CC BY
34
УДК 579.64: 579.84
КОНСЕРВАТИВНЫЕ И ВАРИАБЕЛЬНЫЕ УЧАСТКИ ГЕНА МЕТАНОЛДЕГИДРОГЕНАЗЫ У ГАЛОТОЛЕРАНТНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА METHYLOPHAGA
Д. Ю. Шаравин, А. П. Соломенный
Шаравин Дмитрий Юрьевич, инженер лаборатории водной микробиологии, Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН (Пермь), кандидат биологических наук. E-mail: [email protected]
Соломенный Александр Петрович, старший научный сотрудник лаборатории водной микробиологии, Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН (Пермь), кандидат биологических наук. E-mail: [email protected]
В работе изучены консервативные и вариабельные участки в структуре гена mxaF и транслированной аминокислотной последовательности у выделенного из микробно-растительной ассоциации галотолерантного метилотрофного изолята М1К, отнесённого к роду Methylophaga. В ходе проведённого исследования с использованием метода минимума эволюции обнаружена гетерогенность mxaF среди исследованных родов метило- и ме-танотрофов. Высокая солеустойчивость и зафиксированная способность синтезировать ауксин из L-триптофана делает штамм М1К перспективным для использования в агротехнологии. Ключевые слова: галотолерантность, метилотрофы, метано-трофы, фитосимбиоз, микроэволюция.
DOI: 10.18500/1816-9775-2017-17-4-452-457 Введение
Бактерии, использующие окисленные производные метана (метанол и метиламин) в качестве источников углерода и энергии, играют глобальную роль в круговороте Cj-соединений [1]. Некоторые из них способны фиксировать молекулярный азот, синтезировать фитогормоны, осмопротекторы и рассматриваются в качестве перспективных объектов биотехнологии. Фито-симбиотические метилобактерии, колонизируя поверхность и внутренние ткани растений, могут оказывать положительное влияние на рост, развитие и продуктивность культурных растений [1, 2]. Метилотрофные микроорганизмы окисляют метанол до формальдегида при помощи фермента метанолдегидрогеназы (МДГ), который представляет собой тетрамер, состоящий из двух больших и двух малых субъединиц, двух молекул пирролохинолинхинона (PQQ) и одного иона Ca2+. Ген mxaF кодирует большую а-субъединицу МДГ, считается, что последовательность mxaF достаточно консервативна среди протеобактерий и может отражать их филогенетическое родство, подобно гену 16S рРНК [3, 4].
Род Methylophaga (класс Gammaproteo-bacteria, порядок Thiotrichales, семейство Pisciric-kettsiaceae) был первоначально описан группой исследователей [5] на основании изучения двух морских метанол-утилизирующих видов M. marina и M. thalassica и к настоящему времени насчитывает десять видов. Представители рода существенно отличаются от остальных метило-трофов низким содержанием Г+Ц в тотальной ДНК (большинство укладывается в диапазон 43-46 мол.%), тогда как содержание Г+Ц пар у метилотрофов из класса Alphaproteobacteria находится в диапазоне 54-72 мол.%, метилотрофов Betaproteobacteria - 50-69 мол.%, а метилотрофы класса Gammaproteobacteria, за исключением рода Methylophaga, имеют содержание Г+Ц 58-69 мол.%. Почти все представители рода Methylophaga способны выдержать концентрацию NaCl 10%, а некоторые до 20%, что достаточно редко встречается среди метилобактерий
[3, 6].
Цель данной работы - изучение гетерогенности структуры МДГ у галотолерантных мети-лотрофных представителей рода Methylophaga.
Материалы и методы
Объектом исследования являлся галото-лерантный метилотрофный штамм М1К, изолированный из ризосферы солеустойчивого растения Suaedaprostrata Pall., в районе Верхнекамского месторождения калийно-магниевых солей (г. Соликамск, Пермский край, сентябрь 2012 г.). Изолят культивировался на жидкой среде «К» с добавлением 5% NaCl и 1% метанола в качестве субстрата [3]. Способность штамма М1К синтезировать индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) определена при помощи реактива Сальковского после добавления в культураль-ную среду L-триптофана, измерения осуществляли в 3-5-кратной повторности [7].
