CC BY
30
УДК 616-005.6: 547.466: 546.221 Н.В. Заічко
БІОХІМІЧНІ МЕХАНІЗМИ ФОРМУВАННЯ ТРОМБОФІЛІЇ, ІНДУКОВАНОЇ ХРОНІЧНИМ НАВАНТАЖЕННЯМ ТІОЛАКТОНОМ ГОМОЦИСТЕЇНУ ТА ЙОГО КОМБІНАЦІЄЮ З Ь^АМЕ. КОРЕКЦІЯ ВІТАМІННО-МІКРОЕЛЕМЕНТНИМ КОМПЛЕКСОМ
Науково-дослідний інститут реабілітації інвалідів Вінницького національного медичного
університету ім. М.І.Пирогова (м. Вінниця)
Робота виконана в рамках планової НДР “Обмін гомоцистеїну в умовах дії нутрієнт-них чинників та при різних патологічних станах”, № держреєстрації 0106Ш05134.
Вступ. Гіпергомоцистеїнемія (ГГЦ) є відомим фактором ризику серцево-судинних захворювань та тромботичних ускладнень. Механізми впливу ГГЦ на систему гемостазу різноманітні і реалізуються через оксидатив-ний стрес, порушення синтезу факторів гемо-коагуляції та фібринолізу, гальмування продукції оксиду азоту (NO) тощо [12].
Нещодавно були відкриті нові, невідомі раніше аспекти обміну гомоцистеїну (ГЦ). Виявилось, що в процесі деградації ГЦ шляхом транссульфування утворюється біологічно-активна молекула гідроген сульфід Щ^) [19]. За даними літератури і результатами наших досліджень, H2S причетний до регуляції судинного тонусу [19] та агрегації тромбоцитів [5, 6], і, очевидно, є синергістом NO. Ймовірно, що зниження рівня H2S в плазмі крові буде негативного відображатись на системі гемостазу та підвищувати ризик формування тромбофілії, як це, наприклад, спостерігається в умовах інгібування синтезу NO [18]. Раніше ми показали, що двотижневе введення тіолактону ГЦ щурам викликало зниження рівня H2S в плазмі крові, яке корелювало з посиленням агрегації тромбоцитів [6].
Метою даної роботі було на основі комплексної оцінки стану системи гемостазу та фібринолізу за умов тривалого навантаження тіолактоном ГЦ (тГЦ) та його поєднання з введенням неселективного інгібітору NO-синтази L-NAME ідентифікувати ті ланки, які в найбільшій мірі реагують на токсичний вплив високих рівнів ГЦ та дефіцит вазоак-тивних молекул H2S та NO. Ми також оцінили в якій мірі препарати з гіпогомоцисте-їнемічної дією (вітамінно-мікроелементний комплекс) здатні усувати порушення в різних ланках системи гемостазу за даних умов.
Об'єкт і методи дослідження. Досліди проведені на 60 білих безпородних щурах-самцях масою 250-270 г. Під час експерименту тварини отримували стандартний напівсинтетичний крохмально-казеїновий раціон [13]. Щурі були розділені на 5 груп по 12 тварин в кожній. Групу контролю (№1) склали 12 інтактних щурів, яким 1 раз на добу ін-трагастрально вводили 1% розчин крохмалю в кількості 1 мл на 100 г маси тіла. Навантаження тГЦ проводили щурам груп №2 та №3, навантаження тГЦ в комбінації з неселек-тивними інгібітором NO-синтази - L-NAME (метиловий ефір L-Nra-нітроаргініну) проводили щурам груп № 4 та №5. тГЦ та L-NAME вводили інтрагастрально в дозах 100 мг/кг та 30 мг/кг, відповідно, 1 раз на добу на 1% розчині крохмалю протягом 28 діб. Щурам груп №3 та №5 до базової дієти протягом всього терміну експерименту додавали ВМК в кількості, що забезпечувала б надходження біля 714 мкг вітаміну В6, 143 мкг вітаміну В, 14,3 мкг вітаміну В12, 1 мг іонів цинку (Zn^+), 7,5 мкг іонів хрому (Cr3+) та 0,93 мкг іонів ванадію (V5+) на 1 кг маси тіла тварин. Обрані дози вітамінів виявляють максимальний гіпогомоцистеїнемічний ефект [1]. Досліди виконували згідно правил гуманного відношення до експериментальних тварин, затверджених комітетом з біоетики ВНМУ ім. М.І.Пирогова.
