CC BY
25
Серия «Науки о Земле»
2009. Том 1, № 1. С. 75-83
Онлайн-доступ к журналу: http://isu.ru/izvestia
Иркутского
государственного
университета
И З В Е С Т И Я
УДК 579. 832. 1 574. 24579. 222 574. 23574. 58 Выделение и характеристика бактерий рода НурНот1сгоЪшт из оз. Байкал
А. С. Ковадло (kovadlo@lin.irk.ru)
Аннотация. Впервые из оз. Байкал выделены представители факультативных ме-тилотрофных бактерий - род НурНош1сгоЪшш. Бактерии рода НурНош1сгоЪшш (гифомикробы) обнаружены в 33 % проб воды, отобранных по всей акватории
оз. Байкал. Численность гифомикробов была 3,5 х 102 клеток в миллилитре воды в районе Селенгинского мелководья, что составило 0,01 % от общей численности микроорганизмов. Выявлена способность штамма Ну-Х/1 к аэробной денитрификации.
Ключевые слова: бактерии рода НурНошюгоЪшш, распространение в природе факультативных метилотрофов, аэробная денитрификация.
Отличительными особенностями бактерий рода НурНош1сгоЪтш являются сложный жизненный цикл и факультативно метилотрофный тип физиологии [9]. Метилотрофные микроорганизмы извлекают энергию и в большинстве случаев углерод из соединений, которые не имеют С-С связи, так называемые С1-соединения. Факультативные метилотрофы соответственно способны использовать как С1-соединения, так и соединения с более чем одним атомом углерода [7]. Бактерии рода НурНош1сгоЫиш относятся к группе факультативных метилотрофов [9]. Различные штаммы гифомикробов способны использовать формиат, метиламины [11], хлорметан [15], диметилсульфоксид [20], диметилсульфид [6] и другие соединения. Кроме того, некоторые виды рода НурНош1сгоЫиш осуществляют денитрификацию, где в качестве органического субстрата они используют метанол [22]. Штаммы НурНош1сгоЫиш могут быть выделены как из образцов почвы, так и из проб воды [18]. Гифомикробы также обнаруживаются в составе микробного сообщества активного ила очистных сооружений, причем здесь они имеют наибольшую численность по сравнению с другими местообитаниями [13, 12].
В настоящее время в донных осадках оз. Байкал обнаружены мощные залежи газовых гидратов метана. С помощью молекулярно-генетической идентификации выявлены метанотрофные микроорганизмы [4], но исследования по изучению факультативных метилотрофов в оз. Байкал не проводились. Известно, что метанотрофные микроорганизмы выделяют метанол, который служит субстратом для факультативных метилотрофов, а гифомикробы являются наиболее частыми спутниками метанотрофов в их накопительных культурах [10].
Исследования морфологического разнообразия бактерий оз. Байкал с помощью электронной микроскопии выявили наличие почкующихся бактерий рода Hyphomicrobium в составе микробного сообщества, поэтому целью данной работы было выделение и характеристика бактерий рода Hyphomicrobium из оз. Байкал, как одного из представителей факультативных метилотрофных бактерий. Целью исследования также был подсчет численности микроорганизмов данного рода для мониторинга микробного биоразнообразия экосистемы оз. Байкал и сравнения численности гифо-микробов с другими экосистемами.
Материалы и методы исследования
Отбор проб. В июне 2007 г. были отобраны пробы воды в районе впадения крупнейшего притока оз. Байкал - р. Селенги. Образцы отбирали на 3 станциях: в устье протоки Харауз (глубина 4,5 м) и на расстоянии 1 и 3 км (глубина 18 м) от устья протоки. На каждой станции воду брали с поверхности и у дна.
В июне 2008 г. пробы воды были отобраны по всей акватории озера. Распространение гифомикробов в экосистеме оз. Байкал изучается впервые, и поэтому для исследования были отобраны разнообразные образцы, отражающие разное качество вод оз. Байкал. Часть проб была отобрана в областях влияния притоков озера - 17 проб, 29 проб из глубоководной части озера и областей вблизи населенных пунктов и предприятий.
