CC BY
40
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 571.27
ВСТРЕЧАЕМОСТЬ мРНК РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫХ ГЕНОВ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА ДО И ПОСЛЕ РЕЗЕКЦИИ ОПУХОЛИ
© 2010 г. Т.В. Белова 1, Д.В. Новиков 1, А.В. Калугин 1, Е.С. Плеханова 1,
Н. Гурам 1, А.В. Алясова 2, В.В. Новиков 1
1 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского
2 Нижегородская государственная медицинская академия
belih59@list.ru
Поступила в редакцию 04.04.2010
Продемонстрировано изменение спектра мРНК раково-тестикулярных генов в крови больных колоректальным раком в первые 5-7 дней после удаления опухоли. До операции в крови больных чаще детектировалось от 1 до 3 наименований мРНК раково-тестикулярных генов, чаще всего обнаруживалась мРНК XAGE. После операции в крови наблюдалось увеличение количества форм выявляемых мРНК. Чаще обнаруживалась мРНК SSX.
Ключевые слова: раково-тестикулярные гены, колоректальный рак.
Раково-тестикулярные гены в норме экспрессируются в клетках семенников и женских репродуктивных органах. Также их экспрессия часто индуцируется при опухолевой трансформации клеток. Большинство генов, относящихся к этой группе, локализованы на Х хромосоме в виде мультигенных семейств [1]. На данный момент известно 70 семейств раковотестикулярных белков. Функции, которые выполняют эти белки, до конца не ясны, однако было показано их участие в регуляции клеточного цикла, процессах апоптоза, а также в работе транскрипционных комплексов [2]. Ограниченная экспрессия раково-тестикулярных генов позволила использовать их мРНК или сами белки в качестве биомаркеров опухолевого процесса. Продемонстрирована прогностическая роль обнаружения экспрессии раково-тестикулярных генов GAGE и MAGE-C(CT7) в клетках миеломы [3], генов MAGE-A и NY-ESO-I в клетках опухолевого очага больных раком легкого [4] и меланомы [5], гена MAGE-C(CT7) в клетках опухоли молочной железы [6]. Недавно была показана возможность использования мРНК раково-тестикулярного гена SPAG9 для ранней диагностики рака уретры [7]. Также установлено, что мРНК раково-тестикулярных генов с достаточно высокой частотой обнаруживается в периферической крови онкологических больных как на поздних, так и на ранних
стадиях заболевания [8, 9]. При колоректальном раке (КР) также обнаружена экспрессия раковотестикулярных генов как клетками опухолевого очага, так и метастазирующими клетками, попавшими в периферическую кровь больного [10]. Однако остался не изученым характер экспрессии раково-тестикулярных генов в периферической крови больных КР до и после удаления опухоли. Поэтому целью настоящей работы стало сравнение частоты обнаружения мРНК MAGE-A1-6, MAGE-C, XAGE, NY-ESO, PAGE, GAGE и SSX в периферической крови больных КР до и после операции.
Материалы и методы
Исследовали образцы периферической крови и клеток опухолевых очагов, полученных от 49 больных КР Tj-4No-3Mo-i, поступивших на лечение в хирургическое отделение больницы им. Семашко в 2008 г. Стадию онкологического процесса определяли в соответствии с Международной классификации опухолей по системе TNM (ВОЗ, 1990). Больные получали лечение в объеме резекции опухолевого очага. Кровь на исследование брали до операции и через 5-7 дней после операции. В качестве отрицательного контроля использовали образцы периферической крови 25 здоровых волонтеров.
Рис. 1. Электрофореграмма детекции мРНК раково-тестикулярных генов методом ОТ-ПЦР: 1 - маркер размерности ДНК; 2 - кДНК PAGE; 3 - кДНК MAGE-A1-6; 4 - кДНК GAGE; 5 - кДНК XAGE; 6 - кДНК NY-ESO; 7 - кДНК MAGE-C7; 8 - кДНК SSX
Образцы периферической крови и опухолевых очагов собирали в буферный раствор, содержащий 4 М гуанидина, 0.5% тритона Х, 25 мМ ацетата натрия, 10% фенола. РНК выделяли из образцов методом фенол-хлороформной экстракции.
Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием смеси обратных праймеров и обратной транскриптазы M-MuLV («Promega», США) в соответствии с рекомендациями производителя. Амплификацию кДНК исследуемых раково-тестикулярных генов проводили в два раунда полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, специфичных к местам соединения экзонов [9]. На первом этапе проводили 35 циклов множественной ПЦР (940 - 30, 600 - 30, 720 - 45 секунд) с использованием праймеров, специфичных ко всем исследуемым мРНК. С целью раздельной амплификации представителей каждого семейства исследуемых мРНК раково-тестикулярных генов на втором этапе проводили 25 циклов гнездовой ПЦР (940 - 30, 600 - 30, 720- 45 секунд) в присутствии специфических праймеров. Результаты реакции оценивали методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле в присутствии бромида этидия.
