQUAMATIS
0,06
0,05
0,04
_LJ
5. 0,03 >
0,02
0,01
0
Рис. І. Гідролітична дія фібриногенази з отрути E. multisquamatis на амідні субстрати: S2302, S2238.
0,0125 0,01
О
І. 0,0075
>
0,005 0,0025 0
0 50 100 150
[S], цм
Рис. 2. Гідролітична дія фібриногенази з отрути E. multisquamatis на амідні субстрати: S2765, S236, S2251.
Аналіз кінетичних показників, наведений у таблиці 1, показав, що окрім субстрату S2302
(Km=15,1 ЦМ, kcat=2, 17 с-1) фібриногеназа проявляє високу спорідненість, яку можна оцінити за значенням Km, до субстрату фактора Ха (S2765), хоча каталітична константа (kcat) для цього субстрату низька.
Цікавим є порівняння амідазної активності фібриногенази з отрути E. multisquamatis із амідазною активністю інших протеїназ зміїної отрути. У таблиці
2 наведено порівняння кінетичних параметрів описуваної фібриногенази (б) з іншими фібриногеназами (1-5) зі зміїної отрути, для яких було проведено достатньо широкі дослідження субстратної специфічності.
Таблиця І. Кінетичні параметри гідролізу амідних субстратів фібриногеназою з отрути E. multisquamatis.
Km, ЦМ kcat, с 1 kcat/Km, (цМ-с)-1
S2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNa)1 95,0±0,9 0,617 0,0065
S2302 (H-D-Pro-Phe-Arg-pNa) 2 15,1±1,4 2,17 0,15
S2251 (D-Val-Leu-Lys-p№)3 159,2±1,9 0,185 0,0012
S2765 (Z-D-Arg-Gly-Arg-p№) 4 27,2±1,7 0,067 0,0025
S236 (pyro-Glu-L-Pro-L-Arg- p№) 5 80,2±1,0 0,052 0,00065
1 - хромогенний субстрат тромбіну, 2 - хромогенний субстрат калікреїну, 3 - хромогенний субстрат плазміну, 4 -хромогенний субстрат фактору Ха, 5 - хромогенний субстрат протеїну С.
Таблиця 2. Кінетичні параметри гідролізу амідних субстратів
сериновими протеїназами зі зміїної отрути
S2302 (H-D-Pro-Phe-Arg-pNa)
Km, ЦМ kcab c
1 27 10,2
2 53 0,6
3 50 115
4 188 1,39
5 113 0,3
б 15,1 2,2
S2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNa)
Km, ЦМ ^cab c
1 46,7 19
2 196 0,9
3 н.в. н.в.
4 197 9,75
5 265 0,49
б 95,0 0,6
S2251 (D-Val-Leu-Lys-pN)
Km, цМ ^cab c
1 399,2 В
2 - -
3 1450 9,7
4 н.в. н.в.
5 н.в. н.в.
б 159,2 0,185
1 - серинова протеїназа з отрути Trimerensus jerdonii, ß-фібриногеназа [15],
2 - серинова протеїназа з отрути Trimerensus jerdonii, тромбін-подібний фермент [15],
3 - серинова протеїназа з отрути Lachesis muta muta, тромбін-подібний фермент [14],
4 - серинова протеїназа з отрути Agkistrodon acutus,
фібрин(оген)аза AaV-SP-I [17],
5 - серинова протеїназа з отрути Agkistrodon acutus,
фібрин(оген)аза AaV-SP-II [17].
6 - серинова протеїназа з отрути E. multisquamatis,
фібриногеназа.
н.в. - показник не визначався.
Фібриногенази із отрути Agkistrodon shedaoenthesis та із отрути Cerastes cerastes специфічні насамперед до а-ланцюга молекули
фібриногену, володіють найвищою спорідненістю до
Чернишенко В.О.
плазмінового субстрату. Однак, плазмін-подібна активність щодо амідних субстратів у жодному разі не свідчить про плазмін-подібну активність у випадку фібриногену. Сайти, за якими такі ферменти розщеплюють фібриноген відмінні від плазмінових [12, 13]. До субстратів з лізином у положенні Р1 виявляють спорідненість тромбін-подібні ферменти зміїної отрути, які також є сериновими протеїназами. Однак, тоді як тромбін-подібний фермент із отрути Lachesis muta muta гідролізує S2251 (Km=1450 цМ, kcat=9,7 с-1), хоча й менше, ніж субстрати з аргініном у положенні Р1, тромбін-подібний фермент із отрути Trimerensus jerdonii субстрат S2251 гідролізувати не здатен [14, 15]. В той же час ß-фібриногеназа з отрути Trimerensus jerdonii амідний субстрат плазміну гідролізує (Km = 399 цМ, kcat = 8 с-1).
Як бачимо, спорідненість фібриногенази з отрути E. multisquamatis до плазмінового субстрату S2251 вища, ніж у інших досліджених ферментів зміїної отрути, однак кількість обертів реакції, а відповідно й константа специфічності kcat/Km значно нижча.
