ВСТРЕЧАЕМОСТЬ И СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ ЦЕРЕУСНОЙ ГРУППЫ В АЭРОЗОЛЯХ АТМОСФЕРНОГО ВОЗДУХА НОВОСИБИРСКОЙ ОБЛАСТИ Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

Вестник Томского государственного университета. Биология. 2021. № 56. С. 60-85

БИОТЕХНОЛОГИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ

УДК 606:579.852.11+66.911.38(571.1) doi: 10.17223/19988591/56/3

И.С. Андреева1, А.С. Сафатов1, Л.И. Пучкова1, Е.К. Емельянова1, 2, Н.А. Соловьянова1, Г.А. Буряк1, В.А. Терновой1

'Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, р.п. Кольцово Новосибирской области, Россия 2Новосибирский государственный медицинский университет Минздрава, г. Новосибирск, Россия

Встречаемость и свойства бактерий цереусной группы в аэрозолях атмосферного воздуха Новосибирской области

Работа выполнена при поддержке Государственного задания

«Изучение биоразнообразия микроорганизмов в атмосферных аэрозолях» Отраслевой научно-исследовательской программы Роспотребнадзора на 2016-2020 гг. «Проблемно-ориентированные научные исследования в области эпид. надзора за инфекционными и паразитарными болезнями», п. 2.4.6.

Представлены данные по встречаемости и определению свойств спорообразующих бактерий группы Bacillus cereus в образцах малоизученных высотных атмосферных аэрозолей Новосибирской области, полученных при самолетном зондировании атмосферы, и в аэрозолях, отобранных в приземном слое воздуха этого же региона. Бактерии цереусной группы Bacillus cereus (Bc) и Bacillus thuringiensis (Bt), подвидов Bt ssp. kurstaki, Bt ssp. galleriae, а также изоляты Bt c неопределенным серотипом, обнаруженные как в высотных, так и в приземных аэрозолях, проявляли высокую антибиотическую активность к микроорганизмам рода Staphylococcus, Candida, Bacillus, полирезистентность по отношению к антибиотикам. При исследовании биохимических признаков бактерий данной группы обнаружены штаммы, обладающие высокой фосфатазной, протеолитической, липолитической и амилолитической активностями прирН 5,0— 9,0, что может быть использовано в биотехнологии для разработки продуцентов ферментов. Установлено, что данные бактерии продуцируют такие ферменты агрессии, как фосфолипазы, гемолизины, протеазы, нуклеолитические ферменты, являющиеся признаками патогенности. Выявлен штамм B. thuringiensis, обладающий выраженной секрецией комплекса РНКаз, перспективный для разработки противовирусных препаратов против РНК-содержащих вирусов.

Ключевые слова: Bacillus cereus; Bacillus thuringiensis; биоаэрозоли атмосферы; спорообразующие бактерии; ферментативная активность; антибиотическая активность

Для цитирования: Андреева И.С., Сафатов А.С., Пучкова Л.И., Емельянова Е.К., Соловьянова Н.А., Буряк Г. А., Терновой В.А. Встречаемость и свойства бактерий цереусной группы в аэрозолях атмосферного воздуха Новосибирской области // Вестник Томского государственного университета. Биология. 2021. №№ 56. С. 60-85. doi: 10.17223/19988591/56/3

Введение

Состав и структура сообществ бактерий, входящих в состав биоаэрозолей, формируется под воздействием многокомпонентных, меняющихся факторов среды, включающих погодные условия, географическое положение, время суток, сезон года, состав атмосферы, наличие точечных источников микроорганизмов [1, 2]. Спорообразующие бактерии группы Bacillus cereus, имеющие большое экономическое, медицинское и биологическое значение, встречаются повсеместно в почвах и воздухе, в том числе в аэрозолях пустынных [3] и тропических [4] широт, обнаруживаются в составе «органической» пыли, воздействующей на рабочих, связанных с растениеводством и производством сельскохозяйственной продукции во время полевых работ [5], и могут быть причиной возникновения инфекционных заболеваний. Транспортный перенос микроорганизмов в атмосфере фиксируется на значительные расстояния. Например, длина траектории переноса воздушных масс, содержащих бактерии цереусной группы, с юга Западной Сибири до Японии в течение 93 ч составила 4 700 км [6]. Кроме переноса на дальние расстояния, спорообразующие бактерии способны оставаться жизнеспособными и после вертикальных подъемов на высоту до 20 км [7, 8], что демонстрирует их устойчивость к УФ-индуцированному повреждению ДНК, высушиванию и экстремальным температурам [9]. Значительное внимание исследователей привлекли события, связанные с пылью в Азии и переносом ее в другие регионы, из-за их неблагоприятного воздействия на экосистемы и здоровье человека. Относительная численность видов Firmicutes существенно увеличилась в пылевых образцах (44,3 ± 5,0%) по сравнению с местными образцами без пыли (27,8 ± 4,3%) [10].

В цереусную группу бацилл до недавнего времени включали 12 видов рода Bacillus: B. cereus, B. thuringiensis, B. anthracis, B. mycoides, B. pseudomycoides, B. weihenstephanensis, B. gaemokensis, B. manliponensis, B. cytotoxicus, B. toyonensis, B. bingmayongensis, B. wiedmannii. С 2017 г. в эту группу отнесены еще 9 новых видов: B. paranthracis, B. pacificus, В. tropicus, В. albus, В. mobilis, В. luti, В. proteolyticus, В. nitratireducens, В. paramycoides [11]. Представители цереусной группы B. cereus, B. mycoides, B. weihenstephanensis, B. wiedmannii, B. cytotoxicus имеют целый ряд патогенных признаков, включая адгезины, энтеротоксины, гемолизины, являются причиной порчи пищевых продуктов [12]. B. anthracis - возбудитель сибирской язвы, B. thuringiensis - патоген насекомых, используемый в качестве биоконтролирующего агента [13]. Температурный оптимум роста большинства представителей цереусной группы бактерий позволяет отнести их к мезофиллам, однако B. weihenstephanensis, B. wiedmannii - психротоле-рантные, а B. cytotoxicus - термотолерантные микроорганизмы [14]. Причастность бактерии B. cereus к пищевым отравлениям известна с 1950-х гг. Микроорганизмы этого вида могут вызывать диарею, заболевание, похожее на газовую гангрену, пневмонию, менингиты, септицемию, бактериемию,

эндофтальмит, эндокардит, сальпингит, кожные инфекции, инфицирование мо-чевыделигельного тракта, встречаться в виде нозокомиальных инфекций [15].

