CC BY
27Фізика живого, Т17, No2, 2009. С. 120-122. © Корольова Д. С.
УДК 577.151.042.5: 612.115
ОТРИМАННЯ МЕЗОТРОМБІНУ - ПРОМІЖНОГО ПРОДУКТУ АКТИВАЦІЇ ПРОТРОМБІНУ
Корольова Д.С.
Київський національний університет імені Тараса Шевченко e-mail: [email protected]
Надійшла до редакції 03.12.2008
Розроблено метод отримання проміжного продукту активації протромбіну - мезотромбіну. В основі методу лежить використання іммобілізованого активатора протромбіну з отрути ефи багатолускової (Echis multisquamatis) -екамуліну. Отриманий у такий спосіб препарат мезотромбіну володіє ферментативною активністю та залишається стабільним, тому може бути використаний для дослідження молекулярних механізмів функціонування гемостазу.
Ключевые слова: мезотромбін, протромбін, екамулін
ВСТУП
Центральним регуляторним ферментом системи гемостазу є тромбін, що циркулює в кровотоці у вигляді проферменту протромбіну. На першому етапі активації протромбіну протромбіназним комплексом в каталітичному домені проферменту розщеплююється пептидний зв’язок Арг320 - Іле 321 в наслідок чого утворюється мезотромбін (рис. 1). Мезотромбін розщеплюється (Арг 271 - Тре 272) з утворенням тромбіну [1, 2, 3].
АрГ 271 ТрЄ272 Аргзао Ьіезаі
протромбін
І
мезотромбін
І
а. -тр омбін
Рис. 1. Схема розщеплення протромбіну протромбіназним комплексом. S-S - дисульфідний зв’язок.
На даний момент все більшу увагу дослідників привертає вивчення ролі продуктів обмеженого протеолізу функціонально активних білків, зокрема, мезотромбіну, в функціонуванні системи гемостазу [4, 5, 6]. Тому важливою задачею, що постає перед дослідниками, є отримання та виділення продуктів розщеплення протромбіну.
Оскільки мезотромбін є дуже нестабільним і швидко перетворюється на тромбін шляхом
автокаталізу, більшість досліджень фунціональної ролі мезотромбіну проводяться на стабільній формі мутантного мезотромбіну з амінокислотними замінами Арг155^ Ала, Арг271^Ала, Арг286^Ала, які не впізнаються протромбіназним комплексом та тромбіном, а відтак не розщеплюються протромбіназою чи шляхом автокаталізу [6]. Однак, зважаючи на високу конформаційну рухливість молекул протромбіну та тромбіну, навіть незначні амінокислотні заміни в первинній структурі цих білків можуть призвести до відчутних змін в третинній структурі, а відтак, і в їхніх функціях.
Крім того, деякі дослідники [7] пропонують використовувати мезотромбін в присутності інгібіторів автокаталізу, зокрема, похідних дансіларгініну. Однак вивчення ферментативної активності в присутності сполуки, яка може зв’язуватись з активним центром, на нашу думку, є некоректним і може призвести до хибних результатів.
Метою роботи стало розробити метод отримання та очистки мезотромбіну, придатного для використання в модельних системах.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Протромбін отримували з плазми крові людини шляхом попередньої сорбції на сірчанокислому барії та подальшою очисткою шляхом іонообмінної хроматографії на Q-сефарозі та гель-фільтрації на сефакрилі S-200 [8].
Ферментативну активність тромбіну та мезотромбіну визначали за допомогою хромогенного субстрату S2238 (Н- D - Phe - Pip -Arg - pNA-2 HCl), який при розщеплення вивільняє п - нітроанілін (pNA). Швидкість вивільнення pNA
ОТРИМАННЯ МЕЗОТРОМБІНУ - ПРОМІЖНОГО ПРОДУКТУ АКТИВАЦІЇ ПРОТРОМБІНУ
визначали спектрофотеметрично, вимірюючи оптичне поглинання при 405 нм і віднімаючи значення поглинання при 492 нм. Для розрахунку концентрації pNA використовували коефіцієнт молярної екстинкції: є=1,06-10"4 М-1см"\
Екамулін отримували із кристалічної отрути ефи багатолускової (Echis multisqumatis) на Q-сефарозі та гель-фільтрацією на супердексі G-75 [9].
