CC BY
62
Таблица 3. Результаты иммунологических исследований коров, реагиро вавших положительно в РНГА
Порядковый номер коров Результаты исследования Выделена культура
сыворотки крови молока
РА (МЕ) РСК - S РНГА РИД КР РНГА ПЦР
1 - 1:20 1:800 + 1:2 1:100 + -
2 50 1:10 1:800 + - 1:50 + -
3 - 1:10 1:100 - - - + н/и
А 100 1:80 1:800 + 1:8 1:800 + +
б - 1:10 - - - 1:50 + н/и
При исследовании методом ПЦР генетический материал микроорганизмов рода Brucella был обнаружен в образцах молока от всех коров, что подтверждает достоверность результатов РНГА с молоком и доказывает эпизоотическую опасность животных, положительно реагирующих с испытуемым бруцеллезным эритроцитарным антигеном.
Выводы. РНГА с молоком с новым эритроцитарным бруцеллезным диагностикумом - специфичная реакция, на показания которой не влияют заболевания лактирующих коров маститами в клинической и субклинической формах. Тест можно использовать при обследовании коров на бруцеллезную инфекцию в любом физиологическом состоянии.
Диагностическим титром РНГА при исследовании молока от коров из благополучных по бруцеллезу хо-
зяйств целесообразно считать разведение 1:100, в котором произошла гемагглютинация эритроцитов с оценкой реакции три и четыре креста.
В связи с низкой долей животных, реагирующих в РНГА с молоком в титре 1:50 в благополучных по бруцеллезу хозяйствах, мы считаем целесообразным при оздоровлении неблагополучных стад оценивать их как больных бруцеллезом.
Животные, реагирующие в РНГА с молоком с новым бруцеллезным эритроцитарным антигеном, представляют эпизоотическую опасность, о чем свидетельствует положительная биопроба на морских свинках с изоляцией культуры бруцелл и ПЦР с помощью выделения у 100,0 % коров ДНК рода Brucella.
РНГА с молоком целесообразно применять при контроле эпизоотической обстановки по бруцеллезу и оздоровлении неблагополучных хозяйств через 1 месяц и последующие сроки после иммунизации коров вакциной из штамма B. abortus 82.
Литература.
1. КосиловИ.А., АракелянП.К, ДимовС.К.,ХлыстуновА.Г. Бруцеллезсельскохозяйственныхживотных/Новосибирск, 1999. -344с.
2. Логинов, Ф.С. Быстрый метод обнаружения бруцеллезныхагглютининов в молоке коров//Ветеринария. - 1978. - №6. - С. 50-51.
3. Лазарев Н.П. Кольцевая реакция с молоком и сывороткой крови для диагностики бруцеллеза // Ветеринарии.. - 1968.
- № 4. - С. 98-99.
4. Морякова О.И., Касьянов А.Н. Рациональная техника постановки кольцевой реакции при массовых исследованиях молока на бруцелле // Тр. ВИЭВ. - Москва, 1961. - Т. 26. - С. 348-351.
5. Косилов И.А., Димов С.К., Дегтяренко Л.В. Диагностическая эффективность кольцевой реакции с молоком при бруцеллезе у коров, привитых вакциной из штамма 82//Вопр. эпизоотологии, диагностики и мероприятия по ликвидации туберкулеза и бруцеллеза животных. - Новосибирск,1987. - №1. - С.87-91.
6. Гольцов А.С. Кольцевая реакция с молоком при ранней диагностике бруцеллеза у коров, реиммунизированных вакциной из штамма 82 // Пути совершенствования профилактики и диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных.
- 0мск,1990. - С. 39-42.
7. Дегтяренко Л.В., Ощепков В.Г., Димов С.К., Димова А.С. Концептуальная схема оптимизации диагностики болезней, вызываемых у животных бруцеллами, и результаты ее практической реализации // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. - 2005. - №1. - С. 84-90.
8. Инструкция по применению набора для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). - Москва, 2006. - 11с.
IHA TEST wITH MILK IN THE DIFFERENTIAL PoSTVAccINATIoN DIAGNoSIS BRucELLoSIS OATTLE L.V. Degtyarenko, M.Y. Karlova, o.D. Sklarov, N.F. Khatko .