Результаты и обсуждение
На рис. 1 представлен пример обнаружения мРНК раково-тестикулярных генов в исследуемых образцах методом ОТ-ПЦР. При анализе экспрессии раково-тестикулярных генов в клетках опухолевого очага больных КР показано, что чаще других выявлялась мРНК SSX и MAGE-A (у 59% и 55% больных). Матричная РНК NY-ESO-I, PAGE, GAGE1-8, XAGE и MAGE-C была обнаружена в 33, 29, 29, 33 и 10% случаев соответственно (таблица). Суммарная частота обнаружения мРНК исследуемых раково-тестикулярных генов в образцах опухолевых очагов составила 85.5%. Следует
отметить, что в каждом из исследуемых образцов была обнаружена мРНК как минимум двух раково-тестикулярных генов, а в 26 образцах обнаруживались мРНК от трех до семи исследуемых раково-тестикулярных генов.
В образцах периферической крови больных КР, взятых до удаления опухоли, наиболее часто обнаруживалась мРНК XAGE (33%) и MAGE-A (29%). Частота обнаружения мРНК раково-тестикулярных генов MAGE-C, SSX, PAGE, GAGE1-8 и NY-ESO-I составила 25, 22, 18, 18 и 14% соответственно. Суммарная частота обнаружения мРНК раково-тестикулярных генов в периферической крови больных КР до операции составила 80%. В большинстве случаев в образцах периферической крови, взятых до операции, выявлялась мРНК только одного из исследуемых раково-тестикулярных генов. Одновременная экспрессия двух-пяти раковотестикулярных генов была обнаружена в 26 из 49 исследуемых образцов периферической крови больных КР, взятой до хирургического удаления опухоли.
Исследование частоты обнаружения мРНК раково-тестикулярных генов в образцах периферической крови, взятой у тех же больных через 5-7 дней после хирургического вмешательства, показало результаты, сходные с характером экспрессии раково-тестикулярных генов в образцах опухолевого очага. Установлено, что как и в опухолевых очагах, наиболее часто обнаруживались мРНК SSX и MAGE-A (в 35 и 33% случаев). Матричная РНК NY-ESO-I, PAGE, GAGE1-8 и MAGE-C была обнаружена у 13, 31, 31 и 21% больных соответственно. Интересно отметить, что суммарная частота обнаружения мРНК раково-тестикулярных генов в периферической крови, взятой после хирургического удаления опухоли у тех же больных, была выше, чем в клетках опухолевого очага и составила 90%.
На рис. 2 представлена диаграмма, иллюстрирующая распределение количества иссле-
Таблица
Частота обнаружения мРНК раково-тестикулярных генов в исследуемых образцах
Материал для исследования Количество положительных проб (процентное содержание)
GAGE+ PAGE MAGE-A1-6 MAGE-C XAGE SSX ОТ^О
Кровь до операции (п = 49) 9(18) 16 (33) 12 (25) 14 (29) 11 (22) 7 (14)
Клетки опухолевого очага (п = 49) 14(29) 27 (55) 5 (10) 16 (33) 29 (59) 16 (33)
Кровь через 5-7 дней после операции (п = 48) 15 (31) 17 (35) 10 (21) 14 (29) 17 (35) 6 (12.5)
40
35 30
£
« 25
я
0
1 20
I ,5
О
И
10 5 0
Рис. 2. Коэкспрессия мРНК раково-тестикулярных генов в крови и клетках опухолевого очага: 0-7 - количество форм мРНК раково-тестикулярных генов, выявленных в одной пробе; белая штриховка - кровь больных колоректальным раком, взятая до операции; серая с черным штриховка - кровь больных колоректальным раком, взятая на 5-7 сутки после операции; черная штриховка - образцы опухолевого очага больных колоректальным раком
дуемых мРНК раково-тестикулярных генов, выявленных в одном образце. Как видно из рисунка, в образцах опухолевого очага КР чаще обнаруживается от двух до семи наименований мРНК. В образцах периферической крови, взятой до хирургического вмешательства, чаще всего выявлялись образцы, содержащие мРНК только одного из исследуемых генов. После удаления опухоли в образцах периферической крови тех же больных преимущественно детектировалось от двух до четырех наименований мРНК, а в 3 образцах было обнаружено присутствие 7 различных мРНК, что сходно с результатами, полученными для опухолевого очага.
В клетках опухолевого очага максимальная частота обнаружения была показана для мРНК SSX. В образцах периферической крови до операции чаще обнаруживались мРНК гена XAGE,
а после операции, как и в клетках опухолевого очага, наблюдалось повышение частоты обнаружения мРНК SSX. Поскольку выявление мРНК раково-тестикилярных генов в образцах периферической крови онкологических больных может являться показателем циркуляции опухолевых клеток в кровяном русле, можно предположить, что при хирургическом удалении опухоли происходит попадание опухолевых клеток в кровяное русло и за счет этого возрастает количество выявляемых в периферической крови наименований мРНК раково-тестикулярных генов.