Обнаружение и учет количества клеток Hyphomicrobium в природном образце. Наличие почкующихся простековых клеток гифомикро-бов предварительно выявляли с помощью световой микроскопии и подтверждали трансмиссионной электронной микроскопией контрастирован-ных уранил ацетатом препаратов. Анализировали природные образцы через 2 месяца после отбора и посева в стерильную среду SM с 0,5 % метанолом [5]. Для учета количества клеток Hyphomicrobium применили методику, подходящую для подсчета морфологически идентифицируемых микроорганизмов. Из исходного образца воды готовили серию десятикратных разведений. Затем с помощью световой микроскопии определяли наличие почкующихся простековых клеток гифомикробов. Изначальное количество в миллилитре воды определяли по таблице МакКреди, основанной на вариационной статистике [1]. В качестве основы для разведений использовали стерильную байкальскую воду или солевую среду SM. Для получения наиболее достоверного результата с наименьшим доверительным интервалом для каждой пробы было выполнено по 3 или 4 повторности разведений.
Метод выделения штаммов. Для того чтобы выделить отдельные штаммы бактерий рода Hyphomicrobium использовали различные подходы. Обнаруженные клетки с помощью световой микроскопии пытались выделить либо через этап обогатительных культур на среде «337» [11] с метанолом, Na-ацетатом, либо путем непосредственного высевания на агаризованную среду, состоящую из минеральной основы «337» с метано-
лом или триметиламином гидрохлоридом, либо без источников углерода. Также применили метод аэробного и анаэробного обогащения в среде «337» с ККО3 и метанолом [19].
Подсчет общего количества микроорганизмов с использованием эпифлуоресцентной микроскопии. Общее количество микроорганизмов в пробах воды учитывали с помощью эпифлуоресцентной микроскопии («Оіушрш», Япония), окрашенных ДАФИ (4,6-диамидино-2-фенилиндол, конечная концентрация 1 мкг/мл) клеток. Для автоматического подсчета использовали программу ImageTest [2]. Расчеты вели на основе формулы, приведенной ранее [1].
Культуральные характеристики ИурквтісгоЬіит sp. Для изучения спектра утилизируемых субстратов использовали в качестве основы минеральную основу «337», которую стерилизовали автоклавированием и каждый тестируемый субстрат добавляли после стерилизации при помощи фильтрации через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Метанол использовали в концентрации 0,05 % (15,6 тМ), 0,5 % (156 тМ), 2 % (625 тМ); триме-тиламин гидрохлорид (11,2 тМ); Ка-ацетат; глюкозу добавляли до конечной концентрации 0,1 %. Культивирование проводили при +30 °С в аэробных условиях без доступа света для С1-соединений. Для исследования влияния температуры на рост гифомикробов проводили культивирование при +4 °С, +17 °С, +30 °С. Время генерации ) и константу скорости роста (ы) рассчитывали согласно формулам [3]. Оптическую плотность измеряли с использованием фотоэлектроколориметра при длине волны 660 нм. Денитрификацию также определяли на минеральной основе «337» с 1 % ККО3 и метанолом в колбах с притоком воздуха. В качестве контроля использовали минеральную основу «337» с ККО3 без микроорганизмов на контроль возможного образования газа в результате химических реакций и «337» без ККО3 с клетками Иу-Х/1. Выделяемый микроорганизмами газ анализировали на газовом хроматографе.