Summary. The studies were conducted to study the feasibility of applying the new formulation in erythrocyte diagnosticum for conduction of RIGA with milk of cattle immunized with a vaccine prepared from strain antibrucellar B. abortus 82. There was revealed in a study of 196 cows with mastitis breast diseases in clinical and subclinical form that RIGA with milk is specific reaction, since there was get negative results. The study of milk in RIGA from 69 cows on deep in calf on brucellosis infection also was showed the possibility of applying the test for diagnostic studies. The feasibility of using RIGA with milk in the control of epizootic situation of brucellosis and rehabilitation of disadvantaged farms in 1 month and subsequent periods after immunization of cows vaccine strain of B.abortus in the survey found 82 cows in 2694 and 1643 favored animals with brucellosis disadvantaged farms. In the prosperous farms of cows found to be negative RIGA with milk, a dysfunctional antibodies in milk was determined in 0,6-14,4% of cows. There was set a higher sensitivity compared to RIGA and RT with milk in the study of milk from cows in 1643 unfortunate of brucellosis herds, there was reacted respectively 2.4 and 1.9% animal, and the testimony of the RT and RIGA with milk coincided in 83.9% of cases. In some disadvantaged brucellosis herd of cows in the percentage of reacting with RIGA milk ranged from 0.2 to 5.1%. The credibility of RIGA with milk in the study of cows disadvantaged farms with brucellosis confirmed by conducting serology complex RA + RCF + RIGA + RID, bacteriological and PCR techniques.
Key words: cattle, brucellosis, vaccines, immunizations, diagnosis, antigens, antibodies.
УДК 619:616-074:616.982.2+636.22/.28
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНОй ДИАГНОСТИКИ туберкулёза крупного рогатого скота
Л.А. ТАЛЛЕР, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник
В.Г. ОЩЕПКОВ, доктор ветеринарных наук, главный научный сотрудник
Е.Ю. СЕКИН, кандидат ветеринарных наук, зав. лабораторией
Т.А. ЯНЧЕНКО, младший научный сотрудник
А.Д. СЛЕПЧЕНКО, младший научный сотрудник ВНИИ бруцеллеза и туберкулеза животных Рос-сельхозакадемии
E-mail: vniibtg@rambler.ru
Резюме. Исследования проводили с целью разработки комбинированного метода ускоренной бактериальной диагностики туберкулеза с использованием модифицированных
питательных сред и высокочувствительного бактериального теста - полимеразной цепной реакции (ПЦР), названного «культурально-генетическим», и сравнения его эффективности с традиционными методами.
Микобактерии туберкулеза высевали на модифицированные питательные среды СФД-1 и СФД-2, содержащие фитостимуляторы роста патогенных и атипичных микобактерий. В ПЦР использовали тест-систему «МТБ-КОМ».
Производственное испытание проводили в Омской, Новосибирской, Тюменской областях и Краснодарском крае в сопоставлении с традиционными послеубойными методами диагностики: патологоанатомическим, бактериологическим и биологическим, предусмотренными в Наставлении по диагностике туберкулеза животных (2002 г.). Изучено 40 проб биоматериала от крупного рогатого скота, в том числе 12, имеющих характерные для туберкулеза некротические очаги (из неблагополучных по туберкулезу хозяйств), и 28 проб без патологических изменений (из благополучных хозяйств). Особенность предлагаемого метода в том, что «слепые» смывы физиологическим раствором с поверхности питательных сред СФД-1 и СФД-2 делали на 3 сутки культивирования посевов (когда еще нет видимого роста колоний) и исследовали их в ПЦР. При изучении культурально-генетическим методом 36 смывов с посевов, сделанных из 12 проб биоматериала с характерными некротическими очагами, во всех (100 %) были обнаружены возбудители туберкулеза, тогда как культуральным методом М. bovis выявлен всего в 8 пробах (66,6 %) и только на 20...40 сутки. Биологическим методом наличие возбудителя установлено в 100,0 % случаев, но лишь на 40.60 сутки. Результаты исследования 28 проб биоматериала, не имевшего патологических изменений всеми сравниваемыми методами были отрицательными.
Применение комбинированного культурально-генетического метода позволяет сократить сроки постановки диагноза, в сравнении с традиционными культуральным и биологическим методами, в 6-20 раз.