Интересно отметить, что индивидуальная встречаемость каждого вида мРНК была выше в опухолевых очагах, чем в периферической крови больных колоректальным раком, причем как до, так и после операции, за исключением мРНК MAGE-C. Матричная РНК MAGE-C гена
чаще выявлялась в крови больных колоректальным раком, чем в клетках опухолевого очага. Причем максимальное число проб, положительных на мРНК MAGE-C, было зафиксировано в крови больных до операции (25%), чем в крови больных после резекции опухоли (21%). Только 10% протестированных образцов опухолевого очага были положительны на MAGE-C мРНК. Возможно данный антиген выполняет особую роль, характерную для опухолевых клеток, циркулирующих в крови больных колоректальным раком.
Таким образом, продемонстрировано изменение спектра мРНК раково-тестикулярных генов в крови больных колоректальным раком в первые 5-7 дней после удаления опухоли. До операции в крови больных чаще детектировалось от 1 до 3 наименований мРНК раковотестикулярных генов, после операции в крови наблюдалось увеличение количества форм выявляемых мРНК. В клетках опухолевого очага максимальная частота обнаружения была показана для мРНК SSX. В образцах периферической крови до операции чаще обнаруживались мРНК гена XAGE, а после операции, как и в клетках опухолевого очага, наблюдалось повышение частоты обнаружения мРНК SSX. Специфический тип экспрессии был продемонстрирован для мРНК MAGE-C. В отличие от других мРНК, она чаще выявлялась в образцах крови, чем в клетках опухолевых очагов.
Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 годы и гранта РФФИ № 09-04-97081_ р_поволжье_а.
Спжєк литлратуры
1. Zendman J. W., Ruiter J.D., Van Muijen G.N.
Cancer/Testis-Associated Genes: Identification,
Expression Profile, and Putative Function // J. СєМ^г Physiology. 2003. V. 194. P. 272-288.
2. Soudeh G.F., Modarressi M.H. Cancer-Testis
Antigens: Potential Targets for Cancer //
Immunotherapy. 2009. V. 12. P. 395-404.
3. Andrade V.C., Vettore A.L., Roberta S.F. Prognostic impact of cancer/testis antigen expression in advanced stage multiple myeloma patients // Cancer Immunity. 2007. V. 8. P. 2-11.
4. Grah J.M., Kanojia D.E., Sushma S.S. Sperm-associated antigen 9 is a biomarker for early cervical carcinoma // Cancer Immunity. 2008. V. 3. P. 731-737.
5. Velazques E.F., Jungbluth A.A., Yancovitz M. Expression of the cancer/testis antigen NY-ESO-1 in primary and metastatic malignant melanoma (MM) -correlation with prognostic factors // Cancer Immunity. 2008. V. 7. P. 11-13.
6. Kruger S., Ola V.A., Feller A.C. Expression of Cancer-Testis Antigen CT7 (MAGE-C1) in Breast Cancer: An Immunohistochemical Study with Emphasis on Prognostic Utility // Pathology Oncology Res. 2007. V. 13. P. 91-9б.
7. Gard M., Kanojia D., Salhan S. Sperm-associated antigen 9 is a biomarker for early cervical carcinoma // Cancer. 2009. V. 5. P. 23-27.
8. Yokoe T., Tanaka F., Inoue H. Efficient identification of a novel cancer/testis antigen for immunotherapy using three-step microarray analysis // Cancer Res. 2008. V. 4. P. 1074-1082.
9. Новиков Д.В. Белова Т.В., Пегов P.Г. и др. Частота обнаружения мPHK MAGE-A в крови онкологических больных // ^инине^ая и лабораторная диагностика. 2009. № 4. С. 25-27.
10. Ming L., Yuan Y.H., Han Y. Expression Profile of Cancer-Testis Genes in 121 Human Colorectal Cancer Tissue and Adjacent Normal Tissue // Clinical Cancer Research. 2005. V. 11. P. 1809-1814.
CANCER-TESTIS GENE mRNA OCCURRENCE IN COLORECTAL CANCER PATIENTS BEFORE AND AFTER TUMOR RESECTION
T. V. Belova, D. V. Novikov, A. V. Kalugin, E.S. Plechanova,
N. Gouram, A. V. Alyasova, V. V. Novikov
The change of cancer-testis gene mRNAs spectrum in blood of colorectal cancer patients during 5-7 days after tumor resection has been demonstrated. From 1 to 3 cancer-testis mRNAs were detected in patient blood before the resection, and the detection of XAGE mRNA prevailed. An increase in different forms of cancer-testis mRNAs was found in the blood of the same patients after resection, SSX mRNA being detected more frequently.
Keywords: cancer-testis genes, colorectal cancer (colon cancer).