Забір крові для досліджень проводили з серця тварин в пластикові пробірки Vacuette (Greiner Bio-One, Австрія): з 3,8% розчином цитрату натрію (у співвідношенні 9:1) чи К2ЕДТА. Перед забором крові щурів анестезували кетаміном (100 мг/кг маси тіла інтра-перітонеально). З експерименту тварин виводили шляхом дислокації шийних хребців.
Багату та бідну тромбоцитами плазму крові отримували звичайними методами. Визначали активований частковий тромбопласти-новий час (AЧTЧ), протромбіновий час (ПЧ) та протромбіновий індекс (ПТІ), тромбіно-
вий час (ТЧ). Вміст фібриногену визначали спектрофотометричним методом [2]. Вміст розчинних фібрин-мономерних комплексів (РФМК) визначали у паракоагуляційному тесті з використанням фосфатних буферів. Функціонально неактивні форми протромбіну визначали в тесті екамуліновий час (ЕЧ). Екамулін (ензим з отрути середньоазіатської ефи багатолускової Echis multisquamatus), на відміну від тромбопластину, перетворює в тромбін не лише функціонально активний протромбін, а і його неактивні форми - пре-тромбін та декарбоксильований протромбін [9]. В пробірку вносили 0,1 мл 0,025М розчину СаС12, 0,1 мл розчину препарату ека-муліну, 0,1 мл бідної тромбоцитами плазми крові, інкубували при 37оС, постійно струшуючи, реєстрували час утворення фібрино-вого згортку, розраховували екамуліновий індекс: ЕІ = (ЕЧ /ЕЧ . )*100% та спів-
^ v контроль дослід7
ставляли його з ПТІ. За присутності в плазмі крові функціонально неактивних форм протромбіну ЕІ перевищує ПТІ.
Систему протизсідання крові оцінювали за амідолітичною активністю антитромбіну ІІІ (АТ ІІІ) та протеїну С (ПрС). Систему фібринолізу оцінювали за часом лізису еуглобулінів та вмістом ПАІ-1 (інгібітору активатору плазміногену 1), який визначали імуноферментним методом за набором Zy-mutest Rat - PAI-1 (Antigen), Франція.
Агрегацію тромбоцитів досліджували у зразках багатої тромбоцитами плазми крові на фотооптичному агрегометрі АР2110 (“Солар”, Білорусь), в якості індуктору агрегації використовували АДФ. Морфофізіологічні параметри тромбоцитів визначали на гематологічному аналізаторі Erma PCE-210 (Японія). Реєстрували кількість тромбоцитів, середній об’єм тромбоцитів (MPV, фл), ширину розподілу тромбоцитів по об’єму (PDW, %) та тромбокрит (PCT, %). Активність простагландин-ендопероксид синтази (PGH-синтази, КФ 1.14.99.1) в тромбоцитах визначали спектрофотометричним методом за накопиченням окисненої форми
донору електронів адреналіну [10]. Вміст протеїну визначали за Лоурі [20].
Загальний рівень ГЦ визначали імунофер-ментним методом за набором “Homocysteine EIA” фірми “Axis-Shield”, Англія. Вміст H2S в плазмі крові визначали як описано [3]. Вміст SН-груп протеїнів визначали за реакцією з реактивом Елмана. Вміст цистеїну визначали за реакцією з нінгідрином у кислому середовищі [16]. Суму нітритів та нітратів в плазмі крові визначали за реакцією Грісса
[8]. Вміст малонового діальдегіду (МДА) визначали за реакцією з тіобарбітуровою кислотою [4], а карбонільних груп протеїнів -за реакцією з 2,4-динітрофенілгідразином
[9]. Фосфоліпідні фракції плазми крові -фосфатидилхолін (ФХ), лізофосфатидилхолін (ЛФХ), фосфатидилетаноламін (ФЕА) визначали методом тонкошарової хроматографії на силікагелі Л5/40, кількісну оцінку проводили після хроматографії за реакцією з фосфорнованіліновим реактивом. Загальний вміст фосфоліпідів оцінювали екстракційно-фотометричним методом [11].
Статистичну обробку результатів проводили за допомогою стандартних статистичних програм “MS Exel XP”. Вірогідність відмінностей оцінювали за t-критерієм Стьюдента.
В роботі використані L-цистеїн, L-NAME, реактив Елмана фірми Sigma (США), ті-олактон D,L-гомоцистеїну фірми Fluka (Німеччина), набори “Техпластин-тест”, “АПТВ-ЕІ-тест”, “Тромботест”, “ХромоТех-Антитромбин”, “АДФ” фірми Технологія-Стандарт (Росія) та “Реахром-Протеин С” фірми НПО РЕНАМ (Росія). Препарат екамуліну люб’язно наданий співробітниками відділу структури та функції білка Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАНУ.