Ключевые слова: крупный рогатый скот, микобактерии туберкулёза, лабораторная диагностика, модифицированные питательные среды, ПЦР.
Современная и качественная лабораторная диагностика
- основа профилактических и оздоровительных мероприятий при туберкулёзе. Сегодня окончательный диагноз на туберкулёз можно поставить только на основании результатов бактериологического (культурального) и биологического (заражение лабораторных животных) исследований. Эти методы трудоёмки и длительны. В связи с тем, что возбудители туберкулеза - медленнорастущие микроорганизмы (время репродукции популяции микробных клеток составляет 18.. .24 часа, тогда как у других бактерий это занимает несколько минут) на проведение всего комплекса исследований уходит от двух до трёх месяцев.
Сложность бактериологической диагностики усугубляется ещё и тем, что на фоне широкого, часто бессимптомного, применения химиопрепаратов, антибиотиков, дезинфектантов, а также под влиянием защитных сил макроорганизма происходят изменения в жизнедеятельности и метаболизме микобактерий. Их становится всё труднее выявлять в исследуемом биоматериале, в том числе и в органах с туберкулёзными изменениями [1, 6]. В связи с этим применяемые сейчас на практике методы лабораторной диагностики имеют ограничения и требуют усовершенствования.
В последние годы возможности лабораторной диагностики повышаются благодаря использованию высококачественных и информативных питательных сред, содержащих различные биологически активные добавки, которые оказывают стимулирующее действие на микобактериальные клетки, а также молекулярно-генетических методов, позволяющих значительно сократить время исследований и увеличить их чувствительность [2, 3].
Цель наших исследований - разработать альтернативный комбинированный метод ускоренной лабораторной диагностики туберкулеза (культуральногенетический) с использованием новых питательных сред и высокочувствительного бактериального теста
- полимеразной цепной реакции (ПЦР), выявляющей в биоматериале даже единичные клетки возбудителя по их ДНК, и сравнить его с традиционными методами.
Условия, материалы и методы. Работа проведена на базе лабораторий клеточной биотехнологии и диагностических исследований ВНИИ бруцеллеза и туберкулеза животных. Биологический материал для исследований отбирали от крупного рогатого скота (40 гол.), положительно реагирующего на протеин-пурифиед-дериват-туберкулин (ППД-туберкулин) для млекопитающих, в том числе 12 проб от животных с характерными туберкулёзными поражениями из неблагополучных по этому заболеванию хозяйств (ООО «Восточное» Оконешниковского района, АГХ «Восток», ООО» Алексеевский» Горьковского района Омской области, ООО «Маяк» Чановского района Новосибирской области) и 28 проб от скота без патологических изменений из благополучных хозяйств (ОАО «Азовский» Азовского района, СПК «Дружба» Марьяновского района Омской области, СПК «Таволжан» Сладковского района Тюменской области, ОАО ПЗ «Урожай» Каневского района Краснодарского края).
Культуральное исследование проводили с использованием модификаций стандартных плотных питательных сред Левенштейна-Йенсена и Фаст-3Л. Для повышения высеваемости микобактерий туберкулёза из биоматериала их усовершенствовали путём включения биологически активных добавок растительного происхождения. Питательная среда СФД-1 [4], приготовленная на основе плотной яичной среды Фаст-3Л, дополнительно содержит 10 %-ный экстракт фитопрепарата «Люцевита», питательная среда СФД-2 [5] приготовлена путём добавления к среде Левенштейна-Йенсена 10 %-ного экстракта полыни. Это способствует повышению биохимической активности микобактерий и стимулирует потребление ими питательных веществ.
Идентификацию выделенных культур проводили общепринятыми культурально-биохимическими методами (рост при разных температурах - 220 С, 370 С,450
С, в темноте и на свету, на среде с салицилатом натрия и 5 %-ным хлоридом натрия).
Для сокращения сроков исследования применяли культурально-генетический метод (КГМ), разработанный во ВНИИ бруцеллеза и туберкулеза животных [7]. Он основан на сочетании культурального посева на модифицированные питательные среды (СФД-1 и СФД-2) и ПЦР с использованием тест-системы «МТБ-КОМ». В этом случае на 3...5 сут. культивирования, до появления видимого роста, было приготовлено 120 смывов (из 40 проб, культивируемых на 3 разных средах - Левенштейна-Йенсена, СФД-1, СФД-2), которые исследовали в ПЦР. В качестве дополнительного контрольного образца использовали суспензию из микробных клеток коллекционного патогенного штамма М. bovis 14.
