CC BY
16
Физико-химическая биология Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2012, № 2 (3), с. 196-200
УДК 577.1
ПРИСУТСТВИЕ мРНК РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫХ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ ОПУХОЛЕВЫХ ОЧАГОВ И ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ МИОМОЙ МАТКИ
© 2012 г. А.В. Калугин1, Д.В. Новиков1, Е.Ю. Конторщикова2, К.А. Шахова'2,
Е.С. Плеханова1, А.А. Щербинина1, Н. Гуррам1, А.В. Целикова1, В.В. Новиков1
:НИИ молекулярной биологии и региональной экологии ННГУ им. Н.И. Лобачевского 2Нижегородская государственная медицинская академия
Поступила в редакцию 21.03.2012
Исследована частота обнаружения мРНК MAGEA1-6, SSX1,2,4, XAGE1, NY-ESO-1, MAGEC1 в периферической крови и в опухолевых очагах пациентов с миомой матки. Хотя бы одна из этих мРНК обнаруживалась в 86.4% образцов опухолевых очагов и в 49.1% образцов периферической крови. Чаще других выявлялись мРНК MAGEA1-6, XAGE1 и SSX1,2,4.
Ключевые слова: мРНК раково-тестикулярных генов, миома матки, опухолевый очаг, периферическая кровь.
Введение
Раково-тестикулярные (CT от англ. cancer/ testis) гены экспрессируются в зародышевых клетках гонад и плаценты, эмбрионе и иммуно-привилегированных тканях человека. В здоровых дифференцированных тканях активность СТ-генов заблокирована эпигенетически, за счет метилирования регуляторных участков генов и модификаций гистонов. Функции большинства СТ-белков неизвестны, однако установлено их участие в регуляции клеточного цикла, транскрипции и апоптоза [1]. Для некоторых из них (гены MAGEA и SSX) показано участие в составе транскрипционных комплексов [2, 3]. Активность СТ-генов наблюдается в клетках, для которых свойственна интенсивная пролиферация и способность к миграции. При неопластической трансформации клетки также наблюдается активация СТ-генов, вызванная процессами деметилирования генома. Исследования по изучению частоты обнаружения мРНК СТ-генов в раковых клетках показали, что активация СТ-генов носит случайный характер. Раковые клетки, экспрессирующие СТ-гены, характеризуются пролиферативной активностью и способностью к миграции. Предполагается, что экспрессия СТ-генов придает раковой клетке свойства стволовых клеток опухоли [4].
Матричные РНК и белки СТ-генов используются в качестве онкомаркеров. К настоящему времени проведено большое количество исследований по обнаружению мРНК СТ-генов в опухолевых очагах и периферической крови
пациентов с такими заболеваниями, как мела-нома, рак легкого, молочной железы, желудка, кишечника [5], печени [6], эндометрия [7] и др. Экспрессия СТ-генов также обнаружена в клетках доброкачественных опухолей молочной железы [8], яичников [9], щитовидной железы [10]. В клетках миомы матки (ММ) экспрессия СТ-генов осталась практически не изученной. На данный момент имеется небольшое количество работ, посвященных изучению экспрессии СТ-генов при ММ, в которых исследована экспрессия генов двух СТ-семейств (MAGEA1-6 и GAGEC1) [5, 11-13]. Цель данного исследования - оценка частоты обнаружения мРНК MAGEA1-6, SSX1,2,4, XAGE1, NY-ESO-1 и MAGEC1 в клетках опухолевых очагов и периферической крови больных ММ.
Экспериментальная часть
Образцы опухолевой ткани и периферической крови были получены от пациенток, проходивших стационарное лечение в 1 гинекологическом отделении Нижегородской областной клинической больницы им. Н.А. Семашко в период с 2008 по 2010 гг. Всем пациенткам проводилось хирургическое лечение в объеме ампутации или экстирпации матки. Кровь для исследования забирали до хирургического вмешательства.
В работе были проанализированы 59 образцов опухолевых очагов и 59 образцов периферической крови больных ММ. Среди них 15 образцов опухолевой ткани и периферической крови
Рис. 1. Частота обнаружения мРНК MAGEA1-6, XAGE1, SSX1,2,4, NY-ESO-1 и MAGEC1 в образцах периферической крови и опухолевых очагов больных миомой матки: черная заливка - опухолевые очаги, белая заливка - периферическая кровь
соответствуют фибромиоме, 9 образцов опухолевой ткани и периферической крови - лейо-миоме. В качестве отрицательного контроля использовали 14 образцов периферической крови, полученных от здоровых волонтеров.