Высокая ферментативная, антибиотическая, инсектицидная активности бактерий цереусной группы находят широкое применение в биотехнологии для разработки биопрепаратов различного назначения. Благодаря продукции гидролитических ферментов и широкого спектра антибиотических соединений, метаболиты B. cereus обладают высокой антимикробной активностью, в связи с чем биомасса спор введена в состав таких препаратов-пробиоти-ков, как «тойоцерин» [16], «бактисубтил», «флонивил», «цереобиоген» [17], других препаратов для медицины и ветеринарии [18]. Штаммы B. cereus патогенны для большого круга насекомых: чешуекрылых Lepidoptera, перепончатокрылых Hymenoptera, жесткокрылых Coleoptera, а также тараканов Leucophaea maderae. Считают, что факторами патогенности B. cereus служит фосфолипаза С. Однако ведущую роль среди возбудителей бактериальных болезней насекомых имеет чрезвычайно гетерогенный токси-нопродуцирующий вид B. thuringiensis, штаммы которого различаются по целому ряду физиолого-биохимических признаков, способности к синтезу ферментов, бактерициноподобных веществ, а также инсектицидности и специфичности к насекомым [13]. Сравнение инсектицидной и антимикробной активностей растворов параспоральных включений B. thuringiensis выявило существование прямой корреляции между ними. Выяснено, что морфовары B. thuringiensis могут проявлять как взаимный антагонизм, так и противоми-кробное воздействие на B.megaterium, B. subtilis, B. laterosporus [19].

В связи с накопившимися сведениями о влиянии микробиоты атмосферы на климатические процессы, способности вызывать аллергические реакции и заболевания человека, транспортироваться на большие расстояния активность исследований биогенной компоненты атмосферы в мире значительно выросла, в то время как обширная территория Сибири по-прежнему относится к малоизученным территориям. Для Западной Сибири исследования аэрозолей атмосферы сравнительно немногочисленны: проведены мониторинговые исследования состава, концентрации культивируемых микроорганизмов и суммарного белка в атмосферных высотных и приземных аэрозолях над Караканским бором, на площадках в п. Ключи и п. Кольцово Новосибирской области, выделено и охарактеризовано большое количество культивируемых бактерий и грибов [20-22]; с применением молекулярно-биологических методов в приземных аэрозолях Сибирского региона исследованы таксономический состав, сезонная и суточная динамика микробных сообществ [23], пробы отобраны в диапазоне температур 48 °С (от 26 до -22 °C). Зимой по сравнению с летом наблюдали в 5-170 раз снижение выхода ДНК, извлеченной из биомассы, находящейся в воздухе. Отдельных исследований о наличии Bacillus cereus и других представителей цереусной группы в аэрозолях атмосферного воздуха территории Западной Сибири в литературе практически не представлено.

Восполнение недостающей информации о составе, концентрации микро-биоты атмосферы Сибири, имеющей планетарное экологическое значение, поиск новых штаммов для обновления базы продуцентов биологически активных веществ с расширенным диапазоном действия, мониторинг патогенных микроорганизмов в аэрозолях воздуха для профилактики и предотвращения заболеваний - задачи с возрастающей актуальностью.

Цель данного исследования - определение встречаемости и свойств бактерий группы B. cereus в приземных атмосферных аэрозолях и в аэрозолях высотных, полученных при самолетном зондировании атмосферы Новосибирской области, расположенной на юге Западной Сибири, оценка биотехнологического потенциала выделенных микробных изолятов.

Материалы и методики исследования

Отбор образцов аэрозолей. Приземные пробы воздуха отбирали на высоте 2 м в импинджеры с расходом 50 л/мин, содержащие 50 мл раствора Хенкса «БИОЛОТ» (Россия), по 30 мин 4 раза за сутки ежемесячно на площадке, используемой в качестве примера участка с антропогенной нагрузкой, расположенной в п. Кольцово Новосибирской области. Средний объем воздуха, пропущенный через импинджер, составлял около 1 500 л. Отбор высотных проб атмосферного воздуха осуществляли над территорией Кара-канского бора в 50 км к югу от Новосибирска (границы траектории полета самолета: 54°26'38м с.ш., 82°30'47м в.д.; 54°10'55м с.ш., 81°44'00м в.д.) с помощью лаборатории «Оптик-Э», смонтированной на самолете АН-30 и затем на ТУ-134. Караканский бор исследовали как пример относительно чистого экологического эталона. Пробы отбирали в дневное время, последовательно на высотах 7 000, 5 500, 4 000, 2 000, 1 500, 1 000 и 500 м в течение 6-10 мин с использованием импинджеров с расходом 50 л/мин, содержащих 50 мл раствора Хенкса. В зависимости от времени отбора объем высотной пробы воздуха составлял 300-500 л.

Титр микроорганизмов в высотных и приземных пробах определяли в пересчете на 1 м3 атмосферного воздуха.

Образцы атмосферных аэрозолей в трех повторах высевали на стандартные питательные среды [24]: рыбный питательный агар, крахмало-амми-ачный агар, почвенный агар, среду Сабуро «ФБУН ГНЦ ПМБ» (Россия), жидкую и агаризованную среду LB «Difco» (США), позволяющие выявить микроорганизмы различных таксономических групп [24, 25], и инкубировали при температурах 28-30 и 6-10 °С в течение 3-20 суток. Индивидуальные колонии микроорганизмов использовали для получения чистых культур и последующего анализа фенотипических свойств. Влияние рН среды на рост микроорганизмов определяли при культивировании штаммов на вариантах агаризованной среды LB с рН 5,0, 7,0 и 9,0. Температурный диапазон роста определяли при культивировании штаммов на агаризованных средах

при температурах 5, 20, 30, 37, 42 и 55 °С. Морфологию клеток микроорганизмов исследовали методом фазово-контрастной микроскопии с помощью микроскопа Axioskop 40 «Carl Zeiss» (Германия). Для дальнейшего исследования отобраны 25 бактериальных изолятов по фенотипическим и геномным признакам, соответствующих бактериям группы цереус. В качестве контрольных штаммов использованы типовые штаммы из состава коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотреб-надзора: штамм B. thuringiensis ssp. kurstaki В-916, штаммы B. thuringiensis ssp. galleriae B-966 и В-997, штаммы B. cereus B-1367 и В-277.

Скрининг ферментативной активности культур. Липолитическую активность определяли на желточном агаре и агаризованной среде LB, содержащей эфиры жирных кислот, с добавлением 0,01% CaCl2. В качестве субстратов использовали 1,0% монолаурат (твин-20) и моноолеат (твин-80). Чашки со средой, засеянные испытуемыми культурами, выдерживали в термостате при 28-30 °С в течение 2 суток. Амилолитическую активность культур определяли при их высеве на крахмало-аммиачный агар, протеоли-тическую - по способности к гидролизу желатина и казеина молока [26]. Способность к гемолизу учитывали, высевая культуры на среду LB с добавлением крови барана. Нуклеазную активность исследовали на среде LB с добавлением ДНК «Sigma» (США) [26]. Содержание плазмидной ДНК в изолятах определяли скринингом по стандартной методике [26].