Из каждого образца исследованного в ПЦР были приготовлены мазки, которые окрашивали по методу Циля-Нильсена и исследовали с помощью визуализированной системы Axiostarplus с микрофотографированием фирмы Carl Zeiss с целью определения наличия различных форм микобактерий.
Для подтверждения специфичности полученных результатов поставлена биологическая проба на морских свинках согласно Наставлению по диагностике туберкулеза животных (2002 п). Взвесью материала из каждой пробы использованной для посева на питательные среды заражали по 2 морские свинки в дозе 1 мл. подкожно в область паха.
Результаты и обсуждение. Изучение 36 смывов (образцов) с трех вариантов питательных сред, приготовленных на 3 сутки культивирования посевов из 12
Таблица. Результаты исследования биоматериала от крупного рогатого скота культурально-генети-
Комбинированный метод Традиционные методы
Характеристика Число положи- тельные* отрица- тельные культуральное исследование биологическая проба
биоматериала проб положи- отрица- тельные положи- отрица- тельные
число % число % тельные* тельные*
число % число % число % числЫ %
С характерными поражениями 12 S6 100,0 _ _ 8 66,6 4 33,4 12 100,0 _ _
Без характерных поражений 28 _ _ 84 100,0 28 100,0 __ 28 100,0
Культура M.bovis шт. 14 (контроль) 1 3 100,0 _ _ 1 100,0 _ _ 1 100,0 _ _
*выявлены микобактерии туберкулеза - М.Ьо^^ проб биоматериала с характерными туберкулезными поражениями, в ПЦР показало положительную реакцию во всех образцах (100,0 %).
Культуральным методом микобактерии туберкулеза были выделены только из 8 проб биоматериала (66,6 %) на 20.40 сут (см. табл.).
Биологическим методом на 24 морских свинкахтуберку-лез был подтвержден в 100 % случаев, но лишь на40.60 сут.
Изучение в ПЦР 84 смывов (образцов), полученных на третьи сутки культивирования с трех вариантов питательных сред 28 проб биоматериала из органов без туберкулезных поражений, дало отрицательный результат (отсутствие специфических полос в геле).
При культуральном исследовании рост M.bovis также не отмечали, но в одном случае выделены атипичные микобактерии IV группы по классификации Раньона. Биологическая проба на 56 морских свинках была отрицательной в 100 % случаев. При убое и вскрытии опытных животных патологических изменений туберкулезного характера в месте введения и в органах не обнаружены.
Исследование культуры M.bovis шт. 14, использованной в качестве контроля, культурально-генетическим и общепринятыми методами дало положительные результаты.
При микроскопическом изучении мазков обнаружены бактериальные формы как в виде типичных красных палочек, так и измененные - в виде шаровидных клеток, зернистых элементов, нитевидных структур, обладающих пониженной жизнеспособностью.
Выводы. На сегодняшний день метод полимеразной цепной реакции еще недостаточно адаптирован для исследования такого биоматериала, как кровь, лимфатические узлы и органы, поскольку они характеризуются низким содержанием микобактериальной ДНК. Повысить чувствительность метода можно путем более полного выявления ДНК микобактерий, что и достигается предварительным их подращиванием на специальных питательных средах в течение 3.5 суток.
Разработанный во ВНИИ бруцеллеза и туберкулеза животных культурально-генетический метод, основанный на использовании полимеразной цепной реакции в сочетании с предварительными посевами из биоматериала на модифицированные питательные среды (СФД-1, СФД-2), которые содержат в своём составе биологически активные добавки, ускоряющие рост микобактерий, можно использовать как дополнительный для ранней лабораторной диагностики туберкулёза. Проведённые исследования подтверждают, что приготовление, так называемых «слепых» смывов с поверхности ранее засеянных питательных сред, позволяет выделять микобактериальные клетки с разной степенью жизнеспособности, получать из них ДНК в необходимом для диагностически количестве и определять их видовую принадлежность в ПЦР
Предлагаемый метод даёт возможность не только значительно сократить сроки диагностики (в 6-20 раз), но и повысить её точность благодаря индикации микобактерий со слабой жизнеспособностью.