С помощью ПЦР амплифицирована последовательность гена 16S рРНК со стандартными праймерами [8]. Путём компьютерного геномного анализа удалось определить специфичный фрагмент гена mxaF, подобрать фланкирующие последовательности, при-
годные в качестве праймеров (MFGmxa2-f 5'-GGAACGAAACCATGCGTCCTGG и MFGmxa2-r 5'-CCCTGGTTGTGGAAACCCAT) и амплифицировать вариабельный фрагмент размером 368 пн.
Сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей mxaF проводили с помощью компьютерной программы MEGA 6.0. Диаграммы построены методом минимума эволюции, показатель достоверности определен на основании анализа 1000 альтернативных деревьев. В качестве внегрупповых видов представлены метанотрофы (Methylomonas paludis DSM 24973T,Methylomarinum vadi T2-1T, Methylococcus capsulatus BathT, Methylohalobius crimeensis 10KiT, Methylomicrobium alcaliphilum 20ZT, Methylomicrobium japanense NIT, Methylomicrobium buryatense 5GT), содержащие
mxaF и филогенетически близкие представителям рода Methylophaga.
Результаты и их обсуждение
Характеристика штамма М1К приведена в таблице в сравнении с другими представителями рода Methylophaga. По основным параметрам штамм М1К схож с представителями рода Methylophaga (морфология клетки, допустимое содержание солей в среде культивирования, оптимальная температура роста, состав клеточных жирных кислот), но отличается по диапазону рН и спектру ростовых субстратов. В эксперименте по оценке синтеза ИУК содержание ауксина в культуральной жидкости достигало 10 мкг/ мл, что является типичным для непатогенных фитосимбиотических метилотрофных микроорганизмов [9].
Дифференциальные характеристики штамма М1К (данные этого исследования) и штаммов родственных видов рода Methylophaga. 1, MIK; 2, M. nitratireducenticrescens JAM1T [6]; 3, M. frappieri JAM7T [6]; 4, M. alcalica M39T [10]; 5, M. aminisulfidivorans MPT [11]; 6, M. lonarensis MPLT [12]; 7, M. muralis Kr3T [13]
Параметр 1 2 3 4 5 6 7
Размер клетки, мкм 0,6-0,8х 0,9-1,3 0,6x1,5 0,7x1,5 0,6-0,8x 1,4-2,8 0,2-0,4x 0,8-1,2 1,2-2,0x 0,2 0,7x 1,7-2,0
Подвижность + + + + - + +
Диап. №01, % 0,5-10,0 0,5-8,0 0,5-8,0 0,05-10,0 1,5-9,0 0,05-10,0 0,3-20,0
Оптим. №аС1 , % 3,0 3,0 3,0 3-4 3,0 0,5-2,0 3,0-9,0
Диап. рН 7,0-9,0 6,0-11,0 6,0-11,0 7,0-11,0 6,0-8,0 7,0-10,0 6,0-11,0
Оптим. рН 8,0 8,0 8,0 9,0-9,5 6,8-7,0 9,0-10,0 8,0-9,0
Темп. диап., °С 15-37 15-37 15-37 4-35 20-37 20-37 0-42
Оптим. темп., °С 25 30 34 25-29 30 28-30 20-32
Восст. нитратов - + - + + + +
Метанол 1% + + + + + + +
Метанол 2% + н.д. н.д. н.д. н.д. н.д. +
Метиламин ± - - + + - +
Диметиламин ± н.д. н.д. н.д. + н.д. н.д.
Триметиламин - н.д. н.д. н.д. + н.д. +
Доминирующие ЖК C 16:0' C C16:1, C 18:1 C, 16:0 C C16:1, C 18:1 C, 16:0 C C 16:1 C 18:1 C, 16:0 C C 16:1 C 18:1 C 16:0 C 16:1 C 16:0 C C16:1, C 18:1 C 16:0 C 4 16:1 C 18:1
Примечание. н.д. - нет данных.
BLAST анализ фрагмента последовательности гена 16S рРНК (1406 пн) показал, что штамм M1K имеет 98,3-98,7% сходства с группой некультивируемых представителей рода Methylophaga и обладает наибольшим сходством (98,3%) с Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1T (GenBank № CP003390). Последовательность гена mxaF у штамма M1K обладает высокой степенью сходства (97,6%) с M. nitratireducenticrescens JAM1T, 90,4% - с
M. frappieri 1АМ7Т и 85.3% - с M. lonarensis МРЬТ. Нуклеотидные последовательности генов 168 рРНК и mxaF штамма М1К депонированы в базе данных GenBank под номерами КМ192265 и КТ728194 соответственно.