Електрофорез у поліакріламідному гелі (ПААГ) в присутності SDS проводили за методом Лемлі [10].
Іммобілізацію екамуліну проводили згідно методу [11].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для дослідження молекулярних механізмів регуляції системи гемостазу часто використовують активатори протромбіну з отрути змій [2, 4]. Нами було виділено та охарактеризовано активатор протромбіну з отрути ефи багатолускової -екамулін [12]. Було показано, що екамулін розщеплює зв’язок між А та В ланцюгами каталітичного домену протромбіну, що призводить до формування молекули мезотромбіну.
Мезотромбін автокаталітично перетворюється на тромбін [12].
Зважаючи на такі властивості екамуліну, ми використали його для отримання препарату мезотромбіну.
Щоб уникнути додаткового етапу очистки
активованого протромбіну від екамуліну, ми використали препарат екамуліну іммобілізований на BrCN-сефарозі. Отримана екамулін-сефароза
зберіала здатність розщеплювати протромбін.
Утворений мезотромбін автокаталітично перетворювався в тромбін (рис.2 треки 1-4).
1 23 45678М
Про____
Мез— Тр ----
Рис. 2. Електрофореграма розщеплення протромбіну іммобілізованим екамуліном за відсутності (1, 2, 3, 4) та за присутності бензамідину (5, б, 7, 8), інкубація 30, 60, 120 та 240 хвилин. М - маркери (11б; бб,2; 45; 35 кДа). Про - протромбін, Мез - важкий ланцюг мезотромбіну, Тр - В-ланцюг тромбіну. Всі зразки оброблено 0,2% в-меркаптоетанолом.
Таким чином, для отримання препарату мезотромбіну, було необхідно провести активацію протромбіну на екамулін-сефарозі в присутності інгібітора автокаталізу мезотромбіну, який відповідав би таким вимогам: не інгібував
екамулін, взаємодіяв з мезотромбіном зворотньо і легко видалявся з препарату мезотромбіну. Оскільки активний центр тромбіну та мезотромбіну однакові, незважаючи на інші конформаційні відмінності, було протестовано оборотній
низькомолекулярний інгібітор тромбіну -бензамідин. Як видно з рис. 3, бензамідин інгібує ферментативну активність тромбіну в 5мМ концентрації, тому в подальшому для інгібування автокаталізу мезотромбіну ми використовували саме цю концентрацію бензамідину.
Інкубація протромбіну з екамулін-сефарозою в присутності бензамідину показала, що за таких умов утворений із протромбіну мезотромбін не перетворювався на тромбін за рахунок автокаталізу (рис 2, треки 5-8). Препарат мезотромбіну зберігали в присутності інгібітора автокаталізу (бензамідину) при температурі -20°С впродовж 5 діб і перед використанням видаляли бензамідин гель-фільтрацією на PD-10.
Показано, що після видалення інгібітора препарат мезотромбіну володів ферментативною активністю, зокрема, розщеплював тромбін-специфічний хромогенний субстрат S2238, що фіксувалось за появою п - нітроаніліну (рис. 4).
Рис. 4. Поява п - нітроаніліну (pNA) за дії мезотромбіну на хромогенний субстрат S2238.
Тромбін та мезотромбін - це ферменти, яким притаманний автокаталіз за фізіологічних умов. Зокрема, а-тромбін автокаталітично перетворюється в в- та у-тромбін, які менш активні порівняно з а-тромбіном. Мезотромбін може автокаталітично перетворюватись на мезотромбін 1 та тромбін.
Отриманий нами препарат мезотромбіну був стабільним і навіть за високих концентрацій (0,3 мг/мл) за 20 хв в присутності Са2+ при температурі
І22
Корольова Д.С.
37°С лише 30% мезотромбіну автокаталітично перетворювалось в тромбін (рис. 5). Тому такий препарат мезотромбіну є придатним для дослідження особливостей функціонування проміжного продукту активації протромбіну в системі гемостазу.
ВЫВОДЫ
Розроблено двостадійну методику отримання препарату мезотромбіну з використанням іммобілізованого екамуліну. Отриманий препарат мезотромбіну володіє ферментативною активністю і є стабільним, що дозволяє використовувати його для дослідження функціонування системи зсідання крові в модельних системах.
