CC BY
107
УДК 619:616.98:579.873.21 Т - 07
ПЛОТНЫЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА
Н.А. ДОНЧЕНКО, доктор ветеринарных наук, зам. директора
B. Н. ДОНЧЕНКО, кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник
C. В. ИОН И НА, научный сотрудник
Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока E-mail: gnu_vet@ngs.ru
Резюме. Представлены результаты исследований новой плотной питательной среды, в состав которой входит вытяжка из золы древесины березы (1,5 %) и оксидат торфа (1 %), позволяющей ускорить рост как эталонных, так и выделенных из биоматериала животных микобактерий туберкулеза.
Ключевые слова: питательная среда, туберкулез, биоматериал, микобактерии, оксидат торфа, зола древесины березы.
Первые искусственные питательные среды для культивирования микобактерий туберкулеза были разработаны Луи Пастером в 1859-1864 гг. и насыщены большим количеством ингредиентов. В их число входили источники углерода (органические кислоты, спирт или сахара), аммонийные соли и ряд зольных элементов.
До сих пор считается, что оптимальные условия для роста микобактерий туберкулеза создаются в жидких питательных средах, таких как среды Сотона, Школьниковой, Попеску, которые увеличивают долю ультрамелких форм микобактерий и активизируют их метаболизм. Однако частое загрязнение исследуемого биологического материала банальной микрофлорой значительно тормозит получение первой чистой генерации микобактерий при посеве на такие среды [1, 2, 3, 7, 8, 9, 10, 14].
Для бактериологической диагностики туберкулеза в ветеринарной практике чаще используются плотные питательные среды Гельберга, Левенштейна-Йенсена, Финн-2, «Новая» (Мордовского), Фаст-ЗЛ. Однако не все они обладают совершенным составом ингредиентов для эффективного роста микобактерий туберкулеза в оптимальные сроки. Подавляющее большинство этих плотных питательных сред трудоемки и дороги в приготовлении.
Один из путей модификации состава питательных сред - подбор новых компонентов, которые обладают стимулирующим или ингибирующим действием на микобактерии туберкулеза и банальную микрофлору. Кроме того, ингредиенты, входящие в питательные среды, должны быть дешевы и не дефицитны [11, 13].
Цель нашей работы - изучить свойства ингредиентов питательных сред, которые должны положительно влиять на скорость роста и частоту высевае-мости микобактерий при стабильности источника азотистого питания.
Условия, материалы и методы. В ИЭВСиДВ СО РАСХН была разработана новая плотная питательная среда «ИЭВСиДВ», состоящая из минерального комплекса - вытяжки из золы древесины березы 1,5 %-ной концентрации, в состав которой входят все необходимые для жизнедеятельности микобактерий туберкулеза макро- и микроэлементы, и биостимулятора роста - 0,1 %-ного оксидата торфа (табл. 1) [5]. Аналогом для ее изготовления служила плотная питательная среда Финн-2 [12].
Для сравнения диагностической информативности и эффективности питательных сред «ИЭВСиДВ» и Финн-2 были использованы эталонные трехнедельные штаммы следующих культур микобактерий M.bovis (шт. 8, ВИЭВ), М.tuberculosis (lut.H37Rv), M.smegmatis (культура ИЭВСиДВ) и М.avium (шт.780, ВИЭВ).
культур микобактерий, приготовленной по оптическому стандарту мутности - 500 млн кл/мл в количестве 0,5 мл в каждую пробирку. Сроки наблюдения составляли от 30 до 40 дней. До появления первичного роста пробирки просматривали каждый день, затем - 1...2 раза в неделю на протяжение опытов.