Способность к секреции РНКаз в культуральной среде ПДГГ при культивировании бактерий при температуре 30 °С в течение 18-24 ч определяли по накоплению кислото-растворимых продуктов, образующихся при гидролизе высокополимерной РНК дрожжей (1 мг/мл). За единицу активности ферментов принимали их количество, катализирующее образование 1 А260 кисло-торастворимых продуктов в течение 60 мин при 37 °С в 50 мМ трис-HCl, pH 8,0. Состав среды ПДГГ (г/л): пептон - 9,27, дрожжевой экстракт - 5,00, NaCl - 3,00; 10 мл 50% глицерина, 2 мл 20% глюкозы; рН 7,0-7,2 [27].

Антибиотическую активность исследуемых штаммов определяли классическим диффузионным методом отсроченного антагонизма (метод перпендикулярных штрихов) [28] на среде LB при температуре 37 °С. В качестве патогенных тест-штаммов применяли: Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Candida albicans 620, Klebsiella pneumoniae B-4894, Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium 2606, Shigella sonnei 32 из состава коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Контроль характера и активности роста тест-штаммов - их параллельный посев на чашки Петри с той же питательной средой без испытуемой культуры.

Чувствительность исследуемых культур к антибиотикам определяли диско-диффузионным методом с применением дисков производства НИЦФ (Россия).

Генетический анализ бактериальных изолятов проведен с помощью ПЦР со специфическими праймерами на 16S рРНК [29]. Нуклеиновые кислоты

выделяли из суточных вегетативных клеток, контролируя отсутствие спорообразования микроскопически. Клетки бактериальных изолятов разрушали лизирующим буфером (набор реагентов для выделения ДНК/РНК, «НПФ Литех» (Россия)) и выделяли суммарную ДНК согласно прилагаемой к набору инструкции. ПЦР проведен с использованием буфера и полимеразы производства «СибЭнзим» (Новосибирск, Россия) в соответствии с инструкцией по применению. Для проведения ПЦР использовали следующую программу: 94 °C - 10 с, 60 °C - 15 с, 72 °C - 30 с, 40 циклов, затем 72 °C -7 мин. Продукты ПЦР анализировали в 2,0% агарозном геле. Нуклеотид-ные последовательности 16S рРНК бактерий определяли на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3130xl «Hitachi» (США) с использованием набора ABI prism Big Dye terminator V3.1 cycle. Для секвенирования использовали продукты амплификации длиной 1 360 п.о. Выравнивание проведено с помощью программы «Lasergene 9». Филогенетический анализ осуществлен с помощью программного обеспечения «MEGA 7».

Выделенные штаммы микроорганизмов хранили при низкотемпературном замораживании в коллекции природных изолятов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Статистическая обработка данных. Расчет числа культивируемых микроорганизмов в пробах проведен по методу Кербера [30], при этом количество микроорганизмов усредняли по 3 параллелям высеянных проб. Среднегодовые суммарные величины численности культивируемых микроорганизмов рассчитывали как средние по повторностям ± доверительный интервал на уровне значимости 95%, применяя í-критерий Стьюдента (р < 0,05).

Результаты исследования и обсуждение

На территории юга Западной Сибири с 1998 г. проводится мониторинг биогенной компоненты аэрозолей атмосферного воздуха на высотах до 7 км, заключающийся в изучении качественного и количественного состава культивируемых микроорганизмов. Общая концентрация микроорганизмов в аэрозолях Новосибирской области, расположенной на юге Западной Сибири, составляла в разных пробах в среднем от менее единицы до 5*105 КОЕ/м3, при этом концентрация психрофильных микроорганизмов, способных расти при температуре 6-10 °С, в разных образцах могла составлять от 3,20*102 до 1,13*105 КОЕ/м3. Среди выделенных микроорганизмов преобладали бактерии, средняя концентрация грибов в образцах не превышала 10% от общего количества изолятов. Встречаемость спорообразующих микроорганизмов в высотных пробах за годы мониторинга составляла от общего количества выделяемых минимум 0,5% в 2005 г. и максимум 55% в 2011 г.; для наземных образцов - 0,1% в 2002 г. и максимум - 83% в 2016 г. Содержание бактерий цереусной группы в разных образцах также значительно отличалось, составляя от 0,1 до 6,5% от общего количества выделяемых бацилл. Среднегодовое

значение содержания спорообразующих бактерий в высотных и приземных пробах атмосферных аэрозолей представлено на рис. 1.

Рис. 1. Среднегодовое значение содержания спорообразующих бактерий в высотных (А) и приземных (В) пробах атмосферных аэрозолей Новосибирской области, % [Fig. 1. The average annual value of the content of the spore-forming bacteria in high-altitude (A) and surface (B) samples of atmospheric aerosols of Novosibirsk region], %

Количество выделяемых культивируемых спорообразующих бактерий, значительно отличающееся в разные годы наблюдения, представлено на рис. 2, данные геномного анализа - на рис. 3.

Интересно, что в исследуемых образцах аэрозолей, отобранных после длительного дождя или обильного снегопада, клетки микроорганизмов не обнаруживались или присутствовали в единичном количестве. В качестве примера такой ситуации можно привести результаты высевов зимних высотных аэрозолей от 22.12.2010, 29.01.2013, летних высотных - от 30.05.2000, 24.08.2008, приземных проб от 14-15.08.2012, от 18-19.08.2015, где культивируемые микроорганизмы отсутствовали, т.е. наблюдался своеобразный эффект вымывания частиц аэрозолей из атмосферы, что может быть одной из причин значительного отличия концентрации выделяемых микроорга-

низмов в разных образцах, а в результате - и в суммарных среднегодовых данных.

t ЩЁ1 s? ]

2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018

Год пробоотбора [Sampling year]

Высотные [Altitude] "Приземные [Surface]

1000

100

10

Рис. 2. Суммарное количество культивируемых штаммов спорообразующих бактерий, ежегодно выделяемых из образцов высотных и приземных атмосферных аэрозолей Новосибирской области [Fig. 2. The total number of cultivated strains of spore-forming bacteria annually isolated from samples of high-altitude and surface atmospheric aerosols of the Novosibirsk region]

Из приземных и высотных проб аэрозолей осени 2016 г., отобранных в период преобладания юго-западных ветров из Казахстана, характеризующихся повышенным содержанием пылевых компонентов и особо высокой численностью спорообразующих бактерий, выделены 225 бактериальных изолята, из которых 62 образовывали эндоспоры.

