CC BY
39
Учредители:
Уральское отделение РАН Оренбургский научный центр УрО РАН
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН
(электронный журнал)
© Д.Ю. Шаравин, 2014 УДК 579.841.9:574.266 Д.Ю. Шаравин
РАЗНООБРАЗИЕ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ПРОТЕОБАКТЕРИЙ В ФИЛЬТРАЦИОННЫХ ВОДАХ ПОЛИГОНА ЗАХОРОНЕНИЯ ТВЁРДЫХ БЫТОВЫХ ОТХОДОВ
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия
Цель. Изучение видового разнообразия культивируемых протеобактерий (метило-трофных и нитратвосстанавливающих) в фильтрационных водах полигона твёрдых бытовых отходов (ПТБО).
Материалы и методы. Проведены гидрохимические и микробиологические анализы проб воды обводного канала ПТБО. Выделено 17 культур а-, в- и у-протеобактерий, обладающих различными типами обмена веществ. Определено их филогенетическое положение и хемотаксономическая характеристика.
Результаты. 15 изолятов имели высокий уровень сходства с известными видами протеобактерий, включая 8 штаммов метилобактерий. Два метилотрофных изолята отнесены к неклассифицированным представителям класса Ве1арго1еоЪас1епа порядка Ые^у-1орЫ1а1е$.
Заключение. В фильтрационных водах ПТБО широко распространены культивируемые протеобактерии, включая аэробные нитратвосстанавливающие Л1рЫарто1еоЪас1е-па, метанотрофные и типично гетеротрофные Оаттар^еоЪа^епа, метилотрофные Ве1а-р^еоЪа^епа.
Ключевые слова: Сточные воды, ProteoЪacteria, метилобактерии, нитратредукция, филогения.
DIVERSITY OF CULTIVATED PROTEOBACTERIA IN A MUNICIPAL LANDFILL IRRIGATION CANAL
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, UrB RAS, Perm, Russia
Objective. The present study was aimed at investigation of diversity of cultivated nitrate-reducing, denitrifying and methylotrophic proteobacteria from the leachate of the municipal landfill irrigation canal.
Materials and methods. Hydrochemical and microbiological analyses of water probes from the landfill irrigation canal were done. 17 strains of a-, (-, and y-proteobacteria with a different types of metabolism were isolated and identified using their phylogeny and chemotax-onomy.
Results. 15 isolates possessed significant similarity to known species including 8 strains of methylotrophs. Two methylotrophic strains were assigned to the unknown Betaproteobacteria
representatives of the order Methylophilales.
Conclusions. Cultivated proteobacteria, including aerobic nitrate-reducing Alphaproteo-bacteria, methanotrophs, heterotrophic Gammaproteobacteria and methylotrophic Betaproteo-bacteria are dominate among the bacteria in a landfill leachate.
Key words: Leachate, Proteobacteria, methylobacteria, nitrate reduction, phylogeny.
Введение
Основную часть твердых бытовых отходов (ТБО) городов подвергают захоронению на специально оборудованных площадках/полигонах (ПТБО). Органические компоненты залежей ТБО разлагаются микроорганизмами с образованием биогаза, состоящего примерно на 50-70% из СН4 и на 30-50% из CO2. ПТБО являются важным источником атмосферного метана, их вклад в глобальную эмиссию этого парникового газа оценивается в 6-12%. В теплый период года в покрывающем аэробном слое почвы увеличивается общая численность метанотрофов, к осени интенсивность окисления метана достигает максимума и эмиссия СН4 в атмосферу существенно сокращается [1-4]. Кроме эмиссии метана ПТБО оказывают негативное воздействие на окружающую среду даже после их закрытия, в частности из-за продолжающегося стока загрязненных фильтрационных и инфильтрационных вод. Однако многие вопросы экологии и функциональной роли водных микроорганизмов в сточных водах ПТБО остаются неизученными.
В фильтрационных водах ПТБО, загрязнённых соединениями азота, фосфора и металлов, обнаружено массовое распространение культивируемых протеобактерий, включая малоизученные на других полигонах ТБО метило-трофные и нитратвосстанавливающие протеобактерии. У микробиоценоза слабощелочных придонных вод обводного канала ПТБО выявлена высокая потенциальная способность к денитрификации.