Кроме того, на экспериментальной базе ИЭВСиДВ был поставлен опыт на морских свинках. Для этой цели отобрали 15 животных с массой от 310 до 360 г. Морских свинок заражали подкожно в область паха суспензией, содержащей 0,001 мг трехнедельной культуры М.Ьо1//5 (шт. 8, ВИЭВ) в 1 мл стерильной дистиллированной воды. Также проводили посев лимфатических узлов 16-ти коров, реагирующих на введение ППД-туберкулина для млекопитающих, у которых при вскрытии обнаружены туберкулезные изменения в лимфатических узлах. Биологический ма-
Таблица 2. Скорость появления первичного и интенсивного роста различных видов микобактерий туберкулеза на плотных питательных средах, суг (М±ш)
Пита- тельная среда Вид микобактерий
M.bovis (шт. 8, ВИЭВ) М. tuberculosis (uim H37Rv) M.avium (шт.780, ВИЭВ)
переич- интенсивный ный первич- ный интенсив- ный первич- интенсивный ный
ИЭВСиДВ Финн-2 6,2±0,11 11,4±0,60 5,3±0,24 8,1±0,17 10,4±1,65 13,5±2,35 10,1 ±0,23 16,3±0,58 9,1±0,41 15,1±0,58 9,3±0,54 9,3±0,54
Посев осуществляли путем внесения суспензии Таблица 1. Спектральный анализ золы древесины березы
Показатель
Весна*
Лето
Осень
Зима
1,5%-ная вытяжка золы**
калии
Макро- и микроэлементы, г /кг натрий магний железо \ марганец медь цинк в зависимости от времени года
51,2±0,49 2,4±0,01 45,4±0,02 7,5±0,04 3,7±0,01
51 ±0,01 2,5±0,11 45,5±0,12 7,4±0,07 3,7±0,02
51,3±0,03 2,5±0,01 45,4±0,01 7,5 3,7±0,01
51,2±0,02 2,5±0,01 45,4±0,01 7,5±0,01 3,8±0,01
0,125
0,125
0,125
0,125
2,2
2,25
2,22±0,01
2,24±0,01
после автоклавирования
600±0,97 ЗЇЇ
45±1,03 Следы
0,01
С леды Следы Сл еды
"время года (п
концентрация
Таблица 3. Рост М.Ьомв (шт. 8, ВИЭВ) из биоматериала зараженных морских Финн-2 - на 9,1±0,41 сутки, свинок и крупного рогатого скота на плотных питательных средах, сут (M±m)
Питательная среда Животные
морские свинки крупный рогатый скот
появление | интенсивный появление | интенсивный
ИЭВСиДВ 10,5±0,34 13,2±0,53 16,6±0,57 19,5±0,86 Финн-2 14,6±0,25 23,7±0,48 21,4±0,90 25,3±0,93
М.ауіит (шт. 780, ВИЭВ) -соответственно на 10,4±1,65 и 9,3±0,54 сутки (табл. 2).
Появление роста культур М.Ьоуів (шт.8, ВИЭВ) из биоматериала морских свинок на плотной питательной среде «ИЭВСиДВ» отмечено на 10,5±0,34 сутки, а на среде Финн-2 - на 14,6±0,25 сутки (табл. 3).
Первичный рост микобактерий туберкулеза из биологического материала, полученного от крупного рогатого скота наблюдался соответственно на 16,6±0,57 и 21,4±0,90 сутки.
Выводы. Таким образом, замена всех ингредиентов солевого раствора среды Финн-2 минеральным комплексом из вытяжки золы древесины березы с добавлением биостимулятора (оксидат торфа), позволили создать новую питательную среду «ИЭВСиДВ» для получения ускоренного роста микобактерий туберкулеза из биоматериала больных этим заболеванием животных.
териал, взятый от зараженных морских свинок, а также крупного рогатого скота, обрабатывали методом А.П. Аликаевой [6] и модифицированным методом с использованием принципа седиментации [4].
Результаты и обсуждение. Анализ результатов скорости появления и интенсивности роста эталонных штаммов, а также микобактерий туберкулеза из биологического материала лабораторных животных (морские свинки) и крупного рогатого скота показал, что состав среды «ИЭВСиДВ» оптимален для их эффективного культивирования. Так, рост M.bovis появляется на ней на 6,2±0,11 сутки, а на среде Финн-2 - на 10,1±0,23 сутки. Рост M.tuberculosis отмечен на среде «ИЭВСиДВ» на 5,3±0,24 сутки,
Литература.