Результаты и их обсуждение
Обнаружение НурЬошісгоЬіиш в пробах воды оз. Байкал Зоны влияния притоков (р. Баргузин, р. Селенга, р. Кичера, р. В. Ангара)
Схема оз. Байкал и станции отбора проб представлены на рис. 1. Бар-гузинский залив и р. Баргузин: в Баргузинском заливе были отобраны 4 пробы с поверхности воды и 2 пробы из придонной части толщи воды. Характерным оказалось то, что именно в 2 придонных пробах (устье р. Баргузин и 3 км от устья) клетки ИурНотісгоЬіит были обнаружены и не обнаружены ни в одной из поверхностных проб (р. Баргузин, устье р. Баргузин, 1 и 3 км от устья). Селенгинское мелководье: в 2007 г. образцы воды отбирали на 3 станциях: в устье протоки Харауз (глубина 4,5 м) и на расстоянии 1 и 3 км от устья протоки в Байкале. На каждой станции воду брали с поверхности и у дна. Было установлено, что в период исследований на приустьевом участке в районе впадения протоки Харауз в оз. Байкал бактерии рода ИурНотісгоЬіит были в основном сосредоточены в
придонной области. Определение наиболее вероятного числа клеток показало максимальное значение в придонной пробе устья протоки Харауз в количестве 3,5 • 102 клеток в миллилитре с доверительным интервалом от 92 до 1330 клеток. Общее количество микроорганизмов в воде данного района варьировало от 2,4 до 3,0 • 106 кл/мл. То есть гифомикробы составляли не более 0,01 % от общего числа микроорганизмов. В других пробах клетки стабильно обнаруживались, но плотность их не превышала 10 клеток в миллилитре воды. В 2008 г. пробы были отобраны на расстоянии 1, 3 и 7 км от устья протоки Харауз. На этих трех станциях брали воду с поверхности и, кроме того, на 3-километровой и 7-километровой станции воду из придонной части толщи. Бактерии рода ИуркоткгоЫыт были найдены в воде, отобранной на поверхности со станции 1 км от устья и из придонной пробы станции в 3 км от устья протоки
Станции, где бактерии рода НурЬот'югоЫит
о не обнаружены • обнаружены
устье р. I
бтье ф р.Верхняя Ангара
с. Байкальское0 # #м.Турали
м. Котельниковский о м.Амундакан
Г
ст.Солн еч н а я - о .У ш ка н и йс
У /|/ Академический хребет о
Г н*
I. Хобой - м.Крест!ш|1Й с о.°Ле^
(гузин
м.Ижимей -оЛис
п. Ма
5 км от п. Култуко
Рис. 1. Схема отбора проб в различных частях оз. Байкал в июне 2007-2008 гг.
Харауз. В устье р. В. Ангара бактерии рода ИуркотісгоЬіит также были обнаружены.
Пелагиаль оз. Байкал. В пробах воды с различных глубин (10 м, 15 м, 50 м, 500 м, 750 м) центральной станции разреза пос. Листвянка - пос. Танхой в исследуемый период простековые клетки бактерий рода ИуркотісгоЬіит не обнаружены. Также они не были найдены в поверхностных пробах центральных станций разрезов Академического хребта, м. Крестовый - м. Хобой, ст. Солнечная - о. Ушканий, м. Ижимей - о. Лиственничный, м. Котельниковский - м. Амундакан, но выявлены на станциях м. Ухан - м. Токий и с. Байкальское - м. Турали.
В областях вблизи населенных пунктов были отобраны следующие пробы: 15 км от пос. Култук (0 м, 5 м, 6000 м, 1200 м), 1 км от пос. Солзан (0 м), центральная станция пос. Маритуй - пос. Солзан, 3 км от пос. Солзан (0 м, 5 м, 25 м, 200 м, 450 м), 3 км от пос. Танхой (0 м), 3 и 7 км от пос. Маритуй (0 м). Бактерии рода ИуркотісгоЬіит обнаружены в 3 км от пос. Солзан на глубине 25 м и от пос. Маритуй на поверхности воды.
В итоге исследуемые микроорганизмы обнаружены в 52 % проб воды, отобранных в зонах влияния крупных притоков и в 14 % проб воды из глубоководной части озера. Таким образом, на основе данных анализа 52 проб воды из оз. Байкал наиболее благоприятные условия для развития гифомикробов в июне 2007 г. и июне 2008 г. наблюдались в основном в зонах влияния крупных притоков.
Согласно исследованиям выявлено, что накопительные культуры ме-тилотрофных денитрификаторов из различных местообитаний, включая почву, донные осадки, загрязненные воды, активный ил, обнаруживают ИуркотісгоЬіит [8, 14, 17]. Выделенные нами штаммы из вод Селенгин-ского мелководья, возможно, указывают на процесс денитрификации, причем кислородтолерантной, при использовании С1-соединений в данном районе.