Настоящая работа посвящена изучению видового разнообразия культивируемых метилотрофных и нитратвосстанавливающих протеобактерий в фильтрационных водах ПТБО г. Перми.
Материалы и методы
В 2010-2012 гг. изучали микробиоценоз водных масс обводного канала ПТБО “Софроны” г. Перми, используемого для утилизации основной массы городского мусора с 1978 г.
Численность аэробных и анаэробных бактерий в фильтрационных водах ПТБО определяли методом предельных разведений на жидких и агаризо-ванных средах, используемых при изучении отдельных групп пресноводных микроорганизмов, участвующих в превращениях соединений углерода и азота [5-7]. Посевы инкубировали при 25-30°С в течение 2-14 суток до появления отдельных колоний на плотных средах или клеточных суспензий на жидких средах. Методом предельных разведений выделено 17 нейтрофильных
2
изолятов ншратвосстанавливающих пpотеобaктеpий, включая В штаммов aэpобных метилобaктеpий.
Для кyльтивиpовaния метилобaктеpий использовали модифициpовaн-ную нами сpедy «К» [7] пpи 28OC и pH 7.2 (г/л): NaCl - 2; KH2PO4 - 1; MgSO4 •7H2O - 0.5; NaHCO3 - 0.4; FeSO4 • 7H2O - 0.002; (NH4)2SO4 - 0.3; KNO3 - 0.6; дpожжевой экстpaкт - 0.05; витамин B12 - 20 мкг/л; метанол - 5 мл/л; ми^о-элементы по Пфеннигу - 1 мл/л. Для получєния плотных сpед того же состава добавляли 20 г/л arapa Difco. Kyльтypы хpaнили на скошенном aгapе пpи 2-3OC в пpобиpкaх под pезиновыми пpобкaми. Пpи aнaэpобном культив^о-вании пpотеобaктеpий в качестве aкцептоpов электpонов использовали нит-par калия (2 г/л), тестиpyя в качестве доноpa электpонов метанол, ацетат, цитpaт, глюкозу, пептон и пиpyвaт. Для выявления сaпpотpофных компонентов из накопительных кyльтyp метилотpофных в-пpотеобaктеpий использовали метод последовательных пеpесевов отдельных колоний на плотной сpе-де (г/л): aгap Difco - 20; NaCl - 2; KH2PO4 - 1; MgSO4-7H2O - 0.5; пептон - 5.
Г идpохимические анализы выполняли согласно фактическому pyково-дству по изучению состава пpомышленных сточных вод [В]. Cодеpжaние металлов в фильтpaционных водах nTBO опpеделяли после подкисления пpоб азотной кислотой до pH<2 на aтомно-aбсоpционном спектpометpе Shimadzu AA-6300 (Япония).
Cпособность к деншрификации микpофлоpы сточных вод и кyльтyp пpотеобaктеpий оценивали по накоплению N2O в газовой фазе с N2 и ацетиленом. O способности кyльтyp к фиксации молекyляpного азота судили по нитpогенaзной активности восстановления ацетилена в этилен в микpоaэpоб-ных условиях. Анализ газовых смесей поизводили на хpомaтогpaфе Chrom-5 (Чехословакия) с ^именением кaтapометpa, колонки длиной 2.4 м и диамет-pом 6 мм с aбсоpбентом Porapak N (CША). Жиpнокислотный состав (ЖК) aнaлизиpовaли на хpомaто-мaсс-спектpометpической системе Agilent 6890/5973N (ОША). ЖК концентpиpовaнной центpифyгиpовaнием бак^и-альной биомассы пеpеводили в метилиpовaнные эфиpы в смеси метанол-HCl, эфиpы экстpaгиpовaли гексаном, затем paзделяли на хpомaтогpaфиче-ской кaпилляpной колонке с неполяpной фазой HP-5MS в pежиме ^о^ам-миpовaния темпеpaтypы и далее aнaлизиpовaли в динамическом pежиме на мaсс-спектpометpе [9]. Идентификацию метиловых эф^ов ЖК осуществляли с использованием aвтомaтизиpовaнной системы обpaботки масс-
3
спектральных данных AMDIS с поиском целевых компонентов по библиотеке NISTEPA, MSL (США) с фактором сходства не менее 80%.
