CC BY
25
удК 619:616-078:616.98
выделение атипичных микобактерий из биоматериала от лабораторных животных на модифицированной питательной среде
Л.А. ТАЛЛЕР, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник
Г.М. дЮсЕНоВА, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
Т.А. яНЧЕНКо, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных, ул. Лермонтова, 93, омск, 644001, Россия
E-mail: vniibtg@rambler.ru
Резюме. Исследования проводили для изучения возможности и целесообразности использования модифицированной питательной среды для ускоренного выделения микобактерий на биоматериале от лабораторных животных, зараженных «атипичными» культурами. Работа выполнена на морских свинках, которых заражали культурами микобактерий, принадлежащих к III (Mycobacteriae intracellularae) и IV (Mycobacteriae smegmatis+Mycobacteriae phlei) группам по классификации Ра-ньона, и исследовали бактериологическим методом на 14,28,45, 60 сут. после инфицирования. Биоматериал отживотныхвысевали на два варианта питательной среды Левенштейна-йенсена: в оригинальной прописи (контроль) и с фитодобавкой. Информативность используемых плотных питательных сред оценивали по скорости и интенсивности роста колоний. Модифицированная питательная среда с фитодобавкой значительно превосходила общепринятую по всем анализируемым показателям. При исследовании биоматериала от морских свинок, зараженных атипичными микобактериями III группы по классификации Раньона, исходные культуры выделялись на обоих средах на протяжении всего эксперимента (60 сут.). Высеваемость первичных культур на среде с фитодобавкой была на 28-30% выше, чем в контроле. В процессе роста интенсивность колоний на контрольной среде снижалась до 20-28%, а на экспериментальной оставалась высокой (около 68%), накопление бакмассы на модифицированной среде также происходило активнее и оценивалось в 4-5 баллов. Из биоматериала от морских свинок, зараженных смешанной культурой атипичных микобактерий IV группы по классификации Раньона, исходных культур не было выделено ни в одном случае. Возможно, это связано с ранней элиминацией микобактерий из организма. увеличение скорости роста и интенсивности накопления бакмассы позволяютзначительно повысить точность и сокра-тить сроки диагностики, не затрачивая больших экономических средств, в связи с низкой стоимостью компонентов фитодобавки, используемой для обогащения питательной среды. Ключевые слова: микобактерии туберкулеза, атипичные мико-бактерии, модифицированные питательные среды, фитопрепарат, лабораторные животные.
Для цитирования: Таллер Л.А., дюсенова Г.М., янченко Т.А. Выделение атипичных микобактерий из биоматериала от лабо-раторныхживотных на модифицированной питательной среде // достижения науки и техники АПК. 2015. Т.29. №4. с. 56-57.
Эффективность лабораторной диагностики туберкулеза во многом зависит от качества используемых питательных сред, многие из которых далеко не всегда соответствуют предъявляемым требованиям. Под влиянием постоянно меняющихся условий внешней среды, антибиотиков, дезинфектантов, гормональных препаратов происходят изменения в морфологии и метаболизме микобактерий. Возникают популяции с различными потребностями, которые необходимо учитывать при разработке новых питательных сред [1].
В последние годы большое внимание уделяется изучению добавок растительного происхождения в качестве стимуляторов роста бактерий. Например, с этой целью использовали вытяжки из золы древесины
березы [2, 3]; экстракт картофеля на геотермальной воде [4]; гумивит [5].
Цель представленных исследований - испытание модифицированной питательной среды для ускоренного выделения микобактерий на биоматериале от лабораторных животных, зараженных «атипичными» микобактериями III-IV группы по Раньону.
Условия, материалы и методы. Работа проведена на базе лаборатории эпизоотологии и мер борьбы с туберкулезом и лаборатории диагностических исследований ВНИИБТЖ.
Для постановки эксперимента были сформированы 3 группы морских свинок: I опытная - из 20 гол., зараженных суспензией культуры III группы по классификации Раньона (М.intracellularae) в дозе 30 мг/мл; II опытная - из 20 гол., зараженных суспензией смесью культур IV группы по классификации Раньона (М. smegmatis + М. phlei) 1:1 в дозе 30 мг/мл; III опытная - из 4 гол. (интактные).
Убой, патологоанатомическое вскрытие, взятие биоматериала от животных для последующего бактериологического исследования проводили на 14, 28, 45, 60 сут. На каждую среду во все сроки осуществляли посев биоматериала взятого от 5 животных в 25 пробирок.
Биоматериал высевали на два варианта питательной среды Левенштейна-Йенсена: в оригинальной прописи (контроль) и с фитодобавкой. Добавка приготовлена из комплексного лекарственного препарата растительного происхождения и представляет собой 10%-ный водный экстракт, равномерно распределенный по поверхности скоса питательной среды перед посевом, в дозе 0,2-0,3 мл. Наблюдения за посевами осуществляли ежедневно в течение 3-4 недель.