Литература.
1. Васильев В.Н. Микобактериозы и микозы лёгких//Медицина и физкультура. - София. - 1971. - С. 25 - 29.
2. Найманов А.Х., Овдиенко Н.П., Осипова Е.П. и др. ПЦР при диагностике туберкулёза крупного рогатого скота // Ветеринария. - 2004. - №10. - С. 19 - 23.
3. Нуратинов Р.А., Казиахмедов З.А., Найманов А.Х., Овдиенко Н.П. Совершенствование питательных сред для бактериологической диагностики туберкулёза. //Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных: материалы международной науч. - практ. конф. - М., 2006 - С. 303 - 308.
4. Патент РФ №2382076, С12Ы1/20С12Я1/32. Ощепков В.Г., Таллер Л.А., Панкратова А.Д., Вассимирская Т.А., Шевцов А.С. Питательная среда для культивирования микобактерий туберкулёза; заявка 28. 07.08г.; опубликовано 20.02.10. Бюл. №5.
5. Патент РФ №2242511, С12Ы1/2002122009/13. Питательная среда для выделения и культивирования L - форм микобактерий туберкулёза/ Ощепков В.Г., Таллер Л.А., Секин Е.Ю. заявл. 12. 08.2002; опубл. 20.12.2004 Бюл. №35.
6. Федосеев В.С., Рубцова И.Н., Байгазанов А.Н. Проблемы изменчивости микобактерий.// Сб. науч. тр. Совершенствование систем и методов в борьбе бруцеллёзом туберкулёзом животных. ВАСХНИЛ. ВНИИБТЖ. Новосибирск, 1987. - С. 82 - 84.
7. Методы ускоренного выявления типичных и изменённых (L-форм) микобактерий туберкулёза: метод. Рекомендации / сост. В.Г. Ощепков и др.: СО Россельхозакадемии. ГНУ ВНИИБТЖ. Омск, 2010.
improving the laboratory diagnosis of bovine tuberculosis
L.A. Taller, V.G. oshchepkov, E.Y. Sequin, T.A. Yanchenko, A.D. Slepchenko
Summary. The aim was to develop an alternative combined method of accelerated bacterial diagnosis of tuberculosis using new nutrient media and highly sensitive bacterial test - polymerase chain reaction (PCR), revealing a biological material, even single cells to the agent of its DNA and compare it with conventional methods. We used the modified culture medium SFD-1 and SFD-2 containing the growth of pathogenic fitostimulyatory and atypical mycobacteria to develop a combined method, called the «cultural-genetic». We used a test-system of «MTB-ROM» in the PCR. There was conducted production testing of the combined method on the basis of the Omsk, Novosibirsk and Tyumen regions and the Krasnodar Territory in relation to the traditional post-mortem diagnostic methods: pathological, bacteriological, biological, prescribed in the Manual on the diagnosis of the tuberculosis of animals (2002). There were examined 40 samples of biological material from cattle, including 12 from unfortunate farms of tuberculosis (necrotic foci characteristic for tuberculosis) and 28 samples from wealthy farms without pathological changes. The features of the application of culturally-genetic method was that on 3-rd day of cultivation of inoculations on nutrient media modified SFD-1 and SFD-2, with its surface (when there was no visible growth of colonies) did the so-called «blind» swabs with saline and examined its in the PCR test-system «MTB-ROM.» There were found agents of tuberculosis in the study of culture-genetic method of 36 swabs from the inoculations, made of 12 samples of biological material with the characteristic necrotic foci in all (100%) swabs, whereas in culture method there have been identified by mycobacteria of bovine species in all eight samples (66.6% ) for 20-40 days. There was found the presence of the pathogen in 100% of cases by biological method, but only 40-60 days. There were negative the results of the study 28 samples of biological material, that has no pathological changes, such as cultural-genetic as well as all the traditional methods.
It was thus, there was established that the use of combined cultural-genetic method can reduce the time of diagnosis in the 6-20 times compared to traditional cultural and biological methods.
Key words: cattle, Mycobacterium tuberculosis, laboratory diagnostics, modified culture media, PCR.