Образец исследуемой ткани смешивали в соотношении 1:1 с лизирующим буферным раствором, содержащим 4 М гуанидин-тиоцианат, 0.5% Тритон Х-100, 25 мМ цитрата натрия, рН 7.0. Биологические образцы хранили при -20°С до использования. Суммарную РНК выделяли из образцов крови и опухолевой ткани методом фенол-хлороформной экстракции с последующей преципитацией изопропиловым и 75%-ным этиловым спиртом [14]. Реакцию обратной транскрипции проводили в объеме 10 мкл с использованием обратной транскриптазы M-MuLV («Fermentas», Латвия), согласно рекомендациям производителя. Амплификацию кДНК проводили в два раунда («гнездовая» ПЦР) с использованием праймеров, специфичных к местам соединения экзонов мРНК СТ генов. Для первого раунда ПЦР проводили 35 циклов амплификации при следующих условиях: 940С - 30 секунд, 55 0С - 30 секунд, 720С - 30 секунд. Для второго раунда проводили 25 циклов амплификации (940С - 30 секунд, 600С - 30 секунд, 720С -30 секунд). Результаты ОТ-ПЦР анализировали методом электрофореза в 1.5%-ном агарозном геле, содержащем бромид этидия.
Результаты и их обсуждение
Суммарная частота детекции мРНК СТ генов в клетках опухолевых очагов составила 86.4% (51 из 59 образцов). В клетках опухолевых оча-
гов чаще других выявлялись мРНК MAGEA1-6 и 88X1,2,4 - в 69.5% случаев (41 из 59 образцов) и 33.9% случаев (20 из 59 образцов) соответственно (рис. 1). Реже выявлялись мРНК XAGE1 и MAGEC1 - в 18.6% случаев (11 из 59 образцов) и 15.2% случаев (9 из 59 образцов) соответственно. Матричная РНК КУ-Б80-1 в опухолевых очагах ММ обнаружена не была. При этом в 29 образцах клеток опухолевых очагов (56.9%) была обнаружена мРНК только одного из СТ-генов, в 14 образцах (27.4%) - мРНК двух СТ-генов, а в 8 образцах (15.7%) - мРНК трех СТ-генов.
В периферической крови здоровых волонтеров мРНК СТ-генов обнаружено не было. В периферической крови больных ММ суммарная частота обнаружения мРНК тестируемых генов составила 49.1% (29 из 59 образцов). Необходимо отметить, что наиболее часто в периферической крови (18 из 29 образцов) выявлялась мРНК только одного из СТ-генов. Значительно реже в крови детектировались сочетания 2-3 мРНК (в 5 образцах), а в одном образце крови были обнаружены одновременно 4 мРНК. Частота детекции мРНК MAGEA1-6 составила 32.2% (19 из 59 образцов), мРНК 88X1,2,4 -18.6% (11 из 59 образцов), а мРНК MAGEC1 -3.4% (2 из 59 образцов). Матричные РНК XAGE1 и КУ-Е80-1 в периферической крови выявлялись чаще, чем в опухолевых очагах - в 20.3% (12 из 59 образцов) и 5.1% случаев (3 из 59 образцов) соответственно. При сравнении результатов обнаружения мРНК MAGEA1-6, 88X1,2,4, XAGE1, КУ-Е80-1 и MAGEC1 в периферической крови и клетках опухолевого очага одного больного ММ в 21 образце крови
198
А.В. Калугин, Д.В. Новиков, Е.Ю. Конторщикова и др.
Рис. 2. Встречаемость мРНК МАОЕА1-6, ХЛОЕ1, 88X1,2,4, ОТ-Е80-1 и МЛОЕС1 в клетках опухолевых очагов миомы матки различных гистологических типов: пиксельная штриховка - фибромиома, сетчатая штриховка - лейомиома
были обнаружены мРНК СТ-генов, которые не детектировались в клетках опухоли.
При сравнении частоты обнаружения мРНК СТ-генов в опухолевых очагах с разным гистологическим типом ММ существенных различий обнаружено не было (рис. 2). В образцах лейо-миом матки мРНК хотя бы одного СТ-гена была обнаружена в 77.8% случаев, в образцах фибромиом матки - в 93.3% случаев. В клетках лейо-миомы были обнаружены мРНК МАОЕА1-6 (55.5%), 88X1,2,4 (55.5%) и МАвЕС1 (33.3%). При фибромиоме матки выявлялись мРНК МАОЕА1-6 (53.3%), 88X1,2,4 (40%) и МАвЕС1 (26.7%). Матричная РНК ХАвЕ1 выявлялась только в 1 образце фибромиомы матки.