Штаммы спорообразующих бактерий по определению фенотипиче-ских свойств и данных геномного анализа (см. рис. 3) отнесены к родам Bacillus, Paenibacillus, Brevibacillus, Lysinibacillus, Oceanobacillus и ряду других. Среди микробных изолятов этого периода преобладали бактерии рода Bacillus, по совокупности признаков отнесенные к видам B. beringensis, B. boroniphilus, B. megaterium, B. firmus, B. korlensis, B. pumilus, B. subtilis, B. brevis, B. licheniformis и другим.

Бактерии, идентифицированные как Bacillus cereus (Bc) и Bacillus thuringiensis (Bt) подвидов Bt ssp. kurstaki, обнаружены как в высотных, так и в приземных пробах, штаммы Bt ssp. galleriae изолированы из приземных атмосферных аэрозолей.

Следует отметить, что среди бактериальных изолятов цереусной группы отсутствовали патогенные бактерии Bacillus anthracis, так как клетки всех выделенных штаммов подвижны, обладали фосфолипазой, щелочной фосфатазой, проявляли гемолитическую, плазмокоагулазную активности, устойчивы к пенициллину, что не является свойственным для бактерий вида B. anthracis (табл. 1, 2).

:ychros accharolyticus ATCC 23296

Cb960

♦ Cb870

Bacillus beringensis strain 80 Bacillus firmus isolate SI 2

♦ Cb865

Bacillus korlensis strain KSS4

♦ Cb858

64 I Brevibacterium frigoritolerans IHB B 15515 ""Cg9

♦ Cg3

Bacillus subtilis strain HSN 07 Bacillus sp. Al Dhabi 21 I Bacillus megaterium strain 202.1 -i Firmicutes bacterium JF983206 1173

♦ Cg45

lus fusiformis JF970585 lus fusiformis strain R112 lus sphaericus BPHM1

Lysin Lysin Lysin Cb968

Lysinibacillus KP723524

♦ Cb955

♦ Cg39

Bacillus cereus isolate HR55

♦ Cb989

Bacillus cereus strain 1NNNN — ♦ Cg46

♦ Cb978

♦ Cb957

Lysinibacillus sphaericus strain NCIM 2478

♦ Cb977

♦ Cb964

♦ Cg32a

Bacillus thuringiensis Bt185

♦ Cb940

Bacillus cereus isolate HR46 Bacillus anthracis strain RA3

♦ Cg42

Bacillus anthracis strain S2CB42 Bacillus halmapalus strain FJAT 44660

♦ Cb965 + Cb974

lus sphaericus strain BCH883 lus fusiformis CESNVD 1 lus sphaericus strain LSR1 lus sphaericus CLS BA8 4

_Cb961

s3l Lysinibacillus

sphaericus BI132

Cg14 "I Lysinibaci

s fusiformis strain Z6

Brevibacillus invocatus ZLynn1000 20 Cb997

Brevibacillus brevis ZLynn800 23

choshinensis JSM 05182138 nitrificans S186B

Brev Brev

♦ Cg44

♦ Cg32

vis strain B

Bacterium ocnta172lb777offp11 Brevibacterium pityocampae TSTB15 118

Рис. 3. Филогенетическоедерево,построенноедля бактерий,выделенных

из аэрозолей атмосферного воздуха, на основесравнения с известными штаммами.Анализ проведен методом«объединенияближайших соседей» с использованием 2-параметрическоймодели Кимуры [Fig.3. Thephylogenetictreeconstructedforbacteriaisolatedfromatmospheric aerosols basedon comparisonwith known strains. Theanalysis was carried out withthenearestneighbor method using theKimura 2-parametermodel]

В литературе приводятся данные анализа сходных образцов, где авторами показано, что аэрозоли, привнесенные с пылью из Азии, также содержали большее количество видов бацилл (23,8% от общего количества), чем местные образцы без пыли (13,3%), включая виды, тесно связанные с Bacillus cereus. В изолятах B. cereus, выделенных из образцов аэрозолей, со-

держащих пыль, анализ генов энтеротоксинов подтвердил наличие факторов вирулентности [10].

Таблица 1 [Table 1] Признаки штаммов бацилл, близких на филогенетическом дереве к видам Bacillus cereus и Bacillus anthracis [Characteristics of bacilli strains that are close to the species Bacillus cereus and Bacillus anthracis on the phylogenetic tree]

Штамм [Strain] Морфология клеток [Cell morphology] Размер клеток (мкм) [Cell size (цт)] Подвижность [Mobility] Эндоспоры [Endospores] Щелочная фосфатаза [Alkaline phosphatase] Фосфолипаза [Phospholipase] Плазмокоагулаза [Plasma coagulase] Гемолиз [Hemolysis] Устойчивость к пенициллину [Penicillin resistance] Паро споральные кристаллы [Parosporal crystals]

Cb-989 Палочки по 1-2 и в цепочках [1-2 rods and in chains] 1,0— 1,2х 3-5 + EST EC + + + + R —

Cg-42 -«- —«— + -«— + + + + R —

Cb-940 -«- + + + + + R —

C2-45 -«- -«- + + + + + R —

C2-39 -«- -«- + + + + + R +

Cg-46 -«- -«- + + + + + R —

Cb-946 -«- + + + + + R —

Cb-958 -«- + + + + + R —

B. cereus ATCC 10702 -«- + + + + + R —

B. cereus В-277 -«- + + + + + R —

B. cereus* -«- +/- —«— + + + R —

B. anthracis* -«- -«- — EC — — — — S —

B. thuringi-ensis* -«- +/- EST + + + + R +

Примечание: * по [31]; «+» - положительное проявление признака; «-» - отрицательное проявление признака; «+/-» - вариабельное проявление признака; EC - споры эллиптические центральные, EST - споры эллиптические субтерминальные; R - устойчив к антибиотику, S - чувствителен к антибиотику.

[Note: * according to [31]; "+" - Positive manifestation of the characteristic; "-" - Negative manifestation of the characteristic; "+/-" - Variable manifestation of the characteristic; EC - Elliptical central spores, EST - Elliptical subterminal spores; R - Antibiotic resistance, S - Antibiotic sensitivity].

Ферментативная активность. Биохимические признаки выделенных штаммов Bc и Bt довольно схожи: все исследуемые штаммы продуцировали каталазу, протеазы, обладали амилолитической, фосфатазной, желатиназ-ной, гемолитической активностями, выраженными в разной степени; ги-дролизовали глюкозу с образованием кислоты, но не газа, не утилизировали сахарозу и маннит, как правило, обладали плазмокоагулазной активностью. Выявлен штамм Bt Cb-527 с высокой нуклеазной активностью. За небольшим исключением отличия выделенных штаммов проявлялись в соответ-

ствии с видовыми характеристиками [25] в наличии или отсутствии уреазы, липазной и липолитической активностей (табл. 2).