На первом этапе выделения микроорганизмов, доминирующих в фильтрационных водах ПТБО, в суспензиях и колониях которых визуально загрязнений не обнаруживали, секвенировали нуклеотидные последовательности ПЦР-фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК. Затем проводили первичный сравнительный анализ полученных последовательностей с помощью программного пакета BLAST [10]. На заключительном этапе выделения чистых культур протеобактерий, в частности, у метилотрофных штаммов определяли практически полные последовательности гена 16S рРНК (1475-1505) нуклеотидов. Затем эти последовательности анализировали с помощью пакета программ Classifier [11]. Филогенетический анализ проводили по методу maximum-likelihood и алгоритмов, реализованных в пакете программ TREE-CON и MEGA 4 [12]. Последовательности генов 16S рРНК, полученные в данной работе, депонированы в базе данных GenBank под номерами KC577607- KC577612.
Результаты и обсуждение
Исследованные фильтрационные воды обводного канала ПТБО характеризовались “высоким загрязнением” по химическому потреблению кислорода (ХПК), общей численности бактерий и одноклеточных водорослей, “кишечных палочек”, аммонию, нитратам, нитритам, фосфору, меди, железу и никелю (табл. 1).
Общая численность бактериоподобных клеток по методу прямого счета (N6) в придонных водах мелководного обводного канала ПТБО (700-1640 млн. кл/мл) оказалась в среднем в 90 раз выше, чем в поверхностных слоях воды (6-20 млн. кл/мл). Повышение численности N6 обычно происходило весной в пробах надиловой воды, содержащих много растворенного метана (1,6 - 2,2 мл СН4/л), черной взвеси и анаэробных сульфатвосстанавливающих бактерий (СВБ). В то же время численность СВБ в воде у поверхности была в среднем в 5000 раз ниже (0,01% от N6), чем у дна (15-22% от N6). При этом массовое распространение СВБ было обусловлено преимущественным развитием анаэробных грамотрицательных Deltaproteobacteria, по морфитипу сходных с Desulfovibrio desulfuricans и D. vulgaris.
В сообществе микроорганизмов фильтрационных вод ПТБО были широко представлены условно патогенные Gammaproteobacteria, выявляемые на
4
лактозо-пептонном агаре Макконки с солями желчи и кристаллвиолета.
Таблица 1. Гидрохимическая и микробиологическая характеристика поверхностных и придонных вод обводного канала пермского ПТБО «Софроны» в 2010 - 2012 гг.
Показатель Вода у поверхности Вода придонная
рН 8.3±0.3 8.0±0.3
Химическое потребление кислорода, мг О/л 320±128 353±93
Численность водорослей, млн. кл/мл 0.57±0.32 1.55±1.42
Численность бактерий (Кб), млн. кл/мл 13±7 1170±470
Протеобактерии, % от Кб:
Сульфатвосстанавливающие анаэробы 0.01±0.01 12±10
Аэробные метилобактерии 32±28 0.5±0.2
Нитритокисляющие 0.15±0.05 0.03±0.01
Аммонийокисляющие 0.02±0.01 0.004±0.002
Энтеробактерии на агаре Макконки 0.11±0.10 0.006±0.0005
Содержание метана, мл СЩ/л 0.23±0.18 1.51±0.66
Содержание минеральных веществ, мг/л:
Фосфор общий 0.35±0.08 2.5±0.6
Аммоний 39.2±18.3 48.7±17.7
Нитраты 47.6±14.6 45.1±15.3
Нитриты 1.9±0.5 2.2±1.1
Хлориды 985±262 990±274
Г идрокарбонаты 803±120 842±105
Сульфаты 617±248 623±243
Натрий 582±224 645±266
Калий 266±85 335±22
Магний 182±27 152±18
Кальций 93±27 90±25
Железо 0.41±0.20 3.23±1.45
Никель 0.12±0.02 0.14±0.03
Медь 0.09±0.06 0.12±0.07
Цинк 0.04±0.01 0.12±0.06
Свинец 0.07±0.02 0.07±0.01
Хром 0.02±0.01 0.02±0.01
Кадмий 0.004±0.001 0.005±0.001
При этом на данной селективной среде высевались, преимущественно, лактоза-ферментирующие палочки рода ЕМвтоЪаавг, в частности, Е. а8Ъипав с Г+Ц в ДНК 56.0 мол.% и основными ЖК С16:1, С16, С18:1. Они быстро росли
на глюкозо-пептонном агаре, в качестве единственного источника углерода и энергии использовали различные углеводы, цитрат и пируват, восстанавливали нитраты до нитритов.