Изоляция штаммов ИуркотісгоЬіит sp. Изначально был использован метод непосредственного высевания из пробирок с различными разведениями, где наблюдали наличие почкующихся клеток гифомикробов на агаризованные среды, где в качестве источников углерода был использован метанол, триметиламин гидрохлорид, дрожжевой экстракт. Также использовалась среда без источников углерода. Даже в результате длительного культивирования попытки прямого посева на твердые питательные среды оказались безуспешными. Поэтому был использован метод получения накопительных культур в жидкой солевой среде с метанолом или №-ацетатом. А также был опробован метод накопления на метанол-нитратной среде без доступа кислорода и в аэробных условиях. Метод получения накопительных культур на метаноле в аэробных условиях оказался успешным для выделения ИуркотісгоЬіит из проб воды оз. Байкал. В итоге было выделено 8 штаммов из зоны влияния р. Селенги, но морфологические и культуральные исследования показали схожесть выделенных штаммов, даже географически разделенных на расстоянии 2 км, поэтому для дальнейшей характеристики был оставлен 1 штамм Иу-Х/1.
Фенотипическая характеристика НурНотгегоЫшт 8р. Ну-Х/1:
Морфология. Клетки штамма Ну-Х/1 овальной формы, их размер варьирует в зависимости от стадии жизненного цикла, длина клетки -
0,39-1,45 мкм, ширина 0,45-1,22 мкм. Простека шириной 0,15 мкм (рис. 2).
Рис. 2. Трансмиссионная электронная микроскопия штамма Ну-Х/1, выделенного из придонного слоя Селенгинского мелководья.
Культивирование на среде «337» с метанолом. В культуре клетки, находящиеся на разных стадиях жизненного цикла
Физиология ИурНотжгоЬтт Бр. Неоднократно для олиготрофных бактерий рода ИурНотюгоЬшт была показана способность к развитию на средах, не содержащих источников углерода. Поэтому мы протестировали развитие байкальских гифомикробов в среде без источников углерода. Был обнаружен относительно незначительный рост клеток на среде без добавления источников углерода по сравнению с ростом на метаноле. Так, максимальное накопление биомассы при культивировании на минеральной среде составило не более 7 % от биомассы клеток, культивированных в среде с 0,5 % СН3ОН.
Интересно также было выявить оптимальную концентрацию метанола для развития гифомикробов, выделенных из оз. Байкал. Было установлено, что на среде с концентрацией метанола 0,05 % время генерации оказалось 9 ч, на 2 % метаноле - 16,7 ч, а самое небольшое время генерации -7,7 ч необходимо клеткам гифомикробов, выделенным из оз. Байкал, на среде с 0,5 % метанола. Константа скорости роста л при культивировании на 0,5 % СН3ОН составила 0,083 ч-1. По данным ТиИе1а е! а1. л при культивировании на триметиламине для штамма ИурНот1сгоЬшт W1-1B, выделенного из биопленки водосборной скважины (ША) [21], состави-
ло 0,031 ч-1. Невысокие значения константы скорости роста характерны для олиготрофных организмов [23].
Оптимальную температуру для развития в метилотрофных условиях определяли при 0,5 % концентрации СН3ОН. Оказалось, что при +4 °С клетки Hyphomicrobium не размножаются, тогда как с повышением температуры увеличивается интенсивность роста клеток и синтез биомассы.
Для исследования спектра утилизируемых субстратов использовали метанол и метиламин гидрохлорид в качестве индикаторов С-1 метаболизма, глюкозу как показатель наличия цикла Кребса и Na-ацетат на функционирование глиоксилатного цикла, также выделенные штаммы помещали в среду с дрожжевым экстрактом и пептоном. Был получен рост гифомикробов на всех субстратах, кроме дрожжевого экстракта и пептона.