Информативность применяемых плотных питательных сред оценивали по скорости появления «первичного» роста, начиная со дня посева, и «интенсивности роста» колоний - суммарное число колониеобразующих единиц (КОЕ) на всех пробирках, засеянных одним биоматериалом.
Интенсивность роста отмечали в баллах от 0 до 5 по следующей схеме: 0 - отсутствие видимого роста; 1 - единичные пылевидные колонии; 2 - в поле зрения до пяти мелких колоний или единичная крупная (12 мм); 3 - от 10 до 20 колоний или единичная крупная (2-5 мм); 4 - до 50 мелких колоний или несколько крупных (более 5 мм); 5 - сплошной рост.
результаты и обсуждение. Исследования по изучению диагностических характеристик экспериментальной питательной среды в отношении биоматериала от морских свинок, зараженных атипичными микобактериями III группы по Раньону, показали, что при посеве биоматериала, взятого на 14 сут. после начала опыта, на контрольной питательной среде рост культур отмечали на 10 сут. в 9 пробирках (36%) и оценивали в 1 балл. Первичный рост на среде с фитопрепаратом появился на сутки раньше в 16 пробирках (64%) и оценивался в 1,4 балла. На 14 сут. культивирования на контрольной среде рост наблюдали во всех пробирках и оценивали в 4 балла, на испытуемой среде также появились колонии в 100% случаев, при этом рост был более интенсивным - 5 баллов.
При посеве биоматериала на 28-е сут. проведения опыта на контрольной среде начало роста регистриро-
56
Достижения науки и техники АПК. 2015. Т 29. № 4
Таблица. характеристика роста М. ¡пиасе11и!агае на общепринятой и модифицированной питательных средах Левенштейна-Йенсена
Сроки исследования, сут. Контроль С фитопрепаратом
выделен-но культур высеваемость, % интенсивность роста (балл) выделено куль-тур высеваемость, % интенсивность роста (балл)
14 9/25 36/100 1/4 16/25 64/100 1,4/5
28 10/21 40/84 1/3 17/25 68/100 1/3,8
45 7/15 28/60 1,5/3 17/20 68/80 1/4,5
60 5/12 20/48 1/1 17/25 68/100 2/4
* - в числителе первичныи рост, в знаменателе интенсивный рост.
вали на 8 сут. в 10 пробирках (40%) и оценивали в 1 балл. На среде с фитопрепаратом в эти же сроки высевае-мость была выше, рост появился в 17 пробирках (68%) и оценивался тоже в 1 балл. На 13-е сут. на контрольной среде рост отмечали в 84% случаев, интенсивность его была равна 3 баллам, в то время как на среде с фитопрепаратом в этот срок рост наблюдали во всех пробирках (100%), а интенсивность его была равна 3,8 баллам.
На 45-е сут. проведения эксперимента при посеве биоматериалов на контрольную среду единичные колонии (1,5 балла) появились на 14-е сут. после посева только в 7 пробирках (28%). В эти же сроки интенсивность роста на испытуемой среде была аналогичной (1,5 балла), но высеваемость отмечали в 17 пробирках (68%). На 23-е сут. культивирования высеваемость на контрольной среде повысилась до 60%, интенсивность - до 3 баллов. На среде с фитопрепаратом величины этих показателей составили 80% и 4,5 балла соответственно.
При посеве биоматериала от морских свинок на 60-е сут. после заражения высеваемость на контрольной среде снизилась до 20%, интенсивность оценивали в 1 балл, на испытуемой среде они были равны 68% и 2 балла соответственно. По мере наблюдения за посевами высевае-
мость на контрольной среде повысилась до 48%, но интенсивность роста оставалась слабой - 1 балл. При этом на среде с фитопрепаратом высеваемость отмечали во всех 25 пробирках (100 %), а интенсивность соответствовала 4 баллам.
При посеве биоматериала от морских свинок, зараженных суспензией M.phlei + M.smegmatis (1:1), культур выделено не было, что, возможно, связано с ранней элиминацией микобактерий из организма. При посеве биоматериала от интактных морских свинок рост также не отмечали.
выводы. Таким образом, при исследовании биоматериала от морских свинок, зараженных атипичными мико-бактериями III группы по классификации Раньона, исходные культуры выделялись на протяжении всего исследования, то есть в течение 60 сут. на обеих средах. Однако в варианте с фитопрепаратом среда оказалась более чувствительной и высеваемость на ней первичных культур в первые два срока наблюдения была выше, по сравнению с контролем, на 28%. По мере проведения опыта в следующие два срока на контрольной среде первичная высеваемость снижалась до 20-28%, а на экспериментальной оставалась высокой (около 68%), накопление бакмассы в опытном варианте также происходило активнее и оценивалось в 4-5 баллов.