Результати досліджень та їх обговорення. Встановлено, що навантаження тГЦ викликало активацію системи зсідання крові: ПЧ, АЧТЧ та ТЧ скоротились на 11,2, 16,6 та 18,6%, рівень фібриногену підвищився на 17,0%, з’явились РФМК (табл.І).
Таблиця І
Вплив хронічного навантаження тіолактоном ГЦ, його поєднання з Ь^АМЕ та корекції ВМК на показники систем зсідання, протизсідання крові та фібринолізу у щурів (М±т,
п=8-12)
Показник Групи щурів
1 2 3 4 5
Контроль ГГЦ ГГЦ+ВМК ГГЦ+ L-NAME ГГЦ+ L-NAME+ ВМК
ПЧ, с 17,8±0,37 15,8±0,35* 17,7±0,58# 14,7±0,31*§ 16,1±0,58*#
АЧТЧ, с 34,9±0,99 29,1±1,59* 33,3±1,14*# 24,6±1,29*§ 30,2±1,15*#
ТЧ, с 10,2±0,29 8,3±0,27* 9,6±0,29*# 7,6±0,17*§ 8,7±0,32*#
ПТІ, % 101±1,89 114±2,26* 102±3,59# 123±2,46*§ 113±4,47*#
ЕІ, % 101±0,46 125±4,59* 109+2,92*# 130+3,33* 117+4,28*#
Фібриноген, г/л 2,88±0,15 3,36±0,15* 3,03+0,05# 3,81+0,12* 3,40+0,07*#
РФМК, мг/л 0 41,5±3,95* 23,0+4,48*# 52,5+5,23* 30,0+3,33*#
АТ ІІІ, % 104,0±1,93 90,1+2,11* 99,6+2,02# 88,9+2,16* 99,4+2,05#
ПрС, % 100,3±1,45 85,4±2,78* 97,5+2,37# 76,2+2,86*§ 94,8+2,34#
Час лізису еуглобулінів, хв 108±2,71 130+4,11* 118+3,12*# 141+3,58* 123+4,22*#
ПАІ-1, нг/мл 1,49±0,17 2,54+0,20* 2,06+0,12*# 3,56+0,12*§ 2,16+0,11*#
Примітка: * - р<0,05 - відносно групи контролю; # — р<0,05 - відносно попередньої групи; § - р<0,05 - між групами №2 та №4.
Гіперфібриногенемія є визнаним фактором ризику тромбофілії, а накопичення РФМК в плазмі крові вказує на глибокі порушення в регуляції системи гемостазу та розвиток тромбінемії [15]. Навантаження тГЦ викликало появу в плазмі крові функціонально неактивних форм протромбіну, на що вказує більш значне зростання ЕІ, ніж ПТІ-на 23,8% проти 13,9%. Як відомо, до функціонально неактивних форм протромбіну відноситься декарбоксильований протромбін та претромбін 1 [15]. Декарбоксильований протромбін утворюється в печінці при порушенні у-карбоксилювання на тлі дефіциту вітаміну К чи прийому його антагоністів. Пре-тромбін 1 утворюється в кровоносному руслі в результаті гідролізу протромбіну (в положенні А^155^ег156) тромбіном. Ймовірною причиною зростання ЕІ при навантаженні тГЦ є накопичення в плазмі крові претром-біну 1, що вказує на порушення балансу між про- та антикоагулянтною системами і є однією з ознак тромбінемії. Введення L-NAME
посилювало вплив тГЦ на систему зсідання крові, що підтвержується більш значним скороченням ПЧ, АЧТЧ та ТЧ, вищим рівнем фібриногену та РФМК.
Навантаження тГЦ викликало зниження активності фізіологічних інгібіторів зсідання крові - АТІІІ (на 13,5%) і ПрС (на 14,6%), а також зменшувало фібринолітичну активність, на що вказує зростання часу лізису еуглобу-лінів (на 20,8%) та вмісту антигену ПАІ-1 (на 70,5%). Введення L-NAME посилювало негативний вплив тіолактону ГЦ на інгібітори зсідання крові та систему фібринолізу, причому більш чутливими до цієї комбінації виявились ПрС та ПАІ-1.
Навантаження тГЦ викликало розвиток гіперреактивності тромбоцитів): підвищились МРУ, ступінь та швидкість ADP-індукованої агрегації, а також активність тромбоцитарної PGH-синтази (табл.2). Введення L-NAME потенціювало негативний вплив тГЦ на морфофункціональ-ний стан тромбоцитів.