Практически все 17 чистых культур аэробных протеобактерий, выделенных из образцов сточных вод ПТБО, обладали способностью к нитратре-дукции. При этом изоляты А1рИарго1еоЪас1епа (включая типично гетеротрофные, метилотрофные и метанотрофные) относились к родам лишь одного порядка КЫ2оЫа1е8: ЯМ2оЪ1ит, AgroЪacterium, ОсИгоЪас^иш, Ме^уЬЪас-1епит и Ме^у^тш. В их жирнокислотных профилях явно преобладала ок-тадеценовая С18:1 кислота (60-85% в сумме ЖК). В частности, штамм ЯБ-У2 представлял собой розово-пигментированную факультативную метилобакте-рию, способную к денитрификации на метаноле и, особенно, на пирувате. Подвижные палочки размером 0,8-1,4*1,0-3,0 мкм со слабо выраженной ка-талазной и оксидазной активностью. Содержание Г+Ц в ДНК составляло 70,5 мол.%. Согласно результатам филогенетического анализа последовательностей генов 16Б рРНК, изолят имел высокий уровень сходства (99,3%) с Ме-^у1оЪа^епит га^оШегат и, следовательно, являлся штаммом указанного вида: МЪ. radiotolerans ЯБ-У2 (рис. 1).
У штаммов альфапротеобактерий - ЯБ-Х6 (по последовательностям нуклеотидов в гене 16Б рРНК) на 97,7% сходен с Ос^оЪас^ит cytisi и ЯБ-Мо1 (Ме^у1о8тш trichosporium), у гаммапротеобактерий - ЯБ-В, ЯБ-Н (на 98,1-98,8% сходны с Shewanella ри^е/аает) и ЯБ-Х5 (97,8% - со Stenotro-рИотопа8 таЫорИНа) выявлена способность к фиксации молекулярного азота: рост на безазотистой среде и нитрогеназная активность по восстановлению ацетилена до этилена.
В исследованных образцах воды численность культивируемых на элективных средах хемолитоавтотрофных аммоний- и нитритокисляющих проте-обактерий, метанотрофов - на среде “П” под газовой фазой с 15% СН4 при 25ОС, была значительно ниже численности метилобактерий на плотной и жидкой среде “К” с 5 мл/л метанола: от 4 до 60% от N в поверхностных пробах и 0,3-0,7% от Кб в придонной воде (табл. 1).
Среди культивируемых метанотрофов доминировали альфапротеобак-терии рода Ме^у^тш (М. МсИозропит) и гаммапротеобактерии рода Ме-^у1отопаБ (М. те^атса), среди метилобактерий - бетапротеобактерии рода Methyloversatilis порядка Rhodocyclales (сходство штаммов ЯБ-ХМ, ЯБ-Х1,
6
RS-X2 с Methyloversatilis universalis составило 99,4-99,7%) и двух таксономически неопределённых штаммов (RS-X3, RS-M7) порядка Methylophilales (рис.1).