В периферической крови суммарная частота обнаружения мРНК СТ-генов при лейомиоме составила 55.5%, при фибромиоме - 53.3%. При фибромиоме в периферической крови были обнаружены мРНК МАОЕА1-6 (20%), ХАвЕ1 (33.3%), 88X1,2,4 (26.7%), МАвЕС1 (6.7%). При лейомиоме в периферической крови были обнаружены мРНК МАОЕА1-6 (22.2%), 88X1,2,4 (33.3%), XAGE1 (33.3%) и МАвЕС1 (11.1%). Матричная РНК КУ-Е80-1 присутствовала только в 1 образце периферической крови, полученном от пациентки с фибромиомой.
Среди доброкачественных опухолей женской половой сферы ММ является самой распространенной [15]. ММ представляет собой разрастание гладкомышечных клеток и соединительной ткани миометрия матки [16]. Причи-
ны и конкретные молекулярные механизмы такой неконтролируемой трансформации миометрия в ММ до конца не выяснены [15, 17]. Известно, что важную роль в этом процессе играет изменение регуляции пролиферации и апоптоза [18]. Рост клеток ММ регулируется, в основном, овариальными стероидными гормонами, в частности эстрогенами. В стимуляции пролиферации клеток ММ участвует также множество ростовых факторов, среди которых важное значение отводится трансформирующему фактору роста в (TGF-beta). Показано его участие в стимулировании пролиферации гладкомышечных клеток, активации ангиогенеза и фиброидных изменений, которых нет в нормальном миомет-рии [19].
При изучении доброкачественной гиперплазии простаты N. Sampson с коллегами продемонстрировали в клетках опухоли способность TGF-beta1 активировать работу гена MAGEC1, который является представителем СТ-генов [20]. Также было показано, что рецептор 2 фактора роста фибробластов (FGFR2) способен угнетать экспрессию MAGEA3 в клетках рака щитовидной железы, молочной железы и аденомы гипофиза человека [21-23]. В модельном эксперименте на культуре клеток опухоли гипофиза мыши X. Zhu с коллегами показали способность эстрадиола активировать работу СТ-гена MAGEA3 [23]. Полученные нами данные указывают на то, что мРНК MAGEA1-6, SSX1,2,4, XAGE1, NY-ESO-1, MAGEC1 детектируются как в периферической крови, так и в
опухолевых очагах при образовании доброкачественных опухолей. Установлено частое несоответствие набора мРНК СТ-генов, обнаруживаемых в клетках самой опухоли, с набором выявляемых мРНК в периферической крови одного и того же больного. Возможно, что активация тестированных нами СТ-генов у больных ММ связана с гормональными нарушениями, свойственными для данного заболевания.
Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 гг., ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России» на 2007—2012 гг.
Список литературы
1. Simpson A.J., Caballero O.L., Jungbluth A. et al. Cancer/testis antigens, gametogenesis and cancer // Nat. Rev. Cancer. 2005. V. 5. № 8. P. 615-625.
2. Laduron S., Deplus R., Zhou S. et al. MAGE-A1 interacts with adaptor SKIP and the deacetylase HDAC1 to repress transcription // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. № 14. P. 4340-4350.
3. Smith H.A., McNeel D.G. The SSX family of cancer-testis antigens as target proteins for tumor therapy // Clin. Dev. Immunol. 2010. V. 2010. P. 1-18.
4. Costa F.F., Le Blanc K., Brodin B. Concise review: cancer/testis antigens, stem cells, and cancer // Stem Cells. 2007. V. 25. № 3. P. 707-711.
5. Белова Т.В., Новиков Д.В., Калугин А.В. и др. Встречаемость мРНК раково-тестикулярных генов у больных раком толстого кишечника до и после резекции опухоли // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2010. № 2 (2). C. 486489.
6. Lu Y., Wu L.Q., Lu Z.H. et al. Expression of SSX-1 and NY-ESO-1 mRNA in tumor tissues and its corresponding peripheral blood expression in patients with hepatocellular carcinoma // Chin. Med. J. 2007. V. 120. № 12. P. 1042-1046.
7. Новиков Д.В., Белова Т.В., Пегов Р.Г. и др. Частота обнаружения мРНК MAGE-A1-A6 в крови онкологических больных // Клиническая лабораторная диагностика. 2009. № 4. С. 25-27.
8. Sugita Y., Wada H., Fujita S. et al. NY-ESO-1 expression and immunogenicity in malignant and benign breast tumors // Cancer Res. 2004. V. 64. № 6. P. 21992204.