Таблиця 2
Вплив хронічного навантаження тіолактоном ГЦ, його поєднання з Ь^АМЕ та корекції ВМК на показники тромбоцитарної ланки системи гемостазу у щурів (М±т, п=8-12)
Групи щурів
Показник 1 2 3 4 5
Контроль ГГЦ ГГЦ+ ВМК ГГЦ+ Ь^АМЕ ГГЦ+ L-NAME+ ВМК
Тромбоцити, х109/л 464+21,1 466+13,7 454+20,4 464+22,2 453+20,2
МРУ, фл 6,54+0,14 7,57+0,13* 6,93+0,27# 8,09+0,23* 7,23+0,27*#
РСТ, % 0,302+0,11 0,353+0,11* 0,313+0,16 0,371+0,13* 0,328+0,17#
PDW, % 9,66+0,17 9,77+0,31 9,56+0,25 10,2+0,27 9,56+0,25
Ступінь агрегації, % 21,8+1,37 42,4+3,12* 30,6+1,57*# 57,7+3,76*§ 33,5+1,57*#
Швидкість агрегації, % за 1 хв. 23,2+1,49 37,5+2,76* 28,2+1,45*# 41,6+2,71* 29,7+1,39*#
Час агрегації, с 359+23 386+28 335+17 450+29* 352+15
PGH-синтаза, мкмоль/хв на 1 мг білка 9,53+0,66 14,7+0,76* 12,4+0,50*# 15,1 + 1,05* 13,4+0,57*#
Примітка: *-р<0,05 - відносно групи контролю; #—р<0,05 - відносно попередньої групи; §- р<0,05 - між групами №2 та №4.
Застосування ВМК ефективно стримувало формуваня ГГЦ-індукованої тромбофілії: зменшувало дисбаланс між про- та антико-агулянтною ланками, відновлювало активність фібринолітичної системи, запобігало формуванню гіперреактивності тромбоцитів.
ВМК також позитивно впливало на стан сис-
Таблиця 3
Вплив хронічного навантаження тіолактоном ГЦ, його поєднання з Ь^АМЕ та корекції ВМК на біохімічні показники в плазмі крові щурів (М±т, п=8-12)
теми гемостазу при поєднанні навантаження тГЦ з введенням L-NAME.
На наступному етапі роботи ми оцінили, які метаболічні зміни виникають за умов навантаження тГЦ та його поєднання з L-NAME (табл.3).
Показник Групи щурів
1 2 3 4 5
Контроль ГГЦ ГГЦ+ВМК ГГЦ+ Ь^АМЕ ГГЦ+ Ь^АМЕ+ ВМК
Загальний ГЦ, мкмоль/л 6,54+0,23 15,3+0,84* 9,71+0,67*# 18,0+0,93*§ 10,1+0,67*#
Н2Я, мкмоль/л 78,3+6,45 51,7+4,80* 69,2+3,20*# 45,5+4,92* 61,4+3,13*#
ГЦ/^Я 0,09+0,01 0,34+0,06* 0,14+0,01*# 0,45+0,08*# 0,17+0,02*#
Загальний цистеїн, мкмоль/л 124,4+6,83 97,4+4,21* 110,5+3,40# 89,2+3,67* 101,7+3,33*#
Непротеїновий цистеїн, мкмоль/л 41,8+2,08 34,2+1,90* 38,6+2,19# 33,0+1,43* 37,3+2,23
Протеїнзв’язаний цистеїн, мкмоль/л 82,7+5,26 63,3+4,95* 71,9+2,57 56,2+3,36* 64,4+4,67*
ЯН-групи протеїнів, ммоль/л 8,38+0,36 6,74+0,41* 7,93+0,37# 5,66+0,25* 7,15+0,40*#
Нітрати та нітрити, мкмоль/л 53,7+3,02 37,0+2,97* 51,6+4,51# 22,0+1,95*§ 38,3+2,25*#
Карбонільні групи, нмоль/ мг протеїну 0,76+0,03 1,04+0,08* 0,85+0,05# 1,14+0,06* 0,94+0,08*#
МДА, мкмоль/л 10,3+0,81 13,4+0,71* 11,9+0,55# 13,9+0,86* 12,3+0,51*#
ФХ, мг/л 1648+83,5 1337+82,7* 1511+48,7 1207+63,5* 1415+46,4*#
ЛФХ, мг/л 58,8+3,10 75,7+7,43* 54,6+3,07# 87,7+5,26* 71,6+4,40*
ФЕА, мг/л 725+22,9 1095+52,0* 797+38,1# 1159+56,8* 960+42,2*#
ФХ/ЛФХ 28,9+2,35 18,6+2,17* 28,2+1,34# 14,6+1,69* 20,2+0,85*#
ФХ / ФЕА 2,32+0,18 1,24+0,09* 1,94+0,13# 1,06+0,08* 1,50+0,08*#
Примітка: *-р<0,05 - відносно групи контролю; #—р<0,05 - відносно попередньої групи; §- р<0,05 - між групами №2 та №4.