0.02
100
60
100
74rCastellaniella defragrans DSM 12141T(AJ005447) 75jl Castellaniella denitrificans RS-MT7(KF371 657)
■ Castellaniella denitrifcans DSM 1 1046T(U82826)
I—Castellaniella caeni LMG 23411T(AB166879)
■ Castellaniella hirudinis LMG2691 0T(JQ31 9891)
82
T
-Achromobacter xylosoxidans ssp. denitrificans DSM 30026 (AJ278451)
100
-I qqL Achromobacter xvlosoxidans RS-X3 Pp2013 (KC577608)
96 Achromobacter xylosoxidans ssp. xylosoxidans DSM 10346 (Y14908) ■ Burkholderia phymatum STM815T(AJ302312)
- Burkholderia denitrificans DSM 24336T(GU1 71384)
_____r Methyloversatilis universalis RS-XM (KC577607)
100L Methyloversatilis universalis FAM5T(DQ442273) -----------Thiobacillus denitrifcans NCIMB 9548T(AJ243144)
p Methvlotrophic bacterium RS-X3qen.nov.,sp.nov(KC577612) Methvlotrophic bacterium RS-M7gen.nov.,sp.nov(KC577611)
100
62
80
Methylotenera mobilis JLW8 (CP001672)
— Methylotenera versatile 301 T(CP002056)
98 Methylophilus methylotrophus DSM 46235T(AB 193724)
99
93
L Methybphilus flavus DSM 23073T(FJ872108)
87
100
L Methyophilus glucosoxidans B (HM001 269) 100|Methyovorus glucosotrophus DSM6874T(FR733702) Methyovorus mays CT(AY486132)
— Methylobacillus glycogenes DSM5685T(FR733701)
97------Methyobacillus pratensis F31 T(AY298905)
— Methylophaga marina DSM 5689 (X95459)
— Methylophaga thiooxydans DSM 22068T(DQ660915)
51 p- MethvlophaqaRS-MM3 sp.nov(KF371656)
rC
80
87
— Methylophaga lonarensis VKM B-26841 (JF330773)
- Methylophaga nitratireducentcrescens DSM 25689T (CP003390)
■ Methylophagaalcalca DSM 14953T(AF384373)
100 Methylobacterium hispanicum RS-MM6LKF371 658) Methylobacterium hispancum DSM 16372 (AJ635304)
10^1-----------Methylobacterium organophilum ATCC 27886T(AB175638)
Gammaproteo bacteria
____I Methvlobacterium radiotolerans RS-V2 (KC577610)
98L- Methylobacterium radiotolerans JCM 2831 (D32227)
A lp haproteobacteria
B
e
a
Рис. 1. Бескорневая дендрограмма филогенетических отношений последовательностей 16S рРНК (длиной 1249 п.н.) для изученных изолятов (по алгоритму maximum-likelihood). Значения «bootstrap» показаны для 1000 повторностей. Указана достоверность ветвления выше 50%. Масштаб: 2 нуклеотидные замены на 100 нуклеотидов. Типовые штаммы видов рода обозначены надстрочным Т. Последовательности, полученные в данной работе, выделены жирным подчёркнутым шрифтом.
Филогенетически штамм RS-XM был наиболее близок к типовому виду Methyloversatilis universalis (99,7%) семейства Rhodocyclaceae, но удален от штаммов RS-X3, RS-M7 (90,8-91,0%) и от альфапротеобактерии Methylobacterium radiotolerans RS-V2 (78,6%). Два филогенетически близких изолята RS-X3, RS-M7 примыкали к группе родов семейства Methylophilaceae: Methy-
lotenera, Methylovorus, Methylobacillus и Methylophilus (93,6-95,1%). По результатам анализа последовательности генов 16S рРНК изоляты RS-X3, RS-М7 были отнесены к неклассифицированным представителям класса Betapro-teobacteria.
У всех метилотрофных изолятов бетапротеобактерий в жирнокислотном профиле преобладали Ci6, С16:1, Ci8:i (70-85% в сумме ЖК), содержание Г+Ц в ДНК составляло 58-68 мол.%. Все они являлись пресноводными ней-трофилами и мезофилами, росли на широком спектре органических субстратов, в анаэробных условиях в качестве терминальных акцепторов электронов использовали нитраты и нитриты.
Накопительные культуры изолятов RS-X3 и RS-M7 представляли собой ассоциации метилотрофоных и сапротрофных /-протеобактерий. Из ассоциаций RS-X3 и RS-M7 были выделены чистые культуры Betaproteobacteria порядка Burkholderiales с высокой каталазной активностью: из RS-M7 - са-протрофный Comamonas sp. RS-M7Pp2013 (на 96,5% сходен с Comamonas terrigena), из RS-X3 - сапротрофный и метилотрофный Achromobacter xylosoxidans RS-X3Pp2013 (99,2% - с Achromobacter xylosoxidans ssp.
xylosoxidans).
Methyloversatilis universalis FAM5 порядка Rhodocyclales и изолят M. universalis RS-XM на построенной дендрограмме формировали периферический кластер, обособленный от кластера, включающего представителей четырех ранее описанных родов семейства Methylophilaceae и двух представляемых в данной работе уникальных метилотрофных изолятов RS-M7 и RS-X3. Уровни сходства последовательностей генов 16S рРНК между этими кластерами составляли 84,1-91,0%. Столь же значительно удалены (86,9%) партнеры по ассоциации в накопительных культурах (метилотрофный RS-M7
и сапротрофный RS-M7Pp2013). Изолят Methyloversatilis universalis RS-XM
т
оказался несколько ближе к метилобактерии Burkholderia phymatum STM815 (92,2%).
