CC BY
33
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 616-006.66
© 2012 г.
ЭКСПРЕССИЯ РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫХ ГЕНОВ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ПОЧКИ
Н. Гуррам1, Д.В. Новиков1, А.В. Алясова2, В.В. Новиков1
1 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского 2Нижегородская государственная медицинская академия
moonlight4u2 @hotmail .com
Поступила в редакцию 15.04.2012
Показано, что при раке почки в опухолевых очагах и периферической крови больных обнаруживается мРНК раково-тестикулярных генов, принадлежащих суперсемействам MAGE и GAGE/PAGE/XAGE. Гены экспрессируются в разных сочетаниях и с разной частотой. Спектры экспрессии генов различаются, что указывает на различия в структуре транскриптома злокачественно трансформированных клеток, присутствующих в опухолевых узлах, и метастазирующих клеток, циркулирующих в крови.
Ключевые слова: раково-тестикулярные гены, мРНК, MAGEA1-6, MAGEC1, XAGE1,2,4, GAGE1-9, рак почки.
Раково-тестикулярные гены - это группа генов, экспрессия которых в норме обычно наблюдается только в семенниках, плаценте, трофобла-сте и яичниках. При малигнизации регуляция их работы нарушается, в результате в опухолях разных типов наблюдается экспрессия раковотестикулярных генов. Последние принадлежат разным мультигенным семействам и локализованы чаще всего на Х-хромосоме. Частота экспрессии раково-тестикулярных генов вариабиль-на в различных опухолях [1]. Индукция экспрессии этих генов в неопластических клетках наблюдается при деметилировании их промо-торных областей. Включение гаметогенной программы в опухолевых клетках, показателем которой является индукция раково-тестикулярных генов - необходимое условие для приобретения опухолевыми клетками таких свойств как им-мортализация, инвазия и метастазирование [2]. Экспрессия сильно варьирует между опухолями различных типов [3]. Матричная РНК раковотестикулярных генов с достаточно высокой частотой обнаруживается в периферической крови онкологических больных. Обнаружение мРНК раково-тестикулярных генов в периферической крови свидетельствует о наличии в кровяном русле метастазирующих клеток [4]. Получены данные о мониторинговой значимости экспрессии раково-тестикулярных генов, относящихся к разным семействам [1, 5].
Цель настоящей работы - сравнительный анализ встречаемости мРНК раково-тестикулярных генов MAGEA1-6, MAGEC1, GAGE1-9 и XAGE1,
2,4 в периферической крови и в опухолевых очагах больных раком почки.
Материалы и методы
Исследовали образцы периферической крови и опухолевых очагов 64 больных раком почки (T1_4N0_2M0_1), проходивших лечение в Приволжском окружном медицинском центре, Нижний Новгород. В качестве контроля использовали 10 образцов периферической крови, полученных от здоровых волонтеров.
Выделение тотальной РНК из образцов периферической крови и опухоли проводили по методике, описанной ранее [6]. Перед выделением РНК из тканей опухолевого очага образцы подвергали трехкратному замораживанию-оттаиванию. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием смеси обратных праймеров и обратной транскриптазы M-MuLV («Fermentas», Латвия). Амплификацию кДНК исследуемых раково-тестикулярных генов проводили в два раунда полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, специфичных к местам соединения экзонов. На первом этапе проводили 35 циклов множественной ПЦР (940 - 30 с, 600 - 30 с, 720 - 45 с) с
Таблица
Частота встречаемости мРНК раково-тестикулярных генов у больных раком почки
Наименование гена Частота выявления мГНК раково-тестикулярных генов, %
кровь здоровых доноров опухолевые очаги больных раком почки кровь больных раком почки
MAGEA^ G 7G.4 8.1
MAGEC1 G 44.4 33.3
GAGE1-9 G 48.1 35.1
XAGE1,2,4 G 22.2 32.4
использованием праймеров, специфичных ко всем исследуемым мРНК. С целью раздельной амплификации представителей каждого семейства исследуемых мРНК раково-тестикулярных генов на втором этапе проводили 25 циклов гнездовой ПЦР (940 - 30 с, 600 -30 с, 720 - 45 с) в присутствии специфических праймеров. Результаты реакции оценивали методом электрофореза в 1.5%-ном агарозном геле в присутствии бромида этидия. Специфичность получаемого амплификата подтверждали определением нуклеотидной последовательности с помощью автоматического секвенирования с использованием генетического анализатора ABI Prism 3130 Аpplied Biosystems.
Результаты и их обсуждение
В настоящее время известны более трех десятков генов суперсемейства MAGE, имеющих общее филогенетическое происхождение. Гены, принадлежащие семействам MAGEA, -B и -C (MAGE гены I типа), имеют полную открытую рамку считывания, кодируемую одним экзоном. Семейство генов MAGEA включает 12 представителей и локализовано в регионе Xq28 хромосомы Х [7], кластер гомологичных генов MAGEB - в регионе Xp21 [8], кластер генов MAGEC локализовано в регионе Xq26-27 [9]. Белки MAGE являются транскрипционными факторами, регулирующими процессы ацетили-рования гистонов, участвуют в убиквитинили-ровании белков. Экспрессия генов MAGE защищает клетки от программируемой смерти, что способствует развитию злокачественных новообразований [10].
