CC BY
38
УДК 577.151.083:615.917
ФІБРИНО(ГЕНО)ЛІТИЧНИЙ ЕНЗИМ З ОТРУТИ ЩИТОМОРДНИКА ДАЛЕКОСХІДНОГО (Agkistrodon blomhoffii ussuriensis): ОТРИМАННЯ, ЧАСТКОВА ХАРАКТЕРИСТИКА ТА ВПЛИВ НА АГРЕГАЦІЮ ТРОМБОЦИТІВ
В. Л. Карбовський 1
Т. М. Платонова2 1 Київський національний університет імені Тараса Шевченка
О. В. Горницька2
Г. Л. Волков 2 2 Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ
E-mail: VKarbovskyy@gmail.com
Описано метод отримання фібрино(гено)літичного ензиму з отрути Agkistrodon blomhoffii ussuriensis у три хроматографічні стадії. Одержаний ензим (бломулізин) — типовий представник одноланцюгових металопро-теїназ отрути змій з молекулярною масою 30 кДа, який високоефективно гідролізує Аа- та ВР-ланцюги фібриногену. у-Ланцюг фібриногену при цьому залишається інтактним. Показано, що в різних модельних системах in vitro бломулізин не впливає на агрегацію тромбоцитів, індуковану колагеном, але достовірно інгібує їх АДФ-та адреналінстимульовану агрегацію.
Ключові слова: фібрино(гено)літичний ензим, отрута змій, щитомордник, фібриноген, тромбоцити.
Отрута змій є складним комплексом біологічно активних глікопротеїнів та пептидів, значна частина яких впливає на ключові ланки системи гемостазу [1]. Серед великої кількості ензимів отрути особливий науковий і практичний інтерес становлять, зокрема, фібриногенолітичні ензими (фібриноге-нази), отримані з отрути різних видів змій. Такі протеїнази високоспецифічно гідролі-зують С-кінцеві ділянки молекули фібриногену, відщеплюючи від Аа-, В^-ланцюгів останнього фрагменти різної величини. У більшості випадків у результаті такого впливу формуються 250 кДа Х-фрагменти фібриногену, які не полімеризуються під дією тромбіну [2]. Антикоагуляційний ефект таких протеїназ підсилюється й тим, що значна частина цих ензимів впливає також на тромбоцитарну ланку системи гемостазу, інгібуючи агрегацію тромбоцитів [3-5]. Окрім того, деякі фібриногенолітичні ензими отрути змій, 80% з яких за своєю природою належать до класу металопро-теїназ (інші 20% — серинові протеїнази), не чутливі до присутності фізіологічних інгібіторів серинових протеїназ — серпінів у плазмі крові [6].
Усе вищезазначене відкриває широкі можливості для використання таких ензимів не лише під час вивчення процесів полімеризації фібриногену/фібрину, а й для профілактики та лікування тромботичних ускладнень. Вдалим прикладом практичного використання фібрино(гено)літичних ензимів у клінічній практиці є АШшергаве — рекомбінантна а-специфічна фібриногеназа, створена на основі металопротеїнази з отрути мокасинового щитомордника (Agkistrodon contortrix contortrix). Цей препарат, який успішно пройшов 2-гу фазу доклінічних досліджень, у разі інтраартеріального введення нормалізує кровотік у 40% пацієнтів з різними тромботичними ускладненнями [7-9].
Цільна отрута щитомордника далекосхідного (Agkistrodon blomhoffii ussuriensis), як типового представника родини Crota-lidae, має сильний фібрино(гено)літичний потенціал, що свідчить про присутність у цій отруті фібриногеназ, які можна було б використовувати для профілактики різноманітних серцево-судинних патологій.
Метою даної роботи було розроблення ефективного методу отримання фібриноге-нолітичного ензиму з отрути щитомордника
далекосхідного, його часткова характеристика та дослідження впливу на тромбоци-тарну ланку системи гемостазу.
Матеріали і методи
Кристалічну отруту щитомордника далекосхідного (Agkistrodon blomhoffii ussuriensis) отримували із серпентарію Трипільського біохімічного заводу.
Плазму крові одержували з крові донорів, які протягом кількох днів до проведення дослідження не приймали нестероїдних протизапальних препаратів, кофеїну та інших засобів, що порушують процеси агрегації тромбоцитів. Кров набирали з ліктьової вени натще в пластикову пробірку з 3,8%-м розчином лимоннокислого натрію у співвідношенні 9:1.