Здатність гідролізувати субстрат тромбіну S2238 мають чи не всі фібриногенази серинової природи. Уже згадувана фібриногеназа із отрути Trimerensus jerdonii виявляє до S223 8 досить високу спорідненість (Km=46,7 цМ, kcat=19 с- ) [15]. Серинові протеїнази отрути Agkistrodon acutus, специфічні до фібриногену та фібрину, мають схожі кінетичні показники гідролізу даного субстрату (Km=197 цМ, kcat=19,75 с-1; Km=265 цМ, kcat=0,49 с-1) [16].
З найбільшою специфічністю фібриногеназа із отрути E. multisquamatis розщеплювала хромогенний субстрат калікреїну S2302. Варто відзначити, що висока спорідненість саме до цього субстрату характерна для більшості фібриногеназ серинової природи, за рідкісними винятками [12], хоча спостерігається і у випадку деяких тромбін-подібних ферментів [14]. Активно гідролізують S2302 фібриногеназа із отрути Trimerensus jerdonii (Km=46,7 цМ) [15], Agkistrodon acutus (Km=198 цМ, Km=113 цМ) [16]. Високу гідролітичну активність щодо низькомолекулярних субстратів калікреїну виявляють фібриногенази з отрути Vipera lebetina [19] та Agkistrodon halys blomhoffii [18]. Для фібриногеназ із отрут Agkistrodon halys blomhoffii та Trimerensus jerdonii також показана кінін-вивільнювальна активність [18, 20]. Причина такої високої
спорідненості фібриногеназ серинової природи до калікреїнового субстрату пов’язана із знаходженням ароматичної кислоти фенілаланіну в Р2 положенні.
Вивчення амідазної активності протеїназ дозволяє отримати інформацію про їх субстратну специфічність та структуру активного центру. Крім того, кінетичні параметри амідазної активності використовують для стандартизації препаратів протеїназ, отриманих із різних партій сировини. Хоча амідазна активність характерна для всіх серинових протеїназ зі зміїної отрути [16]. При цьому чіткого
зв’язку між специфічністю до амідних субстратів і біологічною активністю протеїназ не спостерігається.
ВИСНОВКИ
У ході досліджень нами було проаналізовано гідролітичні властивості фібриногенази із отрути E. multisquamatis. Показана її висока спорідненість до амідних субстратів з аргініном у Р1 положенні, визначено кінетичні параметри амідазних реакцій. Порівняння амідазної активності фібриногенази із отрути E. multisquamatis з амідазною активністю серинових протеїназ із інших зміїних отрут показало, що значення визначених кінетичних параметрів є порівнюваними.
Література
1. Perona J.J., Craik C.S. Structural basis of substrate specificity in the serine proteinases // Protein S^nce. -1995. - Vol. 4. - P. 337-360.
2. Serrano S.M.T., Maroun R.C. Snake venom serine proteinases: sequence homology vs substrate specificity, a paradox to be solved // Toxicon. - 2005. - Vol.45.
- P. 1115-1132.
3. Solov'ev D.A., Platonova T.N., Ugarova T.P. Isolation and characteristics of ekamulin - a prothrombin activator from multiscaled viper (Echis multisquamatus) venom // Biokhimiia. - 1996. - Vol. 61, N6. - P.1094-1105.
4. Platonova T.N., Gornitskaia O.V. Isolation and characteristics of the protein C activator from Agkistrodon halys halys snake venom // Ukr Biokhim Zh. - 2004. - Vol. 76, N3. - P.62-67.
5. Zhang Y., Wisner A., Xiong Y., et al. A novel plasminogen activator from snake venom. Purification, characterization, and molecular cloning // J. Biol. Chem. - 1995. - Vol. 270. -P.10246-10255.
6. Braud S., Bon C., Wisner A. Snake venom proteins acting on hemostasis // Biochimie. - 2000. - Vol.82, N 9 - 10. -P.851-859.
7. Markland F.S. Fibrin(ogen)olytic enzymes from snake venoms // In: “Haemostasis and Animal Venoms” edited by Pirkle H., Markland F. S. - Marcel Dekker, Inc. - 1988. -P.149-165.
8. Swenson S., Markland F.S. Snake venom fibrin(ogen)olytic enzymes // Toxicon. - 2005. - Vol.45. - P.1021-1039.
9. Чернишенко В.О., М’ясникова М.В., Платонова Т.М. та ін. Виділення та характеристика біохімічних властивостей фібриногенази з отрути ефи багатолускової (Echis multisquamatis) // Біотехнологія. - 2010. - т.3, N1. -С.27-34.
10. Гершкович А.А., Киберев В.К. Хромогенные и флуорогенные пептидные субстраты протеолитических ферментов // Биоорганическая химия. - 1988. - т.14, N11.
- С.1461-1488.