Таблица 2 [Table 2] Биохимические признаки штаммов Bacillus cereus и Bacillus thuringiensis, выделенных из атмосферных аэрозолей [Biochemical characteristics of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains isolated from atmospheric airaerosols]

Штамм [Strain] Кристаллы [Crystals] Амилаза [Amylase] Уреаза [Ureaza] Желатиназа [Gelatinase] Казеиназа [Caseinaza] Фосфолипазы [Phospholipases] Липаза [Lipase] Фосфатаза [Phosphatase] Гемолизины [Hemolysins] Плазмокоагулаза [Plasma coagulase] Гидролиз [Hydrolysis]

Сахароза [Sucrose] Глюкоза [Glucose] Маннит [Mannit]

Bc B-1367 - ± — + + + — + + + — К —

Bc B-277 — + — + + + — + + + — K —

Bc Cb-946 - + — ± + + — + + + — К —

Bc Cb-958 — + — + + + — + + + — К —

Bc Cb- 989 — + — + + + — + + + — К —

Bc Cg-45 — + — + + + — + + + — К —

Bc Cg-42 — + — + + + — + + + — К —

Bc C2-39 — + — ± + + — + + + — К —

Bc Cg-46 — + — ± + + — + + + — К —

Btk 24-17 + + + + + + + + ± + — К —

Btk 18-15 + + + ± + + + + + — — К —

Btk 32-04 + + + + + + — + ± + — К —

Btk 50-04 + + + ± + + — + ± + — К —

Btk 18-05 + + ± — + + — + + + — К —

Btk 09-01-40 + + ± + + + + + + + — К —

Btk 32-04 + + + + + + + + + + — К —

Btk 63-04 + + + + + + + + ± ± — К —

Btk 41-18 + + + + + + + + ± + — К —

Btk 100-04 + + + + + + + + + + — К —

Btk 118-17 + + ± + + + + + ± + — К —

Btk 78-04 + + + + + + + + + ± — К —

Btk 31-04 + + + + + + + + ± + — К —

Btk 5-18 + + + ± + + + + ± ± — К —

Btg Sn-50 + + + ± + — + + ± ± — К —

Btg Sn-56 + + + ± + — + + ± ± — К —

Btg Sn-60 + + + ± + — + + ± ± — К —

Btg Sn-66 + + + ± + — + + ± ± — К —

Bt Cb-527 + + — + + + — + + + — К —

Btg B-996 + + + + + — + + ± + — К —

Btg B-997 + + + + + — + + ± + — К —

Btk B-916 + + + + + + + + ± + — К —

B.cereus* — + — + + + — + + + — К —

B. anthracis* — + + + + — + — — — + К —

B. thuringiensis* + + + + + + + + + + — К —

Примечание: * по [31]; «+» - положительная реакция; «-» - отрицательная реакция; «±» - слабо выраженная реакция; «К» - гидролиз углевода с образованием кислоты; Вс -Bacillus cereus; Bt - Bacillus thuringiensis; Btk - Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki; Btg -Bacillus thuringiensis ssp. galleriae.

[Note: * according to [31]; "+" Positive reaction; "-" Negative reaction; "±" - Weakly expressed reaction; "K" - Hydrolysis of carbohydrate to form an acid; Вс - Bacillus cereus; Bt - Bacillus thuringiensis; Btk -Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki; Btg - Bacillus thuringiensis ssp. galleriae].

Сведения по резистентности к антибиотикам одинаково важны как при использовании микроорганизмов в биотехнологических процессах в качестве, например, селективного агента, так и для возможности ограничения развития вызываемых ими инфекций. Данные по резистентности исследуемых штаммов к антибиотикам представлены в табл. 3.

Таблица 3 [Table 3]

Чувствительность штаммов Bacillus cereus и Bacillus thuringiensis к антибиотикам [Sensitivity of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains to antibiotics]

Штамм [Strain] Антибиотики (м [Antibiotics (|i кг/диск)/ зона подавления роста в мм g / disc) / growth inhibition zone in mm]

Ванкомицин (30) [Vancomycin] Клиндамицин (2) [Clindamycin] Левофлоксацин (30) [Levofloxacin] Ципрофлоксацин (30) [Ciprofloxacin] Гентамицин (10) [Gentamicin] Линкомицин (15) [Lincomycin] Амикацин (30) [Amikacin] Канамицин (30) [Kanamycin] Цефаклор (30) [Cefaclor] Цефалексин (30) [Cephalexin] Цефалотин (30) [Cephalothin] Рифампицин (5) [Rifampicin] Меропенем (10) [Meropenem] Фузидин (10) [Fuzidin]