Література
1. Волков Г.Л., Платонова Т.Н., Савчук О.Н., Горницкая О.В., Чернышенко Т.М., Краснобрижая Е.Н. Современные представления о системе гемостаза. -Киев: Наукова думка, 200. - 295 с.
2. Rosing J., Tans G. Meizothrombin, a major product of factor Xa-catalyzed prothrombin activation II Thrombosis and Haemostasis. - i988. - Vol. 60, No3. - P. 355-360.
3. Mann K.G., Butenas S., Brummel K. The Dynamics of Thrombin Formation II Arterioscler Thromb Vasc Biol. -2003. - Vol. 23. - Р. І7-25.
4. Cote H.C.F., Bajzar L., Stevens W.K., Samis J.A., Morser J., MacGillivray R.T.A., Nesheim M.E. Functional characterization of recombinant human meizothrombin and meizothrombin (desFi). Thrombomodulin-dependent activation of protein C and thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI), platlet aggregation, antithrombin-III inhibition II J. Biol. Chem. - i997.
- Vol. 272, Noi0. - P. 6І94-6200.
5. Han J.H., Cote H.C.F., Tollefsen D.M. Inhibition of meizothrombin(desFi) by heparin cofactor II II J. Biol. Chem. - І997. - Vol. 272, No45. - P. 28660-28665.
6. Cote H.C.F., Stevens W.K., Bajzar L., Banfield D.K, Nesheim M.E., MacGillivray R.T.A. Characterization of stable form of human meizothrombin derived from recombinant prothrombin (Ri55A, R27iA, and R284A) II J. Biol. Chem. - І994. - Vol. 269, Noi5. - P. ІІ374-ІІ380.
7. Doyle M.F., Mann K.G. Multiple active forms of thrombin IV. Relative activities of meizothrmbin II J. Biol. Chem. -І990. - Vol. 265, Noi8. - P. І0693-І070І.
8. Савчук О.М., Краснобрижа Є.М., Горчев В.Ф., Чернишенко Т.М., Гаврилюк С.П., Платонова Т.М. Процес комплексоутворення протромбіну та Е-фрагменту фібрину II Укр. біохім. журнал. - 2006.
- Т. 78, No3. - С. 99-І05.
9. Chernyshenko V., Korolova D.S. Echis multisquamatis
venom enzymes acting on haemostasis I Bridges in Life Sciences Second Annual Review of the Regional
Cooperation for Health, Science and Technology
Consortium, Загреб, 2008. - Р. 37.
10. Остерман Л.А. Методы исследования белков и
нуклкиновых кислот: Электрофорез и
ультрацентрифугирование (практическое пособие). -Москва: Наука, i98i. - 288 с.
11. Тривен М. Иммобилизованные ферменты. - пер. с англ.
- Москва: Мир, І983. - 2І3 с.
12. Соловьев Д.А., Платонова Т.Н., Угарова Т.П.
Выделение и характеристика экамулина - активатора протромбина из яда эфы многочешуйчатой (Echis Multisquamatus) II Биохимия. - І996. - Т. 6І, N6.
- С. І094-ІІ05.
ПОЛУЧЕНИЕ МЕЗОТРОМБИНА - ПРОМЕЖУТОЧНОГО ПРОДУКТА АКТИВАЦИИ ПРОТРОМБИНА Королева Д.С.
Разработан метод получения промежуточного продукта активации протромбина - мезотромбина. В основе метода лежит использование иммобилизованного активатора протромбина из яда эфы многочешуйчатой (Echis multisquamatis) - экамулина. Полученный таким способом препарат мезотромбина владеет ферментативной активностью и остается стабильным, поэтому может быть использованный для исследования молекулярных механизмов функционирования гемостаза.
Ключові слова:. мезотромбин, протромбин, экамулин.
PRODUCTION OF MEIZOTHROMBIN - PROTHROMBIN ACTIVATION INTERMEDIATE Korolova D.S.
Method of meizothrombin, prothrombin activation intermediate, production was developed. The method is based on usage of immobilized prothrombin activator from Echis multisquamatis venom - ecamulin. Meizothrombin obtained in such way is enzymaticly active and stable, therefore it can be used for research of the haemostasis molecular mechanism functioning.
Key words: meizothrombin, prothrombin, ecamulin.