Денитрификация. Исследования показали, что не все штаммы Hyphomicrobium при росте на метаноле способны осуществлять денитрификацию, помимо этого система нитратредукции репрессируется в аэробных условиях [24]. В современном определителе бактерий Берджи [9] описаны виды, осуществляющие редукцию нитрата в анаэробных условиях, например вид Hyphomicrobium denitrificans. Хотя в статье J. B. M. Meiberg и соавт. [16] сообщалось о синтезе нитратредуктазы у Hyphomicrobium X (типовом штамме Hyphomicrobium denitrificans) при низком давлении кислорода - от 0 до 20 мм рт. ст. При росте Hyphomicrobium Hy-X/1 на среде «337» с метанолом и KNO3 в аэробных условиях выделялся газ, указывающий на процесс денитрификации. Анализ показал, что на 94 % выделяемый газ состоит из N2. Таким образом, можно предположить, что бактерии рода Hyphomicrobium в оз. Байкал осуществляют редукцию нитратов до газообразного азота с одновременным использованием растворенного в воде кислорода в аэробной зоне водоема.
Заключение
Таким образом, были проведены первые исследования, посвященные факультативным метилотрофам в оз. Байкал. Выявлено наличие почкующихся клеток гифомикробов в одной трети проб, отобранных в различных участках оз. Байкал. Численность клеток в воде озера сопоставима с численностью гифомикробов в других пресноводных водоемах, не подверженных влиянию загрязняющих стоков [12]. Штамм Hy-X/1, выделенный из оз. Байкал, в основном выявил характерные для данного рода физиологические особенности. А именно низкая скорость роста и способность размножаться без источников углерода, характерная для олиготрофных микроорганизмов, а также факультативно метилотрофный тип физиологии. Однако выявлена способность данного организма к осуществлению денитрификации при воздушном насыщении кислородом среды, что исследовано для микроорганизмов других родов, но не описано для рода Hyphomicrobium [9].
Список литературы
1. Антипчук А. Ф. Микробиологический контроль в прудовых хозяйствах / А. Ф. Антипчук. - М. : Пищ. пром-сть, 1979. - 145 с.
2. Компьютерная система учета изображений флюоресцентно-окрашенных бактерий / В. Н. Дроздов [и др.] // Микробиология. - 2006. - Т. 75, № 6. - С. 751.
3. Шлегель Г. Общая микробиология / Г. Шлегель. - М. : Мир, 1972. - 476 с.
4. Первые результаты исследования филогенетического разнообразия микроорганизмов осадков Южного Байкала в районе приповерхностного залегания гидратов метана / О. В. Шубенкова [и др.] // Микробиология. - 2005. - Т 74, № 3. -С. 370-377.
5. Aa K. The Use of Various Substrates and Substrate Concentrations by a Hyphomicrobium sp. Isolated From Soil: Effect on Growth Rate and Growth Yield / K. Aa, R. A. Olsen // Microb. Ecol. - 1996. - Vol. 31. - P. 67-76.
6. De Bo I. Removal of dimethyl sulfide from waste air in a membrane bioreactor /
I. De Bo, H. Van Langenhove, J. Heyman // Desalination. - 2002. - Vol. 148. - P. 281-287.
7. De Marco P. Methylotrophy versus heterotrophy: a misconception / P. De Marco // Microbiology. - 2004. - Vol. 150, № 6. - Р. 1606-1607.
8. Foglar L. Wastewater Denitrification Process- The Influence of Methanol and Kinetic Analysis / L. Foglar, F. Briski // Process Biochemistry. - 2003. - Vol. 39. -P. 95-103.
9. Gliesche C. Bergey’s Manual of systematic bacteriology. 2nd ed. / C. Gli-esche, A. Fesefeldt, P. Hirsch ; eds. D. J. Brenner, N. R. Krieg, J. T. Staley. - N. Y. : Springer, 2005. - Vol. 2, part C. - P. 476-494.
10. Hanson S. R. Methanotrophic bacteria / S. R. Hanson, T. E. Hanson // Microbiological Reviews. - 1996. - 60: 2. - Р. 439-471.
11. Hirsch P. Biology of Budding Bacteria II. Growth and Nutrition of Hyphom-ierobium spp. / P. Hirsch, S. F. Conti // Archiv fur Mikrobiologie. - 1964. - Vol. 4S. -P. 35S-367.
12. Holm N. C. Diversity and Structure of Hyphomicrobium Populations in a Sewage Treatment Plant and Its Adjacent Receiving Lake / N. C. Holm, C. G. Gliesche, P. Hirsch // Applied and Environmental Microbiology. - 1996. - Vol. 62, N 2. -P. 522-528.