Плазму крові, збагачену тромбоцитами (ПЗТ), отримували центрифугуванням стабілізованої крові при 3GG g упродовж 5 хв при 18-21 °С.
Концентрацію протеїнів у розчині визначали за методом Бредфорд [1G].
Диск-електрофорез протеїнів у ПААГ з додаванням SDS проводили за методикою Laemli [11].
Фібриногенолітичну активність ензимів, виділених з отрути щитомордника далекосхідного, визначали якісно та кількісно. Якісну оцінку фібриногенолітичної активності ензимів визначали 30-хвилинною інкубацією останніх (1GG-2GG мкг) з 2GG мкг фібриногену бика та подальшим додаванням 2 NIH тромбіну. Активність оцінювали якісно за наявністю чи відсутністю фібрино-вого згустка. Кількісне визначення активності фібрино(гено)літичного ензиму проводили шляхом його інкубації з фібриногеном (2 мг/мл) протягом 2G хв при кімнатній температурі в 5G мМ Tris-HCl-буфері, рН 7,4, що містить G,13 М NaCl. Співвідношення фібриноген : ензим = 25G : 1. Через 2G хв інкубації додавали 2 NIH тромбіну, що є значним надлишком відносно кількості фібриногену в пробі. Фібриновий згусток, що утворився протягом декількох секунд, видаляли центрифугуванням. Абсорбцію надосадової рідини вимірювали на спектрофотометрі СФ-2б за довжини хвилі 28G нм. За одиницю активності приймали кількість частково розщепленого за 1 хв фібриногену на 1 мг ензиму, враховуючи, що E28G 1%-го розчину фібриногену становить 15,G67.
З метою вивчення дії на фібрино(гено)лі-тичний ензим інгібіторів протеїназ в описаній модельній системі для кількісного ви-
значення активності фібриногенази до розчину ензиму додавали інгібітори в кінцевій концентрації 20 мМ.
Фібринолітичну активність фібрино(ге-но)літичного ензиму оцінювали якісно за розщепленням попередньо утвореного фіб-ринового згустка.
Специфічність дії фібрино(гено)літично-го ензиму на фібриноген досліджували, аналізуючи продукти руйнування фібриногену після інкубації його (2 мг/мл) з ензимом у 0,05 М трис-НС1-буфері, рН 7,4, що містить 0,13 М NaCl, при кімнатній температурі. Аліквоти відбирали через 15, 60 хв та 2 год, реакцію зупиняли додаючи 0,2% SDS.
Агрегацію тромбоцитів у збагаченій тромбоцитами плазмі крові досліджували впродовж перших трьох годин після забору крові на агрегометрі АР2110 фірми «Солар», Білорусь. Як індуктори агрегації використовували АДФ 2,5 мкМ, адреналін 5 мкМ та колаген 0,2% («Технологія-Стандарт», Росія) у кінцевих концентраціях згідно з рекомендаціями фірми-виробника. Спочатку проводили скринінгову оцінку агрегації тромбоцитів донорів і в разі виявлення гіпо-агрегації плазму крові для подальших досліджень не використовували.
Для дослідження впливу фібрино(гено)-літичного ензиму на індуковану агрегацію тромбоцитів було створено таку модельну систему:
Контроль: до 400 мкл ПЗТ додавали 50 мкл 0,15 М розчину NaCl, інкубували 5 хв при 37 °С. Потім вносили 50 мкл індуктора (АДФ або адреналін) і впродовж 10 хв реєстрували процес агрегації тромбоцитів.
Модель з преінкубацією: до 400 мкл ПЗТ додавали 50 мкл досліджуваного протеїну, ретельно перемішували та інкубували протягом 20 хв при 37 °С. Потім вносили 50 мкл індуктора і впродовж 10 хв реєстрували процес агрегації тромбоцитів.
Отримані результати обробляли статистично в пакетах програм ORIGIN 7.0 та MICROSOFT EXСEL.
Результати та обговорення
Однією з основних вимог при розробленні методів отримання біологічно активних продуктів з будь-якого природного джерела (плазма крові, молоко, зміїна отрута) є послідовність процесу. У такому випадку протеїнова фракція, одержана на певному етапі хроматографічного очищення як додаткова, на наступному етапі стає основною. Такий підхід дозволяє отримувати з вихідної сиро-
вини більшу кількість ензимних препаратів за набагато нижчих затрат виробництва. У раніше розробленому нами методі одержання тромбіноподібного ензиму з отрути Agkistrodon blomhoffii ussuriensis високий фібрино(гено)літичний потенціал мала фракція протеїнів, які не зв’язалися з афінним сорбентом Blue Sepharose CL-6B [12]. Отриману фракцію після розведення 50 мМ TrisHCl-буфером з pH 8,0 було розфракціоновано ступінчастим градієнтом NaCl на слабкому аніонообміннику DEAE — Sepharose FF. Сильну фібриногенолітичну активність виявляв матеріал, який елюювався з аніоно-обмінника за іонної сили, що відповідала
0,2 М NaCl (рис. 1).