В наших исследованиях в 19 из 27 тестированных образцов опухолевых очагов больных раком почки была выявлена мРНК MAGEA1-6. То есть у данных больных в клетках опухолевых очагов экспрессировался один или несколько генов MAGEA, принадлежащих группе, состоящей из шести генов (MAGEA1-6). Частота выявления мРНК генов MAGEA1-6 составила 70.4%. В периферической крови больных
раком почки мРНК генов MAGEA1-6 обнаруживалась значительно реже. Она была выявлена лишь у трех из 37 тестированных больных. Частота выявления мРНК данной группы генов в крови больных раком почки составила 8.1%. В двух случаях из трех мРНК MAGEA1-6 обнаруживалась у больных также и в опухолевых очагах. У одного больного мРНК MAGEA1-6 в образце опухолевого образца не выявлялась, что свидетельствует о различиях в экспрессии MAGEA1-6 генов в опухолевом образце и циркулирующих в крови опухолевых клетках. Заметим, что в периферической крови здоровых волонтеров мРНК MAGEA1-6 не была обнаружена ни в одном из 10 случаев.
В опухолевых очагах больных раком почки мРНК гена MAGEC1 обнаруживалась в 12 из 27 случаев, что в 1 . 6 раза реже, чем встречаемость мРНК группы генов MAGEA1-6. В восьми случаях это были больные, которые характеризовались экспрессией генов MAGEA1-6, и лишь у трех больных в опухолевых очагах присутствовала мРНК MAGEC1, но не обнаруживалась мРНК MAGEA1-6. В периферической крови больных мРНК гена MAGEC1 обнаруживалась в 1.3 раза реже, чем в опухолевых очагах. Она была выявлена у 9 из 27 больных (33.3%). Частота встречаемости мРНК этого гена в крови оказалась в 4.1 раза больше частоты встречаемости мРНК шести генов MAGEA1-6. При этом ни у одного больного в крови не выявлялась мРНК генов MAGEA1-6 и MAGEC1 одновременно.
Сравнение встречаемости мРНК MAGEC1 в крови и опухолевых образцах больных показало, что в двух случаях тестируемая мРНК обнаруживалась в периферической крови, но не детектировалась в опухолевых очагах. Это указывает на различия в структуре транскриптома злокачественно трансформированных клеток больных раком почки в опухолевых очагах и метастазирующих клеток, мигрирующих в кровь. В крови здоровых волонтеров мРНК гена MAGEC1 не выявлялась ни в одном из 10 случаев.
Еще одно суперсемейство раково-тестикулярных генов обозначено как GAGE/ PAGE/XAGE. Гены этого суперсемейства имеют по четыре-пять экзонов, кодируют белки длиной 79-146 аминокислот и экспрессируются в норме в семенниках и плаценте [11]. Показано, что продукт гена GAGE7 блокирует Fas-зависимый апоптоз, и апоптоз, инициируемый IFN-y [12]. Обнаружены корреляции между экспрессией GAGE и плохим прогнозом при некоторых видах рака [13].
При анализе экспрессии генов GAGE1-9 и XAGE 1,2,4, принадлежащих данному суперсемейству, нами было обнаружено, что в опухолевых очагах больных раком почки мРНК девяти генов семейства GAGE (GAGE1-9) выявлялась в 13 из 27 случаев, что составило 48.1%. Частота обнаружения мРНК GAGE1-9 была в
1.5 раза меньше, чем для генов MAGEA1-6, и соответствовала частоте встречаемости мРНК гена MAGEC1. В периферической крови здоровых доноров мРНК генов GAGE1-9 не обнаруживалась, но в крови больных раком почки она выявлялась в 35.1% случаев. Такая частота встречаемости значительно выше частоты встречаемости мРНК MAGEA1-6, но сопоставима с встречаемостью мРНК гена MAGEC1. В четырех случаях мРНК GAGE1-9, не обнаруживающаяся в опухолевых очагах, детектировалась в периферической крови больных.
Матричная РНК генов XAGE1,2,4 обнаруживалась в шести из 27 тестированных опухолевых очагов больных раком почки (22.2%). В пяти случаях представители группы генов XAGE1,2,4 экспрессировались совместно с генами MAGEA1-6 и только в двух из шести случаях экспрессия генов XAGE происходила одновременно с экспрессией генов GAGE1-9. Не было выявлено ни одного совпадения с экспрессией гена MAGEC1, что указывает на высокую степень несовпадения экспрессии данных генов. В периферической крови здоровых доноров крови мРНК генов XAGE1,2,4 не обнаруживалась. В периферической крови больных раком почки мРНК генов XAGE выявлялась в 32.4% случаев (12 больных из 37), что в 1.5 раза больше частоты ее встречаемости в опухолевых очагах больных. Проведено сопоставление данных, полученных при анализе экспрессии генов XAGE1,2,4 в опухолевых очагах и крови больных. Обнаружено, что двое из шести больных, опухолевые очаги которых содержали мРНК XAGE, не имели в крови мРНК этих генов. У остальных больных мРНК генов XAGE1,2,4 выявлялась как в крови, так и в образцах опухолевых очагов.