Кластирование последовательностей генов 168 рРНК и mxaF (рис. 1) обнаружило группирование пар между штаммами М1К и 1АМ1Т вида M. nitratireducenticrescens, а также между M. aminisulfidivorans МРТ и M. Лю-
oxydans DMS010T. Обнаруженная дивергенция M. lonarensis MPLT совпадает в обоих построениях. Полученные диаграммы в целом сходны по порядку объединения в кластеры, однако наблюдаются расхождения в положении M. alcalica M39T и M. frappieri JAM7T, что отличает филограммы, построенные с использо-
100
95
100
92
58 91
45
54
100
ванием алгоритма минимальнои эволюции от графов, построенных с применением метода максимального правдоподобия, когда кластеризация последовательностей генов mxaF и 16Б рРНК происходила идентично. Это позволяет корректно обсуждать параметры эволюционной изменчивости гена mxaF.
~ Methylophaga nitratireducenticrescens М1К (КМ192265) — Methylophaga nitratireducenticrescens ММ1т (СР003390) -Methylophaga alcalica М39т (ДР384373)
-Methylophaga frappieri JAM7T (CP003380)
-Methylophaga thiooxydans DMS010T (DQ660915)
-Methylophaga aminisulfidivorans MPT (NR043871)
-Methylophaga lonarensis MPLT (JF330773)
■ Methylomarinum vadi T2-1T (AB453958)
100
97
— Methylomonas paludis DSM 24973 (HE801216)
- Methylomicrobium buryatense 5GT (AF096092)
■ Methylomicrobium alcaliphilum 20ZT (N R 074649)
Methylomicrobium japanense NIT (NR 043450) ■ Methylococcus capsulatus BathT (AE017282)
-Methylohalobius crimeensis 10KiT (AJ581837)
0.01
100
87
79
85
99
CM
88
89
57
Methylophaga nitratireducenticrescens M1K (KT728194) Methylophaga nitratireducenticrescensJAM1T (CP003390)
-Methylophaga frappieri JAM7T (CP003380)
-Methylophaga aminisulfidivorans MPT (EF378629)
-Methylophaga thiooxydans DMS010T (EU001860)
-Methylophaga alcalica M39T (EU001862)
■ Methylophaga lonarensis MPLT (JF795948)
-Methylomonas paludisDSM 24973T (HE801218)
-Methylohalobius crimeensis 10KiT (NZ ATXB01000001)
66
■ Methylococcus capsulatus BathT (U70511)
82
0.05
" Methylomarinum vadi T2-1 (AB453967) 100 Г- Methylomicrobium alcaliphilum 20ZT (F0082060) '— Methylomicrobium japanense NI T (AB432885)
-Methylomicrobium buryatense 5GT (NZ KB455575)
б
Рис. 1. Диаграммы филогенетического родства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК (а) и mxaF (б) представителей семейства Methylophaga. Масштаб эволюционных расстояний отражает количество замен на один нуклеотид. Цифрами показаны значения bootstrap. В качестве внегрупповых использованы последовательности метанотрофов родов Methylomonas, Methylomarinum, Methylococcus, Methylomicrobium и Methylohalobius
Масштабы дивергенции в пределах рода Methylophaga соответствуют совокупному разбросу изменений в последовательности гена mxaF для умеренных галофильных метанотрофов, принадлежащих к пяти родам, что может считаться предпосылкой для выделения не-
скольких новых родов из состава Methylophaga.
Выравнивание аминокислотных последовательностей фрагмента а-субъединицы МДГ с последовательностями родственных видов показало, что в исследованной области участки, ответственные за связывание полипептида с кофактором
а
PQQ и ионом Ca2+ (Asp 30 (позиция D30 на рис. 2), Arg 58 (R58), Asn 124 (N124)), расположены в консервативных областях [14]. Однако прослеживаются участки длиной до 3-4 аминокислот, имеющие существенные различия среди рассматриваемых представителей рода Methylophaga (A12-D13, K43-K46, V85-K87, F101-S102), причём здесь представлены замены полярных аминокислот на неполярные. Вариативные позиции в виде одиночных аминокислотных замен выявляются также и вблизи консервативных участков, что при росте дивергенции может сказаться на
ферментативной активности МДГ. При сравнении результатов, полученных в работе Graziano и Merlino, устойчивых корреляций в дипептидных заменах, выявленных авторами в аминокислотных последовательностях белков галотолерантных микроорганизмов, обнаружено не было [15]. Анализ нуклеотидной последовательности гена mxaF у исследованных метилотрофов обнаружил три-плетные вариации (даже в кодонах аминокислот, отвечающих за связывание с кофактором), однако благодаря вырожденности генетического кода не приведшие к замене аминокислот.