Введення тГЦ викликало підвищення рівня ГЦ в плазмі крові на 134%, при цьому реєструвалось зниження вмісту молекул з ва-зодилятаторними та антиагрегантними властивостями: загальний вміст нітратів та нітритів (метаболітів N0) зменшився на 31,1%, а вміст Н^ - на 34,0%. Введення L-NAME не лише значно зменшувало (на 59,%) рівень метаболітів N0 в плазмі крові у щурів з ГГЦ, як і очікувалось, а й посилювало негативний вплив тГЦ на обмін сірковмісних амінокислот. Так, рівень ГЦ підвищився на 175%, зниження вмісту Н^ становило 42%. Негативний вплив ГГЦ і, особливо, ії комбінації з L-NAME на рівень Н^ більш чітко відобразив коефіцієнт ГЦ/Н2!3: якщо в контролі цей показник становив 0,08 - 0,1, то у щурів з ГГЦ він збільшувався до 0,3 - 0,4 (майже в 4 рази),
а у щурів з комбінованим навантаження тГЦ та L-NAME - до 0,4 - 0,5 (в 5 разів).
За умов ГГЦ виникало зниження (на 21,7%) загального вмісту цистеїну в плазмі крові, при цьому непротеїнова фракція зменшилась на 18,2%, а протеїнзв’язана - на 23,6%. Як відомо, ГЦ та, особливо, його тіо-лактон легко приєднуються до протеїнів за ті-оловими залишками ^-гомоцистеїнування), а також утворюють дисульфіди з цистеїном та іншими тіолами [12]. ГЦ витісняє цистеїн зі змішаних дисульфідів типу «протеїн^-S-цистеїн» та інкорпорується на його місце, утворюючі дисульфіди типу «протеїн^^-ГЦ» [21]. Витіснений з протеїнів цистеїн, очевидно, швидко утилізується, що і обумовлює зниження його вмісту в крові. До деякої міри
цей механізм підтверджується зниженням (на 19,6%) рівня протеїнових SH-груп.
Здатність високих рівнів ГЦ ініціювати оксидативний стрес є відомою. Так і в нашому дослідженні ми спостерігали підвищення в плазмі крові тварин з ГГЦ вмісту маркерів окиснювального пошкодження протеїнів та ліпідів: рівень карбонільних груп протеїнів, МДА та ЛФХ збільшився на 36,8, 30,0 та 29,0%, а коефіцієнт ФХ / ЛФХ знизився на 35,6%. При поєднанні навантаження тГЦ з введенням L-NAME, який за деякими даними має антиоксиданті властивості [14], виявлені порушення зберігались.
Одним із найбільш загрозливих метаболічних порушень за умов ГГЦ є розвиток гіпоме-тилування, що негативно відображається на експресії генів, синтезі протеїнів, фосфоліпі-дів, адреналіну та інших процесах. Тривале навантаження тГЦ порушувало процеси метилування, на що вказують зміни у фосфо-ліпідному спектрі плазми крові: зниження (на 18,9%) вмісту ФХ, підвищення (на 51,0%) вмісту ФЕА та зменшення (на 46,6%) коефіцієнту Фх / ФЕА. При введенні L-NAME ознаки гіпометилування посилювались.
Збагачення раціону тварин ВМК протягом всього терміну експерименту ефективно запобігало розвитку метаболічних порушень, індукованих навантаженням тГЦ: зменшувало ступінь ГГЦ, дефіцит Н^ та ознаки оксидативного стресу, нормалізувало вміст фракцій фосфоліпідів, метаболітів N0 та цистеїну. Застосування ВМК також достовірно зменшувало негативні зміни цих показників при комбінованому навантаженні тГЦ та L-NAME.
Отже, за умов тіолактонової ГГЦ та її поєднання з L-NAME з одного боку формується дисбаланс в системі гемостазу, а з іншого боку - значні метаболічні порушення (дефіцит ва-зоактивних молекул, оксидативний стрес, гіпометилування). Кореляційний аналіз показав, що між показниками системи гемостазу та порушеннями обміну сірковмісних амінокислот існують тісні взаємозв’язки. За фізіологічних умов з рівнем ГЦ достовірно корелювали лише показники морфофункці-онального стану тромбоцитів-ступінь агрегації та МРУ (г= 0,56 та 0,55), тоді як за ГГЦ зв’язки встановлювались з більшістю показників. Найбільш тісно високі рівні ГЦ корелювали з ЕІ (г= 0,54), активністю фізіологічних антикоагулянтів АТІІІ та ПрС (г= -0,63 та -0,77), вмістом антигену ПАІ-1 (г= 0,67), ступенем агрегації тромбоцитів та МРУ (г=
0,64 та 0,67). Тобто, мішенями для токсичної дії високих рівнів ГЦ переважно були ключові регулятори тромбоутворення - тромбін, ПрС, АТІІІ, ПАІ-1 та тромбоцити.