11. Dixon M., Webb E.C. Enzymes // Academic Press Inc., Publishers. - 1964. - New York. - 950 p.
12. Jiao H.-M., Yang L.-X., Lu B., et al. Shedaoenase, a Novel Fibrinogenase from the Venom of Agkistrodon shedaoenthesis Zhao // Acta Biochim. Biophys. Sinica. -2005 - Vol.37, N12. - P.835-842.
13. Lababa-Djebari F., Martin-Eauclaire M.-F. I., Mauco G., Marchot P. Afaасytin, an ap - fibrinogenase from Cerastes cerastes (Horned Viper) venom, activates purified factor X
КІНЕТИКА ГІДРОЛІЗУ АМІДНИХ СУБСТРАТІВ ФІБРИНОГЕНАЗОЮ З ОТРУТИ ECHIS MULTISQUAMATIS
and induces serotonin release from human blood platelets // Eur. J. Biochem. - 1995. - Vol.233. - P.756-765.
14. Magalhaes H.P.B., Magalhaes A., Juliano L., et al. Mechanism of action and determination of the best substrate for a thrombin-like enzyme from Lachesis muta muta venom by regression analysis of the kinetic parameters determined with peptidyl p- nitroanilide substrates // Toxicon. - 2006. -Vol.47. - P.453-458.
15. Jin Y., Lu Q.-M., Wang W.-Y., et al. Action of two serine proteases from Trimerensus jerdonii venon on chromogenic substrates and fibrinogen // Comparative biochemistry and physiology. - 2002. - Vol.132. - P. 529-534.
16. Zhang Y., Xiong Y., Bon C. Effects on Chinese Snake venoms on blood coagulation, purified coagulation factors and synthetic chromogenic substrates // Asiatic herpetological journal. - 1993. - Vol. 5. - P. 117-126.
17. Zhu Z., Liang Z., Zhang T., et al. Crystal structures and amidolytic activities of two glycosylated snake venom serine proteinases // J. Boil. Chem. - 2005. - Vol. 280, N11. -P.10524-10529.
18Matsui T., Sakurai Y., Fujimura Y., et al. Purification and amino acid sequence of halystase from snake venom of Agkistrodon halys Momhoffii, a serine protease that cleaves specifically fibrinogen and kininogen // Eur. J. Biochem. -1998. - Vol.252. - P.569-575.
19.Samel M., S^M S., Siigur J., Siigur E. Biochemical characterization of fibrinogenolytic serine proteinases from Vipera tetina snake venom // Toxicon. - 2002. - Vol.40. -P.51-54.
22. Jia Y.-H., Jin Y., Lu Q.-M. Jerdonase, a novel serine protease with kinin-releasing and fibrinogenolytic activity from Trimeresurus jerdonii venom // Acta biochimica et biophysica sinica. - 2003. -Vol.35, N8. - P.689-694.
КИНЕТИКА ГИДРОЛИЗА АМИДНЫХ СУБСТРАТОВ ФИБРИНОГЕНАЗОЙ ИЗ ЯДА ECHIS MULTISQUAMATIS Черннышенко В.А.
Определены кинетические параметры амидазной активности фибриногеназы из яда Echis multisquamatis (эфы многочешуйчатой). Определено, что фермент проявляет сродство к X-X-R-pNa производным трипептидов - S2302 (H-D-Pro-Phe-Arg-pNa, Km = 15,1±1,4цМ), S2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNa, Km = 95,0±0,9цМ), S2765 (Z-D-Arg-Gly-Arg-p№, Km = 27,2±1,7). Наибольшая специфичность к амидному субстрату калликреина S2302 свидетельствует о важности для гидролиза присутствия положительно заряженного аргинина в P1 положении и ароматической аминокислоты фенилалалнина в P2 положении. Значение кинетических констант и специфичность фибриногеназы сравнимы с такими для других фибриногеназ из яда змей.
Ключевые слова: фибриногеназа, яд Echis multisquamatis, сериновая фибриногеназа, кинетика
KINETICS OF AMIDE SUBSTRATES HYDROLYSIS BY FIBRINOGENASE FROM ECHIS MULTISQUAMATIS VENOM FIBRINOGENASE Chernyshenko V.O.
Kinetic parameters of Echis multisquamatis venom fibrinogenase amidolytic activity were determined. Specificity to X-X-R-pNa tripeptide derivates was shown: S2302 (H-D-Pro-Phe-Arg-pNa, Km = 15,1±1,4цМ), S2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNa, Km = 95,0±0,9цМ), S2765 (Z-D-Arg-Gly-Arg-pNа, Km = 27,2±1,7). Enzyme was more specific to kallikrein amide substrate S2302. It meant that positively charged arginine in the position P1 and aromatic amino-acid phenilalanine in the position P2 supported hydrolysis. The rate of kinetic constants and specificity of Echis multisquamatis venom fibrinogenase are comparable with those for other snake venom fibrinogenases.
Key words: fibrinogenase, venom of Echis multisquamatis, serine protease, kinetics