1. Батуро А.П. Сравнительное изучение некоторых элективных питательных сред // Проблемы туберкулеза. - 1962.
- № 3. - С. 56 - 58.
2. Варенко Ю.С., Ластков О.А., Бескровный П.С. Способ ускорения выращивания микобактерий туберкулеза // Лабораторное дело. - 1980. - № 1. - С. 45 - 48.
3. Голышевская В.И., Попеску Т.Т. Совершенствование микробиологической диагностики туберкулеза // Проблемы туберкулеза. - 1989. - № 10. - С. 38 - 40.
4. Донченко А.С., Донченко В.Н. Туберкулез крупного рогатого скота, верблюдов, яков, овец и пантовых оленей. -Новосибирск: Изд - во РАСХН. Сиб. отд - ние, 1994. - 354 с.
5. Донченко А.С., Донченко В.Н, Донченко Н.А., Ионина С.В. Среда для культивирования микобактерий туберкулеза.
Патент № 2192472 от 20.10.2000.
6. Животные и птицы сельскохозяйственные ГОСТ 26072-89 (СТ СЭВ 3457-81). - М. 1989, - 13 с.
7. Калфин Е.Х. Ускоренный метод выделения культур микобактерий туберкулеза // Проблемы туберкулеза. - 1962.
- № 5. - С. 46 - 48.
8. Кассич Ю.Я., Борзяк А.Т., Кочмарский А.Ф. Туберкулез животных и меры борьбы с ним. - Киев: Урожай, 1990. - 304 с.
9. Косенко В.Е. Кадочкин А.М., Тажгалиев Н.М. Влияние обработки патологического материала (химическими веществами) на высеваемость микобактерий туберкулеза // Ветеринария. - 1984. - № 5. - С.67 - 68.
10. Тажгалиев Н.М. Предварительная обработка патологического материала при диагностике туберкулеза сельскохозяйственных животных // Бюл. ВИЭВ. - 1983. - Вып. 51. - С. 37 - 38.
11. Телишевская Л.Я., Простяков А.П., Цыганкова С.И., Трусова Л.И. Контроль и стандартизация компонентов и пита-
тельных сред бактериальных культур // Бюл. ВИЭВ. - 1983. - Вып. 49. - С. 83 - 90.
12. Финн Э.Р. Среда для культивирования микобактерий туберкулеза. - Авторское свидетельство № 325879 от 12.10.1971.
13. Черкес Ф.К. Руководство к практическим занятиям по микробиологическим исследованиям. - М.: Медицина, 1980. - 307 с.
14. Sabater I.F.G., Zaragoza I.M. F A simplo identification system for growing mycobacteria //Acta microbiol. Hung. - 1993.
- № 4. - p. 343 - 349.
DENSE NUTRITIOUS ENVIRONMENTS FOR CULTIVATION MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Donchenko N.A., Donchenko V.N., Ionina S.V.
Summary. In State scientific institution an Institute of experimental veternary medicine of Siberia and Far east of Siberian is designed new thick nourishing ambience, in a become which enters pull from ash tree birches (1,5%) and oxidat turfs (1%), allowing accelerate growing as master, so and chosen from biomaterial of bestial, mycobacterium tuberculosis.
Key words: growth medium, tuberculosis, biomaterial, mycobacteria, peat oxidat, birch wood ashes.
ВНИМАНИЮ СОИСКАТЕЛЕЙ УЧЕНЫХ СТЕПЕНЕЙ И ДРУГИХ ЗАИНТЕРЕСОВАННЫХ ЛИЦ!
Редакция журнала «Достижения науки и техники АПК» издает монографии и другую книжную продукцию с редактированием и всеми выходными данными.
Цены договорные.
Заявки отправлять по адресу: 101000, г. Москва, Моспочтамт, а/я 166.
Тел.: (495) 557-13-01, (91б) 241-63-43. E-mail: agroapk@mail.ru