Кореляційний аналіз засвідчив, що найбільш чутливими до дефіциту вазоактивних молекул Н2Я та N0 виявились ПрС, фібрино-літична система та тромбоцити. На це вказує і той факт, що при збільшенні дефіциту N0 та Н2Я на тлі комбінування ГГЦ з Ь^АМЕ виявлені зв’язки посилювались.
Індуковане навантаженням тГЦ зниження активності інгібіторів зсідання крові може пояснюватись посиленням їхнього споживання в умовах тромбінемії. Однак, не виключений прямий токсичний вплив ГЦ на АТ ІІІ та ПрС, в тому числі і інкорпорація ГЦ чи його тіолактону в їхні молекули (Я- чи ^гомоцистеїнування). На користь цієї гіпотези свідчить виявлена нами здатність навантаження тГЦ зменшувати кількість протеїнзв’язного цистеїну та ЯН-груп протеїнів в плазмі крові, а також вірогідний кореляційний зв’язок між цими показниками та рівнем ГЦ (г=-0,79 та -0,49, відповідно). Як відомо, ковалентна модифікація кардинально змінює властивості протеїнів, в тому числі і системи гемостазу. Зокрема, АТІІІ втрачав свою антикоагулянтну активність після інкубації з тГЦ [17]. Негативний вплив ГЦ на фібринолітичну систему скоріше реалізується на рівні експресії генів, на що вказує зниження рівня антигену ПАІ-1 в плазмі крові.
Виявилось, що показник МРУ достовірно корелює з коєфіцієнтом ФХ / ФЕА (г=-0,59) та вмістом ЛФХ (г=-0,71) в плазмі крові. Порушення фосфоліпідного спектру плазми крові до деякої міри відображають пертурбації фосфоліпідного складу мембран клітин крові. Тому, ймовірно, що підвищення МРУ асоціюється з порушенням фосфолі-підного складу тромбоцитарних мембран. Підвищення кількості неметильованих та негативнозаряджених фосфоліпідів в мембранах тромбоцитів призведе до зміни поверхневого заряду, збільшення адсорбції Са2+ та факторів зсідання крові на поверхні цих клітин та посилення агрегаційної активності.
Ще одним фактором, який може посилювати дестабілізацію тромбоцитарних мембран за умов ГГЦ є дефіцит Н2Я. Як відомо, Н2Я має потужні антиоксидантні властивості і здатний перешкоджати окислювальній деструкції протеїнів та ліпідів, в тому числі і в тромбоцитах, а значить інгібувати утворення проагрегантів (тромбоксану А2 та арахідонової кислоти). Виявилось, що активність PGH-синтази тромбоцитів корелювала з рівнем ГЦ (г=0,47) та коефіцієнтом ГЦ / Н2Я (г=0,40), при чому при навантаженні тГЦ ця залежність посилювалась (г=0,86 та 0,66). Також за ГГЦ виявлявся тісний зв’язок активності
PGH-синтази з маркерами окиснювальної деструкції ліпідів МДА та ЛФХ (г=0,86 та 0,70).
Таким чином, комплесна оцінка стану системи гемостазу дозволила виявити нові патерни формування тромбофілії, асоційованої з порушеннями обміну ГЦ, і зокрема, висвітлити роль дефіциту вазоактивних молекул Н2Я та N0 у розвитку порушень не лише в тромбоцитарній ланці, а й на рівні коагулянтної, антикоагулянтної та фібрино-літичної систем. Здатність ВМК зменшувати негативний вплив ГГЦ на систему гемостазу пояснюється не лише його відомою гіпого-моцистеїнемічною дією [1], а й відновленням рівня вазоактивних молекул Н2Я та N0 в плазмі крові і нормалізацією процесів метилування.
Висновки
1. Навантаження тГЦ викликає розвиток дисбалансу в системі гемостазу, який проявляється гіперреактивністю тромбоцитів, розвитком тромбінемії, накопиченням функціонально неактивних форм протромбіну, гіперфібриногенемією, зменшенням активності АТІІІ та ПрС, зниженням рівня антигену ПАІ-1 в плазмі крові. Введення Ь^АМЕ посилює негативний вплив ГГЦ на систему гемостазу.