Вс B 1367 22 22 25 25 20 12 20 20 25 18 15 12 17 18

Bc B-277 15 16 20 14 20 15 20 15 0 18 0 10 10 12

Вс Cb 946 0 19 22 24 24 0 12 0 15 22 0 12 0 15

Вс Cb 958 18 19 23 27 20 10 23 14 23 10 0 10 20 15

Вс Cb 989 30 15 30 27 0 10 0 35 35 12 14 16 20 20

Вс Cg 45 17 23 20 11 18 0 20 16 0 12 0 0 11 11

Вс Cg 42 13 0 0 20 12 0 0 15 0 16 0 0 12 12

Вс Cg 42 15 22 0 20 21 12 19 14 0 18 0 14 17 11

Вс Cg 39 8 0 14 27 11 12 25 15 28 15 12 15 24 22

Вс Cg 46 12 0 15 25 20 10 20 23 25 15 10 15 18 20

Btk 24-17 17 21 25 24 19 0 21 0 0 0 0 14 0 0

Btk 18-05 20 26 24 30 25 18 0 13 12 10 0 18 16 20

Btk 32-04 0 20 16 28 20 20 16 12 0 0 0 10 0 0

Btk 50-04 0 24 28 15 22 12 24 18 15 20 9 15 0 25

Btk 18-15 17 19 20 12 0 9 11 0 0 0 0 12 9 11

Btk 01-40 18 0 25 29 21 17 19 15 0 15 0 0 19 20

Btk 32-04 19 21 25 30 21 0 0 0 0 20 0 15 22 17

Btk 63-04 16 21 24 21 18 0 15 0 0 0 0 14 0 15

Btk 41-18 17 23 24 12 22 13 14 15 11 23 20 16 21 20

Btk 100-04 20 24 28 26 25 25 25 20 0 17 0 10 15 23

Btk 118-17 20 20 24 24 22 18 22 20 10 16 0 20 20 20

Btk 78-04 20 24 0 27 0 0 21 14 9 0 0 11 0 20

Btk 31-04 10 19 26 25 24 19 25 0 0 0 0 12 13 15

Btk 5-18 11 10 11 18 21 18 10 0 0 0 0 8 0 19

Bt Cb-527 17 20 20 23 21 0 21 20 20 20 27 12 14 12

Btg Sn-50 11 10 16 10 9 11 11 0 0 0 0 10 0 12

Btg Sn-56 17 24 22 24 20 16 18 13 0 0 0 14 14 12

Btg Sn-60 19 25 25 26 19 10 9 9 0 0 0 10 0 13

Btg Sn-66 17 23 23 0 21 13 10 17 0 0 0 11 9 12

Btk B-916 19 23 19 20 19 0 14 0 10 0 0 18 0 19

Btg B-996 0 26 23 0 20 20 19 18 10 15 10 10 0 10

Btg B-997 20 23 25 0 24 13 11 15 0 0 13 24 12 15

Примечание [Note]: Вс - Bacillus cereus; Bt - Bacillus thuringiensis; Btk - Bacillus

thuringiensis ssp. kurstaki; Btg - Bacillus thuringiensis ssp. galleriae.

В многочисленных литературных источниках отмечается, что большинство изолятов B. cereus устойчиво к пенициллинам и цефалоспоринам, что рассматривается как следствие продукции ß-лактамаз [32]. Ряд работ, касающихся изучения чувствительности штаммов B. cereus к антибиотикам, показывает, что за последние десятилетия к некоторым из препаратов начинает формироваться резистентность, не характерная ранее [33]. Исследования последних лет свидетельствуют о присутствии бактерий вида B. cereus, содержащих как множественные гены токсина, так и проявляющих мультиу-стойчивость к антибиотикам, в природных источниках и в качестве конта-минантов различных продуктов [34].

Выяснено, что все исследуемые в настоящей работе штаммы Bc и Bt резистентны к полимиксину, оксациллину, бензилпенициллину, а также к цефу-роксиму (данные в таблицу не внесены), что согласуется с литературными сведениями [33]. Исключение составляли штаммы Вс В-1367 и Bt Cb-527, проявившие к данным антибиотикам высокую чувствительность. Большая часть штаммов оказалась резистентной к цефалоспоринам (цефалексину, цефалотину и цефаклору). Важно отметить, что выделенные из аэрозолей штаммы Вс, кроме штамма Bc Cg-45, показали высокую чувствительность к ципрофлоксацину, но очень отличались по восприимчивости к ванкомицину, отмеченным на практике как антибиотики резерва, эффективные в лечении инфекции B. cereus (см. табл. 3). Высокую чувствительность все штаммы Bc и Bt проявили к рокситромицину, эритромицину и, за исключением штамма Bt 24-17, к линезолиду (данные в табл. 3 не приведены). Кроме штаммов Bt Cb-527 и Bc B-1367, все исследуемые штаммы цереусной группы оказались полирезистентными, проявляя устойчивость к шести-пятнадцати антибиотикам.

Антибиотическая активность. В разной степени выделенные из аэрозолей штаммы Bt и Bc подавляли рост патогенных дрожжей C. albicans, наибольшую активность проявили штаммы Btk 24-17, 18-15, 09-01-40, 63-04 (табл. 4). Антифунгальное действие штаммов Bt обусловливается продукцией ферментов из класса гидролаз и антибиотических соединений [35]. Штамм Bt Cb-527 и ряд штаммов Bc дополнительно эффективно угнетали рост грам-положительных тест-штаммов S. aureus, B. subtilis. Грамотрицательные тест-штаммы проявили значительно меньшую чувствительность к антибиотическому действию штаммов Bt и Bc: угнетение роста штамма E. coli наблюдали под воздействием секретируемых метаболитов штаммов Btk 5-18, 41-18, 0901-40; штаммы Btk 24-17, 63-04, 118-17 и 5-18 ограничивали рост штамма S. thyphimurium. Штамм K. pneumoniae проявил резистентность относительно всех штаммов Bt и Bc, используемых в опыте. Следует отметить также, что типовой коллекционный штамм Bc B-1367 значительно уступал природным аэроизолятам по устойчивости к антибиотикам и антимикробной активности (см. табл. 3, 4).

Противомикробная активность бактерий цереусной группы, в частности B. thuringiensis, ранее показана по отношению к бактериям Bacillus subtilis,

Erwinia herbicola, Erwinia amylovory, Pantoea agglomerans, Enterococcus avium, Staphylococcus aureus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumilis, Bacillus thuringiensis [36], противогрибковая активность - по отношению к грибам рода Aspergillus [35]. Известна также литическая активность B. cereus к цианобактериям [37], показана продукция штаммов B. cereus UW85 двух фунгистатических антибиотиков, подавляющих рост патогенного гриба Phytophthora medicaginis [39]. Подтверждение сведений об активности бактерий цереусной группы против близкородственных бактерий [19, 35] - антагонизм штаммов B. thuringiensis ssp. galleriae B-996 и B-997 по отношению к штаммам B. cereus В-277 и В-1367. Зона лизиса этих бактерий под влиянием секретируемых метаболитов штаммов Btg B-996 и B-997 при применении метода отсроченного антагонизма составляла 16 мм (данные в табл. 3 не внесены). Зоны угнетения роста тест-штаммов в условиях проведенного опыта менее 10 мм пренебрежимо малы и отнесены к отрицательным результатам.

Таблица 4 [Table 4] Антибиотическая активность штаммов Bacillus cereus и Bacillus thuringiensis, выделенных из атмосферных аэрозолей [Antibiotic activity of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains isolated from atmospheric aerosols]

Штамм [Strain] Тест-штаммы пато [Test strains of patho генов / зона угнетения роста, мм gens / zone of growth inhibition, mm]

Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Candida albicans Klebsiella pneumoniae Escherichia coli Salmonella typhimurium Shigella sonnei

Bc B-1367 0 0 24 0 0 0 0

Bc B-277 20 12 25 0 0 OR OR

Bc Cb-946 30 25 25 0 0 0 OR

Bc Cb-958 25 25 23 0 0 0 0

Bc Cb-989 0 0 26 0 0 OR OR

Bc Cg-45 0 0 10 0 0 0 0

Bc Cg-42 30 25 23 0 0 0 0

Bc Cg-39 20 30 15 0 0 0 0

Bc Cg-46 25 25 26 5 0 0 0

Btk 24-17 7 0 41 0 0 17 5

Btk 18-15 11 0 45 0 0 12 5

Btk 32-04 6 0 35 0 0 10 6

Btk 50-04 5 0 30 0 6 4 4

Btk 09-01-40 7 0 46 0 17 11 4

Btk 32-04 6 0 35 0 30 10 6

Btk 63-04 4 0 40 0 4 20 8

Btk 41-18 5 0 42 0 30 10 7

Btk 100-04 3 0 40 0 16 6 7

Btk 118-17 6 6 25 0 0 25 6

Окончание табл. 4 [Table 4 (end)]