Ряд культур изолятов а-, в- и у-протеобактерий из образцов фильтрационных вод полигона “Софроны”, независимо от типа обмена веществ, обладали способностью к нитратредукции и интенсивной денитрификации на пи-рувате (табл. 2). На метаноле активность денитрификации оказалась в десятки раз слабее даже у метилобактерий и отсутствовала у штаммов Shewanella
рМгв/аавт и ОсНгоЬасКит суИ8\ ЯБ-Хб. На средах с метанолом или пирува-том диссимиляционная нитратредукция до Ж20 и N2 не была обнаружена только у МвХкуЪятт МсИо8рогтт ЯЗ-Мо 1 и Мв1ку1отопа8 т^катса ЯБ-Мо2, несмотря на их способность использовать нитраты в качестве источника азота, а метан и метанол - в качестве источника углерода и энергии.
Таблица 2. Интенсивность денитрификации у культур а-, в- и у- протеобак-терий, изолированных из вод пермского ПТБО, на средах с пи-руватом и метанолом
Штамм Организм Денитрификация, мг N/л в сут
на метаноле на пирувате
RS-V2 Methylobacterium radiotolerans 5.1 52
RS-XM Methyloversatilis universalis 2.2 S3
RS-M7, RS-X3 Неклассифицированные представители порядка Methylophi-lales 1.3-1.5 97-110
RS-X5 Stenotrophomonas maltophila 0.9 106
RS-B, RS-H Shewanella putrefaciens 0 91-12S
RS-X6 Ochrobactrum cytisi 0 121
Для определения активности денитрификации при благоприятных окислительно-восстановительных условиях в слабощелочной придонной воде из обводного канала ПТБО в пробы вносили органические вещества и минеральные соединения азота (табл. 3).
Таблица 3. Повышение интенсивности денитрификации под влиянием добавок органических и азотсодержащих веществ (при 24°С) в образцах придонной воды обводного канала пермского ПТБО
Добавка в 1 л пробы Денитрификация, мкг N/л в сут Содержание нитритов, мкг Мл
Контроль, вода без добавок 340±5 60±5
Метанол, 1 мл 3S0±10 15±5
Пируват Ка, 0.5 г 450±15 0
№N03, 5 мг N 1430±50 360±15
№N03, 5 мг N + метанол, 1 мл 14S0±35 480±25
№N0^ 5 мг N + пируват №, 0.5 г 3S40±40 250±10
№N02, 5 мг N + пируват №, 0.5 г 4S50±S0 460±35
Примечание. Пробы отобраны 4 октября 2012г. Температура природной воды составляла 2 °С, рН 7.9, содержание (мг Жл): нитриты - 0.3, нитраты - 7.8, аммоний -34.6.
После введения метанола и пирувата процесс денитрификации активировался слабо, преимущественно, за счет усиления потребления нитритов. Введение метанола совместно с нитратами (по сравнению с добавками одних
нитратов) существенно активировало только процесс накопления нитритов. Следует отметить, что добавление пирувата совместно с нитратами и, особенно с нитритами, резко усиливало интенсивность денитрификации. При этом азот добавленных нитритов (5 мг N-NO2An) уже через 1 сут. практически полностью переходил в N2O (при ингибировании N^-редуктазы ацетиленом).
Заключение
В фильтрационных водах ПТБО г. Перми обнаружено “высокое загрязнение” соединениями азота, фосфора и тяжелыми металлами.