Испытуемая модификация общепринятой питательной среды позволяет увеличить высеваемость микобактерий и способствует активному наращиванию бакмассы, что повышает эффективность бактериологической диагностики микобактериозов.
Литература.
1. Совершенствование лабораторной диагностики туберкулеза / В.А. Аникин, А.Е. Дитятков, С.И. Белоброва, Д.З. Агаев, Г.Н. Кожухарь//Ветеринарная патология. 2004. № 1/2. С. 30-32.
2. Использование жидкой питательной среды для культивирования патогенных штаммов микобактерий туберкулеза / А.С. Донченко, С.В. Ионина, Н.А. Донченко, В.Н. Донченко // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 2009. № 8. С. 60-63.
3. Методы культивирования микобактерий туберкулеза / А.С. Донченко, С.В. Ионина, Н.А. Донченко, В.Н. Донченко // Аграрная наука - сельскохозяйственному производству Монголии, Сибири и Казахстана: Сб. научных докладов XIII Международной научно-практической конференции (Новосибирск, 6-7 июня 2010). Улан-Батор: Изд-во ИНЦ ГНУ СибНСХБ Россель-хозакадемии, 2010. С. 65-70.
4. Совершенствование питательных сред для бактериологической диагностики туберкулеза / Р.А. Нуратинов, З.А. Казиах-медов, А.Х. Найманов, Н.П. Овдиенко //Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных: материалы междунар. науч.-практ. конф. Москва: Изографъ, 2006. С. 303-305.
5. Патент РФ №2315812. МПК2006119562/13Питательная среда для выделения из биологического материала и культивирования микобактерий/Слинина К.Н., ЛазовскаяА.Л., Воробьева З.Г., Кульчицкая М.А. заявл. 05.06.2006; опубл. 27.01.2008 Бюл. № 3.
ISOLATION OF ATYPICAL MYCOBACTERIA FROM BIOMATERIAL FROM LABORATORY ANIMALS
ON MODIFIED NuTRIENT MEDIuM
L.A. Taller, G.M. Dyusenova, T.A. Janchenko
All-Russian Research Institute of brucellosis and tuberculosis of animals, Lermontov str., 93, Omsk, 644001, Russia Summary. The investigations were carry out to study the possibility and appropriateness of the application of modified nutrient medium for rapid isolation of mycobacteria from the biomaterial from laboratory animals, infected with «atypical» cultures. We investigated guinea pigs, which were infected by mycobacteria cultures belonging to III (Mycobacteriae intracellularae) and IV (Mycobacteriae smegmatis + Mycobacteriae phlei) groups according to the classification of Runyon. The animals were examined by bacteriological method on 14, 28, 45, 60 days after the infection. The biomaterial from animals was plated on two variants of culture media: Lowenstein-Jensen in the original recipe (control) and Lowenstein-Jensen with the addition of phytonutrients. The information value of the used solid nutrition mediums was evaluated by the speed and intensity of growth of the colonies. The modified growth medium with phytonutrients considerably surpassed the standard one in all analyzed parameters. During the study of biomaterial from guinea pigs, infected by atypical mycobacteria of III group on the classification of Runyon, the initial cultures were isolated on both mediums during the whole experiment (60 days). The inoculation of primary cultures at medium with phytonutrients was higher on 28...30 % as compared with the control. During the growth the intensity of colonies on the control medium reduced to 20...28 %, and on the experimental one it remained high (about 68 %); the accumulation of bacterial mass was also more active and was estimated at 4.5 points. The original cultures were not isolated from biomaterial from guinea pigs, infected by mixed culture of atypical mycobacteria of IV group according to the classification of Runyon. Perhaps, this is connected to the early elimination of mycobacteria from the organism. The increase rate of growth and intensity of accumulation of bacterial mass enable to significantly improve the accuracy and to reduce the time of diagnosis, without expending large economic means, due to the low cost of the components of the phytonutrient, used for the enrichment of modified medium. Keywords: mycobacterium tuberculosis, atypical mycobacteria, modified culture medium, herbal remedies, laboratory animals. Author Details: L.A. Taller, Cand. Sc. (Vet.), Senior Researcher (e-mail: vniibtg@rambler.ru); G.M. Dyusenova, Cand. Sc. (Biol.), Senior Researcher; T.A. Janchenko, Cand. Sc. (Biol.), Senior Researcher.
For citation: Taller L.A., Dyusenova G.M., Janchenko T.A. Isolation of atypical mycobacteria from biomaterial from laboratory animals on modified nutrient medium. Dostizheniya naukii tekhnikiAPK. 2015. T.29. №4. pp. 56-57 (In Russ)
Достижения науки и техники АПК. 2015. Т. 29. № 4
57