Штамм [Strain] Тест-штаммы пато [Test strains of patho генов / зона угнетения роста, мм gens / zone of growth inhibition, mml

Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Candida albicans Klebsiella pneumoniae Escherichia coli Salmonella typhimurium Shigella sonnei

Btk 78-04 9 0 41 0 6 14 5

Btk 31-04 3 0 28 0 6 4 4

Btk 5-18 10 0 30 0 33 30 11

Bt Cb-527 30 25 22 0 0 0 0

Btg Sn-50 0 0 40 0 0 0 0

Btg Sn-56 0 0 25 0 0 0 0

Btg Sn-60 7 0 40 0 0 0 0

Btg Sn-66 7 0 20 0 0 0 0

Btk B-916 5 0 40 0 0 5 0

Btg B-996 7 15 45 0 0 7 0

Btg B-997 7 10 40 0 0 7 0

Примечание [Note]: Вс - Bacillus cereus; Bt - Bacillus thuringiensis; Btk - Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki; Btg - Bacillus thuringiensis ssp. galleriae; OR - ослабление роста [the weakening of growth].

Штамм Cb-527, идентифицированный согласно фенотипическим признакам как Bacillus thuringiensis (колл. № В-1378), в отличие от других выделенных штаммов Bt имел неподвижные клетки, при культивировании в жидкой среде на термостатированной качалке образующие крупные агрегаты (хлопья) (рис. 4, А), которые при прекращении перемешивания среды в короткое время осаждались в виде рыхлого осадка (рис. 4, B). Есть мнение, что агрегация клеток может быть стратегией повышения их выживаемости в суровых условиях, таких, например, как высокая доза ультрафиолетового излучения на большой высоте [9]. Клетки штамма Bt Cb-527 образовывали мощные капсулы (рис. 4, C), что не характерно для типовых штаммов Bt, процесс активного образования эндоспор и параспоральных кристаллов при его выращивании в жидкой среде при температуре 37 °С начинался уже к 24 ч культивирования (у других выделенных штаммов Bt - на 3-5-е сутки).

Штамм Bt Cb-527 отличался также от других изолированных из аэрозолей штаммов Bt высокой чувствительностью к антибиотическим препаратам (к 17 из 21 антибиотика, использованного в опыте). В отличие от остальных штаммов Bt штамм Bt Cb-527 имел сходную со штаммами Bc высокую антимикробную активность относительно грамположительных штаммов S. aureus, B. subtilis (см. табл. 3). Обнаруженные особенности штамма Bt Cb-527 могут быть обусловлены характерным для цереусной группы обменом плазмидами как между B. thuringiensis, так и другими близкородственными видами, принадлежащими к группе Bacillus cereus [39]. Плазмидные ДНК представляют особый интерес как содержащие внехромосомные гены резистентности к

антибиотикам и другим факторам среды обитания. Анализ штаммов ВХ и Вс, изолированных из аэрозолей, показал, что как характерно для этих видов [39], все они содержат плазмиды. Электрофореграммы, отражающие состав плаз-мидных ДНК и их подвижность, для всех штаммов оказались достаточно сходными. Анализ, подтверждающий резистентность штаммов к антибиотикам в зависимости от состава и наличия плазмид, в настоящей работе не проводили.

Штамм ВХ СЬ-527 продуцировал комплекс РНКаз с концентрацией до 350-400 е.а./мл культуральной жидкости (КЖ). Ранее проведенными экспериментами нами показана противовирусная активность отдельных фракций КЖ штаммов В. thuringiensis, содержащих внеклеточные низкомолекулярные (от 15 до 20 кДа) и высокомолекулярные РНКазы (порядка 55 кДа), по отношению к вирусу гриппа человека А/АюЫ/2/68 (Н3К2) и вирусу гриппа птиц А/сЫскеп/Кш^ап/05/2005 (Н5Ш) [40], что согласуется с литературным данными о противовирусной активности бактериальных РНКаз против вирусов, в качестве нуклеиновой кислоты содержащих РНК [41]. Высокая концентрация РНКаз, секретируемых штаммом В. thuringiensis СЬ-527, свидетельствует о перспективности его использования для разработки препаратов, направленных на подавление размножения РНК-содержащих вирусов. Дополнительные исследования позволят более точно идентифицировать штамм ВХ СЬ-527 и оптимизировать возможности его биотехнологического применения в качестве противовирусного средства.

Рис. 4. Морфология клеток и особенности роста штамма Bacillus thuringiensis Cb-527 в жидкой среде (фото И.С. Андреевой): А - клетки штамма B. thuringiensis Cb-527 в скоплениях (хлопьях) при культивировании в жидкой среде (фазовый контраст, х2500); В - осадок клеток штамма B. thuringiensis Cb-527 при культивировании в жидкой среде (слева), - штамм ВacШus сereus В-277, среда равномерно мутная (справа); С - кристаллы, споры и капсулы клеток штамма B. thuringiensis Cb-527 (фазовый контраст, *2500)

[Fig. 4. The morphology of cells and the growth characteristics of strain Bacillus thuringiensis Cb-527 in a liquid medium (Photo by Irina Andreeva): A. B. thuringiensis Cb-527 strain cells in clusters (flakes) when cultured in a liquid medium (phase contrast, x2500); В. On the left - The sediment of cells of the B. thuringiensis Cb-527 strain when cultured in a liquid medium; on the right - the Bacillus cereus B-277 strain, the medium is uniformly turbid; C. Crystals, spores and capsules of B. thuringiensis Cb-527

(phase contrast, x2500)]

Заключение

В результате многолетнего мониторинга биогенной компоненты атмосферы Новосибирской области, расположенной на юге Западной Сибири, показано, что значение концентрации микроорганизмов в исследуемых аэрозолях колебалось в разных пробах в среднем от менее единицы до 5*105 КОЕ/м3. Численность культивируемых спорообразующих бактерий, включая бактерии группы цереус, в разные временные периоды также была переменчива, титр выделяемых изолятов в разных пробах мог отличаться на 5 порядков.