A28G» нм
NaCl, M
Кількість об’ємів колонки
Рис. 1. Хроматограма, отримана під час фракціонування не зв'язаного з Blue Sepharose CL-6B матеріалу на DEAE-Sepharose FF:
1 — протеїновий матеріал, що не зв’язався з носієм;
2 — фракція інгібітора агрегації тромбоцитів;
3 — фракція фосфоліпази А2;
4 — високомолекулярні домішки;
5 — фракція фібринолітичного ензиму;
6 — неспецифічно зв’язані домішки
Електрофоретичний аналіз відповідної фракції показав, що основними в ній є два протеїни з молекулярними масами 30 та 40 кДа (рис. 3.; трек 3). Наступним етапом очищення фібрино(гено)літичного ензиму було обрано метод гідрофобної хроматографії. Вибір цього методу зумовлений тим, що сорбція протеїнового матеріалу в такому разі проводиться за високої концентрації солі, тому потреби у зміні буфера при нанесенні зразка нема. Щоб забезпечити зв’язування, потрібно лише додати достатню кількість солі.
Гідрофобну хроматографію протеїнової фракції, яка містила фібрино(гено)літичний ензим, проводили на Phenyl Sepharose GL-
6В. Зв’язування протеїнового матеріалу фракції із сорбентом здійснювали в 50 мМ Тгів-НСІ-буфері, рН 8,0, що містив 1,8 М ^Н4)2804 та 0,2 М ЫаС1. Усі протеїни даної фракції в наведених умовах повністю сорбу-валися на зв’язаних з носієм гідрофобних групах. Елюцію матеріалу, що зв’язався, проводили ступінчастим градієнтом у тому самому буфері, знижуючи концентрацію солей. У результаті розділення було отримано три протеїнові фракції (рис. 2). Аналіз одержаних фракцій на здатність гідролізувати фібриноген показав, що така активність притаманна фракції, яка елюювалась із сорбенту за іонної сили, що відповідала 0,9 М ^Н4)2804. Електрофорез відповідного матеріалу в ПААГ виявив присутність однолан-цюгового протеїну з молекулярною масою 30 кДа, який у подальшому було названо бломулізином. Чистота отриманого ензиму становила 99% (рис. 3; трек 1). Вихід протеїну становив 10 мг з 1 г отрути. Питома активність одержаного ензиму дорівнювала 20 мкМ фібриногену/хв-мг протеїну й ефективно пригнічувалася ЕДТА, що дозволило нам віднести отриманий фібрино(гено)лі-тичний ензим до групи металопротеїназ. Бломулізин виявляв також фібринолітичну активність і не втрачав її під час ліофілізації і подальшого зберігання при -20 °С протягом 6 міс.
E28G, нм
(NH4)2SO4, M
Кількість об’ємів колонки
Рис. 2. Хроматограма, отримана під час фракціонування фракції фібрино(гено)літичного ензиму на Phenyl Sepharose CL-6B:
1 — фракція фібрино(гено)літичного ензиму;
2 — фракція активатора протеїну;
3 — неспецифічно зв’язані домішки
5
і V V
• \ 118
|т < - 8 5
L * її
_ -і 36
ш .---26
« 20
2 3 4
кДа
1
Рис. 3. Електрофореграма протеїнових фракцій, отриманих з Phenyl Sepharose CL-6B:
1 — фібрино(гено)літичний ензим;
2 — активатор протеїну С;
3 — вихідна протеїнова фракція отримана
з DEAE-Sepharose FF;
4 — маркери молекулярної маси
Визначаючи специфічність фібрино(гено)-літичного ензиму методом електрофоретичного аналізу продуктів гідролізу фібриногену, встановили, що під дією бломулізину в початковий період реакції руйнується Aa-лан-цюг фібриногену. За більш тривалої інкубації ензим також руйнує ВР-ланцюг, залишаючи інтактним у-ланцюг фібриногену (рис. 4).