13. Quantification of Hyphomicrobium Populations in Activated Sludge from an Industrial Wastewater Treatment System as Determined by 16S rRNA Analysis / A. C. Layton [et al.] // Applied and Environmental Microbiology. - 2000. - Vol. 66. -P. 31167-1174.
14. Lemmer H. Denitrification in a Methanol Fed Fixed Bed Reactor. Part 1: Physico-Chemical and Biological Characterization / H. Lemmer, A. Zaglauer, G. Metzner // Water Science Technology. - 1997. - Vol. 31. - P. 1S97-1902.
15. Hyphomicrobium chloromethanicum sp. nov. and Methylobacterium chloro-methanicum sp. nov.,chloromethane-utilizing bacteria isolated from a polluted environment / I. R. McDonald [et al.] // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. - 2001. - Vol. 51. - P. 119-122.
16. Meiberg J. B. M. Effect of dissolved oxigen tension on the Metabolism of Methylated amines in Hyphomicrobium X in the absence and presence of nitrate: evidence for „aerobic“ denitrification / J. B. M. Meiberg, P. M. Bruinenberg, W. Harder // Journal of General Microbiology. - 19S0. - Р. 120, 453-463.
17. Full-scale application of nitrogen removal with methanol as carbon source / U. Nyberg [et al.] // Water Sci. Technol. - 1992. - Vol. 26. - P. 1077-10S6.
1S. Poindexter J. S. Dimorphic Prosthecate Bacteria: The Genera Caulobacter, Asticcacaulis, Hyphomicrobium, Pedomicrobium, Hyphomonas and Thiodendron // The prokaryotes / eds. A. Balows [et al.]. - N. Y. : Springer, 1992 . - P. 2176-2192.
19. Sperl G. T. Denitrification with Methanol: a Selective Enrichment for Hy-phomicrobium Species / G. T. Sperl, D. S. Hoare // J. of Bacteriology. - 1971. -Vol. 10S. - P. 733-736.
20. Continuous degradation of dimeyhyl sulfoxide to sulfate ion by Hyphomi-crobium denitrificans WU-K217 / M. i-N. Takako [et al.] // Journal of bioscience and bioengineering. - 2002. - Vol. 94, N 1. - P. 52-56.
21. Phylogenetic and narG Analysis of a Hyphomicrobium Isolate / L. Tuhela [et al.] // Curent Microbiology. - 1997. - Vol. 35. - P. 244-24S.
22. Characterization and description of Hyphomicrobium denitrificans sp. nov. / T. Urakami [et al.] // Int. J. Syst. Bacteriol. - 1995. - Vol. 45. - P. 52S-532.
23. Van Gemerden H. Heterotrophic activity in the sea / H. Van Gemerden, J. G. Kuenen // NATO conference series. Marine sciences: trends. - 19S4. - Vol. 15. -P. 25-54.
24. Zumft W. G. Cell Biology and Molecular Basis of Denitrification / W. G. Zumft // Microbiology and Molecular Biology Reviews. - 1997. - Vol. 61, N 4. - P. 533-616.
Isolation and characteristic
of g. Hyphomicrobium bacteria from Lake Baikal
A. S. Kovadlo
Abstract. First representatives of facultative methylotrophic bacteria were isolated from Lake Baikal (genus Hyphomicrobium). G. Hyphomicrobium bacteria were detected in 33 % water samples took all over the basin of Lake Baikal. The abundance of hyphomi-crobes was 3,5 x 102 cells per milliliter of water in region of Selenga river shoal though it was composed 0, 01 % from total number of microorganisms. The ability of Hy-X/1 strain to aerobic denitrification was detected.
Key words: genus Hyphomicrobium bacteria, distribution in nature of facultative me-thylotrophic microorganisms, aerobic denitrification.
Ковадло Анна Сергеевна кандидат биологических наук Лимнологический институт СО РАН 664033, Иркутск, ул. Улан-Баторская, 3 лаборатория водной микробиологии тел.: 42-54-15