Эти условия способствовали преимущественному распространению культивируемых протеобактерий. Они включали анаэробные сульфатвосста-навливающие бактерии (СВБ) Deltaproteobacteria, аэробные нитратвосста-навливающие Alphaproteobacteria порядка Rhizobiales, метанотрофные и типично гетеротрофные Gammaproteobacteria, метилотрофные Betaproteobacte-ria порядка Burkholderiales (Achromobacter xylosoxidans), порядка Rhodocyc-lales (Methyloversatilis universalis) и два изолята (RS-X3, RS-M7) с таксономически неопределенным положением, примыкающих к группе родов семейства Methylophilaceae. Большинство изученных метилобактерий (Methylobac-terium radiotolerans RS-V2, Methyloversatilis universalis RS-XM, RS-X1 и RS-X2, Stenotrophomonas maltophila RS-X5, изоляты RS-X3, RS-M7) в аэробных условиях росли на средах с метанолом, но в анаэробных условиях на средах с пируватом и нитратами росли как активные денитрификаторы. На метаноле активность денитрификации и анаэробный рост у них был значительно слабее. Также в придонных водах обводного канала ПТБО интенсивность потенциальной денитрификации осенью была исключительно высока при введении добавок пирувата совместно с нитратами и особенно с нитритами. Ранее неоднократно обращали внимание на прямую и опосредованную связь процессов денитрификации в определенных сточных водах и донных осадках с активностью сообществ метано- и метилотрофов [13-15]. Например, в донных отложениях мезотрофного озера Вашингтон (Сиэтл, США) среди денит-рификаторов обнаружены аэробные метилобактерии семейства Methylophilaceae, особенно доминирующие там виды рода Methylotenera [15].
(Работа выполнена при поддержке Программы Президиума РАН “Молекулярная и клеточная биология ”, проект № 01200963684 с использованием уникального научного оборудования АЦКП «Биоинженерия» (ФГБУН Центр «Биоинженерия» РАН).
ЛИТЕРАТУРА
1. Ножевникова А.Н., Каллистова А.Ю., Кевбрина М.В. Эмиссия и окисление метана на полигоне захоронения твердых бытовых отходов: сезонные измерения. Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского. М.: Наука, 2006. 13: 172-191.
2. Bogner J.E., Spokas K.A. Landfill CH4: rates, fates, and role in global carbon cycle Chemos-phere. 1993. 26. (1/4): 369-386.
3. Вайсман Я.И., Вайсман О.Я., Максимов С.В. Управление метаногенезом на полигонах твердых бытовых отходов. - Пермь: ПГТУ, 2003. 232 с.
4. Каллистова А.Ю., Кевбрина М.В., Некрасова В.К. и др. Окисление метана в покрывающей почве полигона захоронения твердых бытовых отходов. Микробиология. 2005. 74(5): 699-706.
5. Кузнецов С.И., Дубинина Г.А. Методы изучения водных микроорганизмов. М.: Наука, 1989. 288с.
6. Гальченко В.Ф. Метанотрофные бактерии. М.: ГЕОС, 2001. 500с.
7. Троценко Ю.А., Доронина Н.В., Торгонская М.Л. Аэробные метилобактерии. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 2010. 325с.
8. Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод. М.: МГУ, 1975. 246с.
9. Саралов А.И., Кузнецов Б.Б., Реутских Е.М. и др. Arhodomonas recens sp.nov. - гало-фильная алканотрофная водородная бактерия из рассолов флотационного обогащения калийных минералов. Микробиология. 2012. 81.(5): 630-637.
10. Basic Local Alignment Search Tool [Электронный ресурс] National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine, USA. (Url: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
11. Classifier - Start [Электронный ресурс] Michigan State University, USA. (Url: http://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp)
12. Tamura K., Peterson D., Peterson N. et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 2011. 28: 2731-2739.
13. Nercessian O., Noyes E., Kalyuzhnaya M.G. et al. Bacterial populations active in metabolism of C1 compounds in the sediment of Lake Washington a freshwater lake. Appl. Environ. Microbiol. 2005. 71: 6885-6899
14. Kalyuzhnaya M.G., Lidstrom M.E., Chistoserdova L. Real-time detection of actively metabolizing microbes by redox sensing as applied to methylotroph populations in Lake Washington. ISME J. 2008. 2: 1029-1034.
15. Kalyuhznaya M.G., Martens-Habbena W., Wang T. et al. Methylophilaceae link methanol oxidation to denitrification in freshwater lake sediment as suggested by stable isotope probing and pure culture analysis. Environ. Microbiol. Reports. 2009. 1(5): 385-392.
Поступила 25.07.2014
(Контактная информация: Шаравин Дмитрий Юрьевич - аспирант Лаборатории
водной микробиологии Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН; адрес: 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13; тел. 89024772024; e-mail: [email protected])