Фрагменти гідролізу --Аа- та BP-ланцюгів '
ти
» і * -4 а 53
і-*
'щ sІ
4 3 2 і
.. Аа-ланцюг BP-ланцюг "у ланцюг
Дослідження впливу отриманого ензиму на тромбоцитарну ланку системи гемостазу показало, що бломулізин у кінцевій концентрації 250 нМ після 20 хв преінкубації з ПЗТ спричинював інгібування як первинної, так
і вторинної агрегації тромбоцитів, індукованої АДФ та адреналіном, достовірно змінюючи всі параметри агрегаційного процесу (ступінь, швидкість та час агрегації) і жодним чином не впливав на аналогічний процес у разі використання як індуктора 0,2%-го розчину колагену (рис. 5, табл. 1). Такий ефект фібрино(гено)літичного ензиму передусім опосередкований впливом останнього на фібриноген, який, як відомо, відіграє ключову роль в АДФ- та адреналініндуко-ваній тромбоцитарній агрегації. Розщеплюючи молекули фібриногену, бломулізин унеможливлює утворення тромбоцитарних агрегатів через формування фібриногенових містків між окремими тромбоцитами. Відсутність впливу фібрино(гено)літичного ензиму на агрегацію тромбоцитів у разі використання колагену як індуктора пояснюється тим, що в цьому процесі не бере участі фібриноген. Тромбоцити в даному випадку агрегують між собою за рахунок формування міжтромбоцитарних колагенових містків, опосередкованих а2в1-інтегриновим комплексом [13, 14].
Таким чином, одержаний з отрути щито-морника далекосхідного фібрино(гено)лі-тичний ензим є типовим представником одноланцюгових металопротеїназ з молекулярною масою 30 кДа, який високоефективно гідролізує Аа- та ВР-ланцюги фібриногену та різноспрямовано впливає на індуковану агрегацію тромбоцитів. Отриманий ензим може бути задіяний у процесі розроблення нових препаратів для діагностики та профілактики патологічних станів системи гемостазу.
Рис. 4. Електрофореграма зразків фібриногену, інкубованих з бломулізином:
1 — нативний фібриноген;
2, 3, 4 — продукти, утворені під час інкубації фібриногену з бломулізином впродовж 15, 60 хв та 2 год відповідно
Рис. 5. Агрегаційні криві, що відображають вплив 250 нМ фібрино(гено)літичного ензиму на АДФ-, адреналін- та колагеніндуковану агрегацію тромбоцитів:
1 — агрегація тромбоцитів у нормі (контроль);
2 — агрегація тромбоцитів після 20 хв преінкубації з фібрино(гено)літичним ензимом
Таблиця 1. Параметри процесу агрегації тромбоцитів у присутності 250 нМ бломулізину
Параметри агрегаційної кривої Індуктор — 2,5 мкМ АДФ (п = 15) Індуктор — 5 мкМ адреналін (п = 10) Індуктор — 0,2% колаген (п = 5)
Контроль Дослід Контроль Дослід Контроль Дослід
Ступінь агрегації, % 70,0 ± 4,56 22,6 ± 2,569* 64,0 ± 9,7 11,9 ± 3,23* 82,9 ± 4,53 77,1 ± 7,86
Час агрегації, с 407,3 ± 11,41 331,0 ± 22,58** 509,8 ± 51,5 279,0 ± 23,01** 388,3 ± 18,12 399,0 ± 47,5
Швидкість агрегації, % за хв 53,5 ± 4,34 22,4 ± 3,27* 10,6 ± 1,01 5,1 ± 1,86*** 21,2 ± 3,75 19,6 ± 4,12
Характер кривої Однофазна незворотна Зворотна з дезагрегацією Двофазна незворотна Зворотна з дезагрегацією Однофазна незворотна Однофазна незворотна
Примітка. * — р < 0,001; ** — р < 0,01; *** — р < 0,05 щодо контролю.
ЛІТЕРАТУРА
1. Marsh N. A brief history of snake venoms affecting hemostasis // Toxin Rev. — 2006. — V. 25. — P. 201-216.
2. Swenson S., Markland F. S. Jr. Snake venom fib-rin(ogen)olytic enzymes // Toxicon. — 2005. — V. 45. — P. 1021-1039.
3. Bello C. A., Hermogenes A. L., Magalhaes A. Isolation and biochemical characterization of a fibrinolytic proteinase from Bothrops leucurus (white-tailed jararaca) snake venom // Biochimie. — 2005. — V. 88. — P. 189-200.