Рис. 2. Сравнение фрагмента аминокислотной последовательности а-субъединицы МДГ 1, M. nitratireducenticrescens M1K, полученной в данном исследовании (GenBank № AMK47902), с последовательностями близкородственных штаммов: 2,M. nitratireducenticrescens JAM1T (AFI83383); 3,M. frappieri JAM7T (AFJ03261); 4,M. alcalica M39T (ABS45565); 5, M. aminisulfidivorans MPT (ABN49105); 6,M. thiooxydans DMS010T (ABS45563); 7,M. lonarensis MPLT (AEG19447) и представителей внегрупповых видов: 8, Methylomonaspaludis DSM24973T (CCH22594); 9, Methylomarinum vadi T2-1T (BAH22848); 10,Methylococcus capsulatus BathT (AAC45563); 11, Methylohalobius crimeensis 10KiT (WP_022947522); 12, Methylomicrobium alcaliphilum 20ZT (CCE25111); 13,Methylomicrobium japanense NIT (BAG72174); 14,Methylomicrobium
buryatense 5GT (WP_017842117)
С учётом широкой распространённости засолённых экотопов, в которых обитают представители рода Methylophaga (солёные воды озёр и морей, умеренно-засолённые почвы), а также некоторой филогенетической дивергенции ключевого гена ^-метаболизма у данных метилобактерий можно полагать о достаточно длительном эволюционном пути адаптации к галотолерантности. Однако связать конкретные изменения в аминокислотной последовательности МДГ с солеустойчивостью среди рассматриваемых метилотрофов пока не удается в связи с малой величиной выборки в доступных базах данных. Дальнейшие полногеномные исследования представителей Methylophaga необходимы для таксономической верификации рода.
Таким образом, штамм М1К, изолированный из ризосферы галофитного растения, сочетает в себе достаточно высокую устойчивость к соли и способность к синтезу ИУК. Среди других способных вступать в микробно-рас-тительное взаимодействие метилотрофов (особенно представителей рода Methylobacteria, богатого на фитосимбионтов) едва ли найдутся виды, переносящие концентрации NaCl более 3%, что делает штамм М1К практически-перспективным. А знание особенностей структуры МДГ - важнейшего фермента метаболизма ростового субстрата у галотолерантных мети-лобактерий - позволит более избирательно подходить к отбору штаммов, имеющих потенциал для использования в агротехнологии.
Благодарности
Авторы выражают благодарность кандидату биологических наук Н. П. Ковалевской (лаборатория водной микробиологии, ИЭГМ УрО РАН).
Исследование выполнено при финансовой поддержке Комплексной программы Уральского отделения РАН (проект № 15-4-4-2).
Список литературы
1. Kutschera U. Plant-associated methylobacteria as co-evolved phytosymbionts // Plant Signaling & Behavior. 2007. Vol. 2. P. 74-78.
2. Фёдоров Д. Н., Доронина Н. В., Троценко Ю. А. Фитосимбиоз аэробных метилобактерий : новые факты и гипотезы // Микробиология. 2011. Т. 80, № 4. С. 435-446.
3. Троценко Ю. А., Доронина Н. В., Торгонская М. Л. Аэробные метилобактерии. Пущино : ОНТИ ПНЦ РАН, 2010. 325 с.
4. Lau E., Fisher M. C., Steudler P. A., Cavanaugh C. M. The methanol dehydrogenase gene mxaF, as a functional phylogenetic marker for proteobacterial methanotrophs in natural environments // PLOS ONE. 2013. Vol. 8. P. e56993.
5. JanvierM., Frehel C., Grimont F., Gasser F. Methylophaga marina gen. nov., sp. nov. and Methylophaga thalassica sp. nov., marine methylotrophs // Intern. J. Syst. Bacteriol. 1985. Vol. 35. P. 131-139.
6. Villeneuve C., Martineau C., Maufferey F., Villemur R. Methylophaga nitratireducenticrescens sp. nov. and Methylophaga frappieri sp. nov., isolated from the biofilm of the methanol-fed denitrification system treating the seawater at the Montreal Biodome // Intern. J. Syst. Evol. Micr. 2013. Vol. 63. P. 2216-2222.