2. За умов ГГЦ формується дефіцит вазоактивних молекул Н2Я та N0, який значно посилюється при введенні Ь^АМЕ. Зниження рівня Н2Я та N0 відображається не лише на функціональному стані тромбоцитів, а й поглиблює порушення в коагу-лянтній, антикоагулянтній та фібринолі-тичній системах.
3. Насичення організму щурів ВМК пом’якшує метаболічні порушення, індуковані навантаженням тГЦ: підвищує вміст Н2Я та метаболітів N0 в плазмі крові, зменшує ознаки оксидативного стресу, нормалізує фосфоліпідний спектр плазми крові, і, таким чином, стримує формування ГГЦ-індукованих порушень в системі гемостазу.
Перспективи подальших досліджень полягають в розкритті молекулярних механізмів впливу Н2Я на рецепторні протеїни та ензимні системи тромбоцитів, коагулянтну, антикоагулянтну та фібринолітичну системи, що дозволить поглибити розуміння шляхів формування метаболічних тромбофілій та оптимізувати підходи до їх корекції модуляторами обміну сірковмісних амінокислот.
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
1. Артемчук М.А. Профілактично-лікувальна дія вітамінних та вітамінно-мікроелементних препаратів за гострої та хронічної метіонінової гіпергомоцистеїнемії / М.А. Ар-
темчук // Biomedical and Biosocial Anthopology. - 2006. -№7. - С.17-20.
2. Беліцер В. О. Кількісне визначення фібриногену в плазмі крові людини / В. О. Беліцер, Т. В. Варецька, К. М. Веремєєнко // Лаб. діагностика. - 1997. -№2. - С.53-57.
3. Визначення вмісту гідроген сульфіду в плазмі крові / Н.
B. Заічко, Н. О. Пентюк, Л. О. Пентюк [та ін.] // Вісник наукових досліджень. - 2009. - №1. - С.29-32.
4. Владимиров Ю. А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю. А. Владимиров, А. И. Арчаков. - М.: Наука, 1972. - 252 с.
5. Заічко Н. В. Асоціація середнього об’єму тромбоцитів з рівнем гомоцистеїну та гідроген сульфіду в крові щурів з гіпергомоцистеїнемією / Н. В. Заічко // Медична хімія. -2008. - Т. 10, № 2. - С. 54-58.
6. Заічко Н. В. Вплив аніонів гідросульфіду, дитіоніту, сульфіту, тіосульфату та сульфату на агрегацію тромбоцитів людини / Н. В. Заічко, О. О. Пентюк // Укр. біохім. журн. - 2009. - т.81, №1. - С.105-113.
7. Заічко Н. В. Окислювальна модифікація білків сироватки крові як маркер активності ревматоїдного артриту та її зміни під впливом фармакотерапії амізоном, індомета-цином, німесулідом / Н. В. Заічко // Вісник Вінницького державного медичного університету.- 2003.- №7 (2/2) -
C.664 - 666.
8. Коренман И. М. Методы определения органических соединений / И. М. Коренман . - М. : Химия, 1975. - 360 с.
9. Корольова Д. С. Використання екамуліну - активатору протромбіну із отрути ефи багатолускової - в клінічній лабораторній діагностиці / Д. С. Корольова, Р. П. Виноградова, Т. М. Чернишенко, Т. М. Платонова // Лаб. діагностика. - 2006. - т. 37, №3 - С. 18-22
10. Мевх А.Т. Изучение эндопероксидпростагландин-синтетезы микросомной фракции тромбоцитов человека / А. Т. Мевх, В. В. Басевич, С. Д. Варфоломеев // Биохимия. - 1982. - т.47, №10. - С.1635-1639.
11. Определение фосфолипидов в биологическом материале по образованию гидрофобного комплекса с фер-ротиоцианатом аммония / А.А. Пентюк, В.И. Гуцол, О.А. Яковлева [и др.] // Лаб. дело. - 1987. - №6. - С.21.
12. Пентюк О.О. Метаболізм гомоцистеїну та його роль у патології / О.О. Пентюк, М.Б. Луцюк, І.І. Андрушко, К.П. Постовітенко // Укр. біохім. журн. - 2003. - 75, №1. - С.5-17.
13. Пентюк О.О. Гіпергомоцистеїнемія: моделювання та вплив на стан судинної системи в експерименті / О.О. Пентюк, М. Б. Луцюк, К. П. Постовітенко // Досягнення біології та медицини. - 2004. - №1 (3). - С.35-38.