4. Siigur J, Samel M, Tonismagi K. Biochemical characterization of Lebetase, a direct-acting fibrinolytic enzyme from Vipera lebetina snake venom // Thromb. Res. — 1998. — V. 90. — P. 39-49.
5. Wang Q, Chen J., Liang X. et al. Hemorrhagic activity and mechanism of FIIa a fibrinolytic enzyme from Agkistrodon acutus venom // Acta. Pharmacol. Sin. — 2004. — V. 25, N 4. — P. 514-521.
6. Markland F. S. Jr. Snake Venom Fibrinogenolytic and Fibrinolytic Enzymes: An Updated Inventory // Thromb. Haemost. — 1998. — V. 79. — P. 668-674.
7. Swenson S., Toombs C. F., Pena L. et al. a-Fibri-nogenases // Cur. Drug Targ. — Cardiovasc. Haematol. Disord. — 2004. — V. 4. — P. 417-435.
ФИБРИНО(ГЕНО)ЛИТИЧЕСКИЙ ЭНЗИМ ИЗ ЯДА ЩИТОМОРДНИКА ДАЛЬНЕВОСТОЧНОГО (Agkistrodon blomhoffii ussuriensis): ПОЛУЧЕНИЕ, ЧАСТИЧНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ВЛИЯНИЕ НА АГРЕГАЦИЮ ТРОМБОЦИТОВ
В. Л. Карбовский1, Т. Н. Платонова2,
О. В. Горницкая2, Г. Л. Волков2
1 Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко
2 Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев
E-mail: VKarbovskyy@gmail.com
Описан метод получения фибрино(гено)ли-тического энзима из яда Agkistrodon blomhoffii ussuriensis в три хроматографические стадии. Полученный энзим (бломулизин) — типичный представитель одноцепочечных металлопроте-иназ с молекулярной массой 30 кДа, который высокоэффективно расщепляет Аа- и Вв-цепи фибриногена. у-Цепь фибриногена при этом остается интактной. Показано, что в различных модельных системах in vitro бломулизин не влияет на агрегацию тромбоцитов, индуцированную коллагеном, но достоверно ингибирует их АДФ- и адреналинстимулированную агрегацию.
Ключевые слова: фибрино(гено)литический энзим, змеиный яд, щитомордник, фибриноген, тромбоциты.
8. Toombs C. F, Deitcher S. R. Nonclinical and clinical characterization of a novel acting thrombolytic: Alfimeprase // Toxin Rev. — 2006. — V. 25. -P.375-388.
9. Swenson S. and Markland F. S. Fibrolase // Ibid. — 2006. — V. 25. — P. 347-374.
10. Bradford M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. — 1976. — V. 78, N 2. — P. 248-254.
11. Laemli K. U. Cleavage of structure proteins during assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. — 1970. — V. 227. — P. 680-685.
12. International patent №: WO/2008/020739. Method for purification of a-specific thrombin like enzyme from Agkistrodon blomhoffi ussuriensis snake venom / Volkov G. L., Savchuk A. N., Karbovskyy V. L. — from 21 February 2008.
13. Eble J. A. Collagen-binding integrins as pharmaceutical targets // Curr. Pharmaceut. Design. — 2005. — V. 11. — P. 867-880.
14. Farndale R. W. Collagen-induced platelet activation // Blood Cells, Mol. Dis. — 2006. — V. 36. — P. 162-165.
FIBRINO(GENO)LYTIC ENZYME FROM Agkistrodon blomhoffii ussuriensis SNAKE VENOM: ISOLATION, PARTIAL CHARACTERIZATION AND INFLUENCE ON PLATELETS AGGREGATION
V. L. Karbovskiy1, T. M. Platonova2,
O. V. Gornitska2, G. L. Volkov2
1 National Taras Shevchenko University, Kyiv 2Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: VKarbovskyy@gmail.com
Fibrino(geno)lytic enzyme — «Blomulyse» from Agkistrodon blomhoffii ussuriensis venom has been isolated in three chromatography steps. The purified enzyme is a typical single-chain metalloproteinase with molecular weight of approximately 30 kDa. Obtained enzyme hydrolyzed with high-efficiency the Aa-chain of fibrinogen followed by the BP-chain and showed no effect on the y-chain.
Using different model systems in vitro we indicated that fibrolyse has no effect on the platelets aggregation stimulated by collagen, but on the other hand it inhibited ADP- and adrenalin-induced platelet aggregation.
Key words: fibrino(geno)lytic enzyme, snake venom, Agkistrodon, fibrinogen, platelets.