7. Gordon S. A., Weber R. P. Colorimetric estimation of indole-acetic acid // Plant Physiol. 1951. Vol. 26. P. 192-195.
8. Lane D. J. 16S/23S rRNA sequencing // Nucleic acid techniques in bacterial systematic / eds. E. Stackebrandt, M. Goodfellow. N.Y. : Academic Press, 1991. P. 115-167.
9. Gogleva A. A., Kaparullina E. N., Doronina N. V., Trotsenko Y. A. Methylobacillus arboreus sp.nov. and Methylobacillus gramineus sp.nov., novel non-pigmented obligate methylotrophic bacteria associated with plants // Syst. Appl. Microbiol. 2011. Vol. 34. P. 477-481.
10. Doronina N. V., Darmaeva T. D., Trotsenko Y. A. Methylophaga alcalica sp. nov., a novel alkaliphilic and moderately halophilic, obligately methylotrophic bacterium from an East Mongolian saline soda lake // Intern. J. Syst. Evol. Micr. 2003. Vol. 53. P. 223-229.
11. Kim H. G., Doronina N. V., Trotsenko Y. A., Kim S. W. Methylophaga aminisulfidivorans sp. nov., a restricted facultatively methylotrophic marine bacterium // Intern. J. Syst. Evol. Micr. 2007. Vol. 57. P. 20962101.
12. Antony C. P., Doronina N. V., Boden R., Trotsenko Y. A., Shouche Y. S., Murrell J. C. Methylophaga lonarensis sp. nov., a moderately haloalkaliphilic methylotroph isolated from the soda lake sediments of a meteorite impact crater // Intern. J. Syst. Evol. Micr. 2012. Vol. 62. P. 16131618.
13. Доронина Н. В., Ли Ц. Д., Иванова Е. Г., Троценко Ю. А. Methylophaga murata sp. nov. - галоалка-лофильный аэробный метилотроф из разрушающегося мрамора // Микробиология. 2005. Т. 74, № 4. С. 511-519.
14. Jeong J. H, Kim S. W., Yoon S. M., Park J. K., Lee J. S. Characterization of the conserved region of the mxaF gene that encodes the large subunit of the methanol dehydrogenase from a marine methylotrophic bacterium // Mol. Cells. 2002. Vol. 13, № 3. P. 369-376.
15. Graziano G., Merlino A. Molecular bases of protein halotolerance // Biochim. et Biophys. Acta. 2014. Vol. 1844, № 4. P. 850-858.
Conserved and Variable Regions of the Methanol Dehydrogenase Gene Among Halotolerant Representatives of Methylophaga Genus
D. Yu. Sharavin, A. P. Solomennyi
Dmitry Yu. Sharavin, ORCID 0000-0003-3962-8164, Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences, 13, Goleva Str., Perm, 614081, Russia, [email protected]
Aleksandr P. Solomennyi, ORCID 0000-0002-5234-7829, Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian
Academy of Sciences, 13, Goleva Str., Perm, 614081, Russia, [email protected]
We investigated conserved and variable regions of the mxaF gene and amino acid sequence in methylotrophic strain M1K isolated from saline soil rhizosphere and belonging to Methylophaga genus. The significant heterogeneity was revealed in methano- and methylotrophic bacteria by method of Minimum Evolution. The ability of strain to influence indole-3-acetic acid synthesis from L-tryptophan and halotolerance are the arguments in favor of application in new agrotechnology.
Key words: halotolerance, methylotrophic bacteria, methanotrophic bacteria, phytosymbiosis, microevolution.
Образец для цитирования:
Шаравин Д. Ю., Соломенный А. П. Консервативные и вариабельные участки гена метанолдегидрогеназы у галото-лерантных представителей рода Methylophaga // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2017. Т. 17, вып. 4. С. 452-457. DOI: 10.18500/1816-9775-2017-17-4-452-457.
dte this article as:
Sharavin D. Y., Solomennyi A. P. Conserved and Variable Regions of the Methanol Dehydrogenase Gene Among Halotolerant Representatives of Methylophaga Genus. Izv. Saratov Univ. (N.S.), Ser. Chemistry. Biology. Ecology, 2017, vol. 17, iss. 4, pp. 452-457 (in Russian). DOI: 10.18500/1816-9775-2017-17-4-452-457.