Общая частота встречаемости мРНК раковотестикулярных генов, принадлежащих суперсемействам MAGE и GAGE/PAGE/XAGE, составила в образцах опухолевых очагов 92%. Частота встречаемости мРНК тестированных в работе раково-тестикулярных генов в периферической крови составила 70.3%.
Таким образом, при раке почки, как и при других онкологических заболеваниях, в опухолевых очагах обнаруживается мРНК раковотестикулярных генов, принадлежащих суперсемействам MAGE и GAGE/PAGE/XAGE. Матричная РНК этих генов выявляется также в периферической крови больных. Гены экспрессируются в разных сочетаниях и с разной частотой. Спектры экспрессии генов в образцах опухолевых очагов и в периферической крови отличаются, что указывает на различия в тран-скриптоме злокачественно трансформированных клеток, присутствующих в опухолевых узлах, и метастазирующих клеток, циркулирующих в крови. Высокая частота выявления мРНК тестированных генов в периферической крови больных раком почки указывает на их потенциальную диагностическую значимость.
Список литературы
1. Chomez P., Backer O., Bertrand M. et al. An overview of the MAGE gene family with the identification of all human members of the family // Cancer Re-seach. 2001. V. 61. P. 5544-5551.
2. Gjerstorff M., Kock K., Nielsen O. MAGE-A1, GAGE and NY-ESO-1 cancer/testis antigen expression during human gonadal development // Human Reproduction. 2007. V. 1. P. 1-8.
3. Новиков Д.В., Белова Т.В., Пегов Р.Г. и др. Частота обнаружения мРНК MAGE-A1-A6 в крови онкологических больных // Клин. лаб. диагностика. 2009. № 4. С. 25-27.
4. Kaneda A. Frequent hypomethylation in multiple promoter CpG islands is associated with global hypo-methylation, but not with frequent promoter hypermeth-ylation // Cancer Sci. 2004. V. 95. P. 58-64.
5. Jungbluth A., Ely S., Diliberto M. et al. The cancer-testis antigens CT7(MAGEC1) and MAGEA3/6 are commonly expressed in multiple myeloma and correlete with plasma-cell proliferation // Blood. 2005. V. 106. P. 167-174.
6. Chomszynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Analytical Biochemistry. 1987. V. 162. P. 156-159.
7. Plaen E., Smit C., Boucouey M. et al. Genes expressed in cancer and germ line cells // Immunogenetics. 2005. V. 13. P. 195-198.
8. Muscatelli F., Walker A.P., de Plaen E. et al. Isolation and characterization of a MAGE gene family in the Xp21.3 region // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 4987-4991.
9. Lucas S., De Smet C., Arden K.C. et al. Identification of a new MAGE gene with tumor-specific expression by representational difference analysis // Cancer Research. 1998. V. 58. P. 743-752.
10. Yang B., O’Hemn S., Wu J. et al. MAGE-A, Mage-B, and MAGE-C proteins form complexes with KAP1 and suppress p53-dependent apoptosis in MAGE-positive cell lines // Cancer Res. 2007. V. 67. P. 99549962.
11. Zendman A., Ruiter D., Van Muijen G. Cancer/testis-associated genes: identification, expression
profile, and putative function // J. cellular physiology. 2003. V. 194. P. 272-288.
12. Cilensek Z.M., Yehiely F., Kular R.K., Deiss L.P. A member of the GAGE family of tumor antigens is an anti-apoptotic gene that confers resistance to FasCD95APO-1, Interferon-gamma, taxol and gamma-irradiation // Cancer Biol. Ther. 2002. V. 1. P. 380-387.
13. Duan Z., Duan Y., Lamendola D.E. et al. Overexpression of MAGE/GAGE genes in paclitax-eFdoxombicin-resistant human cancer cell lines // Clin. Cancer Res. 2003. V. 9. P. 2778-2785.
EXPRESSION OF CANCER-TESTIS GENES IN PATIENTS WITH RENAL CARCINOMA N. Gourram, D.V. Novikov, A. V. Alyasova, V. V. Novikov
In the current study, we have shown that in primary tumors and peripheral blood samples of renal cancer patients mRNAs of cancer-testis genes MAGE and GAGE/PAGE/XAGE are present. The genes express in different combinations and with different frequency. The spectra of gene expression differ, indicating the differences in transcrip-tome structure of malignantly transformed cells present in tumor sites and of metastatic cells circulating in the blood.
Keywords: cancer-testis genes, mRNA, MAGEA1-6, MAGEC1, XAGE1,2,4, GAGE1-9, kidney cancer.