14. Сибірна Н.О. Вплив L-аргініну та інгібіторів NO-синтази на стан антиоксидантної системи за умов цукрового діабету 1 типу / Н.О. Сибірна, О.І. Вовк, В.І. Бурда, М.Я. Люта //Лабораторна діагностика. - 2004. - №4. - С.45-51.
15. Современные представления о системе гемостаза / Волков Г.Л., Платонова Т.Н., Савчук А.Н. [та ін.] // Киев : Наукова думка, 2005. - 292 с.
16. Gaitonde M.K. A spectrophotometric method for direct determination of cysteine in the presence of other naturally occuring amino acid / M. K. Gaitonde // Biochem. J.- 1967. - Vol.104, №2. - P.627-633.
17. Gugliucci A. Antithrombin activity is inhibited by acrolein and homocysteine thiolactone: Protection by cysteine / A. Gugliucci // Life Sci.- 2008.- Vol. 82, №7-8. - Р.413-418.
18. Hemostasis imbalance in experimental hypertension /
D.Corseaux, V. Ollivier, V. Fontaine [et al.] // Mol. Med. -2002. - Vol.8, №4. Р.169-178.
19. Lowicka E. Hydrogen sulfide (H2S) - the third gas of interest for pharmacologists / E. Lowicka, J. Beltowski // Pharmacol. Rep. - 2007. - Vol.59, №1. - Р.4-24.
20. Lowry O. H. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O. H. Lowry, N. J. Rosenbrough, A. L. Farr, R. J. Randall // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193.- P. 265 - 276.
21. Stamler J. S. Biological chemistry of thiols in the vasculature and in vascular-related disease / J. S. Stamler, A. Slivka // Nutr. Rev. - 1996. - Vol.54, №1 (Pt. 1). - Р. 1-30.
УДК 616-005.6: 547.466: 546.221
БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ ТРОМБОФИЛИИ, ИНДУЦИРОВАННОЙ ХРОНИЧЕСКОЙ НАГРУЗКОЙ ТИОЛАКТОНОМ ГОМОЦИСТЕИНА И ЕГО КОМБИНАЦИЕЙ С L-NAME. КОРРЕКЦИЯ ВИТАМИННО-МИКРОЭЛЕМЕНТНЫМ КОМПЛЕКСОМ
Заичко Н.В.
Резюме. Исследовано вплияние хронической нагрузки тиолактоном гомоцистеина (100 мг/ кг) и его комбинации с L-NAME (30 мг/кг) на систему гемостаза крыс. Нагрузка тиолактоном гомоцистеина вызывает комплексные нарушения в системе гемостаза: гиперреактивность тромбоцитов, тромбинемию, гиперфибриногенемию, снижение антикоагулянтной и фибри-нолитической активности. Установлено, что новым паттерном формирования тромбофилии, индуцированной гипергомоцистеинемией, является дефицит вазодилятатора, антиагреганта и антиоксиданта гидроген сульфида. Введение L-NAME усиливает дефицит гидроген сульфида и потенциирует негативное влияние тиолактона гомоцистеина на систему гемостаза крыс. Обогащение рациона крыс витаминно-микроэлементным комплексом уменьшает дефицит гидроген сульфида и препятствует развитию тромбофилии.
Ключевые слова: тиолактон гомоцистеина, гидроген сульфид, L-NAME, система гемостаза, витаминно-микроэлементный комплекс.
UDC 616-005.6: 547.466: 546.221
BIOCHEMICAL MECHANISM of THROMBOPHILIA FORMATION INDUCED by CHRONIC HOMOCYSTEINE THIOLACTONE LOADING and its COMBINATION with L-NAME. CORRECTION by VITAMINS-MICROELEMENT COMPLEX Zaichko N.V.
Summary. It was investigated influence of homocysteine thiolactone loading (100 mg/kg) and its combination with L-NAME (30 mg/kg) within 4 weeks on rat hemostasis system. Homocysteine thiolactone loading caused complex disturbance in hemostasis system such as platelet hyperreactivity, thrombinemia, hyperfibrinogenemia, decreasing of anticoagulant and fibrinolytic activity. It was established that deficit of vasodilator, antiaggregant and antioxidant hydrogen sulfide became the new pattern of thrombophilia formation induced by hyperhomocys-teinemia. L-NAME administration increased hydrogen sulfide deficit and potentiated negative influence on rat hemostasis system. Vitamins-microelement enrichment of rat diet decreased hydrogen sulfide deficit and prevented from thrombophilia formation.
Key words: homocysteine thiolactone, hydrogen sulfide, L-NAME, hemostasis system, vita-mins-microelement complex.
Стаття надійшла 2.03.2010 р.