9. Zhang S., Zhou X., Yu H. et al. Expression of tumor-specific antigen MAGE, GAGE and BAGE in ovarian cancer tissues and cell lines // BMC Cancer. 2010. V. 10. № 163. P. 2-6.
10. Melo D.H., Mamede R.C., Neder L. et al. Expression of MAGE-A4 and MAGE-C1 tumor-associated antigen in benign and malignant thyroid diseases // Head Neck. 2011. V. 33. № 10. P. 1426-1432.
11. Hoffman P.J., Milliken D.B., Gregg L.C. et al. Molecular characterization of uterine fibroids and its implication for underlying mechanisms of pathogenesis // Fertil. Steril. 2004. V. 83. № 3. P. 639-649.
12. Ahn W.S., Kim K.-W., Bae S.M. et al. Targeted cellular process profiling approach for uterine leiomyo-ma using cDNA microarray, proteomics and gene ontology analysis // Int. J. Exp. Path. 2003. V. 84. № 6. P. 267-279.
13. Arslan A.A., Gold L.I., Mittal K. et al. Gene expression studies provide clues to the pathogenesis of uterine leiomyoma: new evidence and a systematic review // Hum. Reprod. 2005. V. 20. № 4. P. 852-863.
14. Chomszynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. 1987. V. 162. № 1. P. 156-159.
15. Киселев В.И., Ляшенко А.А. Молекулярные механизмы регуляции гиперпластических процессов. М.: Изд-во Дмитрейд График Групп, 2005. 348 с.
16. Nivethithai P., Nikhat S.R., Rajesh B.V. Uterine fibroids: a review // Indian J. Pharm. Pract. 2010. V. 3. № 1. P. 6-11.
17. Luo X., Chegini N. The expression and potential regulatory function of microRNAs in the pathogenesis of leiomyoma // Semin. Reprod. Med. 2008. V. 26. № 6. P. 500-514.
18. Maruo T., Ohara N., Wang J. et al. Sex steroidal regulation of uterine leiomyoma growth and apoptosis // Hum. Reprod. Update. 2004. V. 10. № 3. P. 207-220.
19. Andersen J. Growth factors and cytokines in uterine leiomyomas // Semin. Reprod. Endocrinol. 1996. V. 14. № 3. P. 269-282.
20. Sampson N., Untergasser G., Lilg C. et al. GAGEC1, a cancer/testis associated antigen family member, is a target of TGF-beta1 in age-related prostatic disease // Mech. Ageing Dev. 2007. V. 128. № 1. P. 6466.
21. Kondo T., Zhu X., Asa S.L. et al. The cancer/testis antigen melanoma-associated antigen-A3/A6 is a novel target of fibroblast growth factor receptor 2-IIIb through histone H3 modifications in thyroid cancer // Clin. Cancer Res. 2007. V. 13. № 16. P. 4713-4720.
22. Zhu X., Asa S.L., Ezzat S. Genetic and epigenet-ic mechanisms down-regulate FGF receptor 2 to induce melanoma-associated antigen A in breast cancer // American J. Path. 2010. V. 176. № 5. P. 2333-2343.
23. Zhu X., Asa S.L., Ezzat S. Fibroblast growth factor 2 and estrogen control the balance of histone 3 modifications targeting MAGE-A3 in pituitary neoplasia // Clin. Cancer Res. 2008. V. 14. № 7. P. 1984-1996.
200
А.В. KanyauH, ff.B. HoeuKoe, EM. KoHmop^uKoea u dp.
CANCER-TESTIS GENES mRNA OCCURRENCE IN SOLID LESIONS AND PERIPHERAL BLOOD FROM PATIENTS WITH UTERINE MYOMA
A. V. Kalugin, D.V. Novikov, E.Yu. Kontorshchikova, K.A. Shakhova, E.S. Plekhanova, A.A. Shcherbinina,
N. Gourram, A V. Tselikova, V. V. Novikov
MAGEA1-6, SSX1,2,4, XAGE1, NY-ESO-1, MAGEC1 mRNAs detection rate was investigated in peripheral blood and solid lesions of patients with uterine myoma. It was demonstrated that 86.4% of tumor lesions and 49.1% of blood samples of patients with uterine myoma expressed at least one of these mRNAs. The MAGEA1-6, XAGE1 and SSX1,2,4 mRNAs were most commonly observed.
Keywords: cancer-testis genes mRNA, uterine myoma, tumor lesion, peripheral blood.