В исследованных образцах выделены бактерии B. cereus и B. thuringiensis, в том числе подвидов Bt ssp. kurstaki, Bt ssp. galleriae. Показано характерное для представителей этих таксонов наличие таких ферментов агрессии, как фосфолипазы, гемолизины, протеазы, нуклеолитические ферменты. За исключением штаммов Вс В-1367 и Bt Cb-527, все штаммы аэроизолятов B. cereus и B. thuringiensis проявили множественную устойчивость по отношению к антибиотикам, подтверждая литературные данные о все большем распространении полирезистентности среди выявляемых природных микробных изолятов. Выраженная антибиотическая активность штаммов B. cereus и B. thuringiensis показана относительно возбудителя кандидозов Candida albicans и грамположительных штаммов S. aureus и B. subtilis, в единичных случаях - против штаммов B. cereus.

Из аэрозолей атмосферного воздуха выделен атипичный новый штамм B. thuringiensis Cb-527, обладающий высокой продукцией РНКаз, что позволяет рекомендовать его для разработки противовирусных препаратов против РНК содержащих вирусов. Штаммы B. cereus и B. thuringiensis, проявившие выраженную ферментативную, антибиотическую активность, депонированы в Коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора для дальнейших разработок в качестве источников ферментов и соединений, ингибирующих развитие патогенных микроорганизмов и вирусов.

Литература

1. Smets W., Moretti S., Denys S., Lebeer S. Airborne bacteria in the atmosphere: Presence, purpose, and potential // Atmospheric Environment. 2016. Vol. 139. PP. 214-221. doi: 10.1016/j.atmosenv.2016.05.038

2. Wei K., Zheng Y., Li J., Shen F., Zou Z., Fan H., Li X., Wu C., Yao M. Microbial aerosol characteristics in highly polluted and near-pristine environments featuring different climatic conditions// Science Bulletin. 2015. Vol. 60. PP. 1439-1447. doi: 10.1007/s11434-015-0868-y

3. Soleimani Z., Goudarzi G., Sorooshian A., Marzouni M.B., Maleki H. Impact of Middle Eastern dust storms on indoor and outdoor composition of bioaerosol // Atmospheric Environment. 2016. Vol. 138. PP. 135-143. doi: 10.1016/j.atmosenv.2016.05.023

4. Akila M., Priyamvada H., Ravikrishna R., Gunthe S.S. Characterization of bacterial diversity and ice-nucleating ability during different monsoon seasons over a southern tropical Indian region // Atmospheric Environment. 2018. Vol. 191. PP. 387-394. doi: 10.1016/j.atmosenv.2018.08.026

5. Madsen A.M., Zervas A., Tendal K., Nielsen J.L. Microbial diversity in bioaerosol samples causing ODTS compared to reference bioaerosol samples as measured using Illumina sequencing and MALDI-TOF // Environmental Research. 2015. Vol. 140. PP. 255-267. doi: 10.1016/j.envres.2015.03.027

6. Kobayashi F., Maki T., Kakikawa M., Yamada M., Puspitasari F., Iwasaka Y. Bioprocess of Kosa bioaerosols: Effect of ultraviolet radiation on airborne bacteria within Kosa (Asian dust) // Journal of Bioscience and Bioengineering. 2015. Vol. 119, № 5. PP. 570-579. doi: 10.1016/j.jbiosc.2014.10.015

7. Griffin D.W. Terrestrial microorganisms at an altitude of 20,000 m in Earth's atmosphere // Aerobiologia. 2000. Vol. 20, № 2. PP. 135-140. doi: 10.1023/B:AE R0.0000032948.84077.12

8. Griffin D.W. Atmospheric movement of microorganisms in clouds of desert dust and implications for human health // Clinical Microbiology Reviews. 2007. Vol. 20, № 3. PP. 459-477. doi: 10.1128/CMR.00039-06

9. Yang Y., Itahashi S., Yokobori S.I., Yamagishi A. UV-resistant bacteria isolated from upper troposphere and lower stratosphere // Biological Science in Space. 2008. Vol. 22. PP. 1825. doi: 10.2187/bss.22.18

10. Yoo K., Han I., Ko K.S., Lee T.K., Yoo H., Khan M.I., Tiedje J.M., Park J. Bacillus-dominant airborne bacterial communities identified during Asian dust events // Microbial Ecology. 2019. Vol. 78. PP. 677-687. doi: 10.1007/s00248-019-01348-0

11. Liu Y., Du J., Lai Q., Zeng R., Ye D., Xu J., Shao Z. Proposal of nine novel species of the Bacillus cereus group // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2017. Vol. 67, № 8. PP. 2499-2508. doi: 10.1099/ijsem.0.001821

12. Buehler A.J., Martin N.H., Boor K.J., Wiedmann M. Psychrotolerant spore-former growth characterization for the development of a dairy spoilage predictive model // Journal of Dairy Science. 2018. Vol. 101, № 8. PP. 6964-6981. doi: 10.3168/jds.2018-14501

13. Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты / под ред. В.В. Глупова. М. : Круглый год, 2001. 736 с.

14. Ramarao N., Lereclus D., Sorokin A. The Bacillus cereus group // Molecular Medical Microbiology / eds by Y.-W. Tang, M. Sussman, D. Liu, I. Poxton, J. Schwartzman. Vol. 2, Chapter 59. New York : Elsevier, 2015. PP. 1041-1078.

15. Bottone E.J. Bacillus cereus, a Volatile Human Pathogen // Clinical Microbiology Reviews. 2010. Vol. 23, № 2. PP. 382-398. doi: 10.1128/CMR.00073-09

16. Williams L.D., Burdock G.A., Jiménez G., Castillo M. Literature review on the safety of Toyocerin, a non-toxigenic and non-pathogenic Bacillus cereus var. toyoi preparation // Regulatory Toxicology and Pharmacology. 2009. Vol. 55, № 2. PP. 236-246. doi: 10.1016/j. yrtph.2009.07.009

17. Похиленко В.Д., Перелыгин В.В. Пробиотики на основе спорообразующих бактерий и их безопасность // Химическая и биологическая безопасность. 2007. № 2-3. С. 2041. URL: http://www.cbsafety.ru/rus/saf_32_2f.pdf (дата обращения: 08.11.2021).

18. Мефёд К.М., Осипова И.Г., Васильева Е.А. Результаты сравнительного исследования новых ветеринарных пробиотиков ирилис и пацифлор // Вестник Российского университета дружбы народов. Серия: Медицина. 2006. № 2. С. 27-31. URL: https:// cyberleninka.ru/article/n/rezultaty-sravnitelnogo-issledovaniya-novyh-veterinarnyh-probiotikov-irilis-i-patsiflor/viewer (дата обращения: 08.11.2021).

19. Yeo I.C., Lee N.K., Cha C.-J., Hahm Y.T. Narrow antagonistic activity of antimicrobial peptide from Bacillus subtilis SCK-2 against Bacillus cereus // Journal of Bioscience and Bioengineering. 2011. Vol. 112, № 4. PP. 338-344. doi: 10.1016/j.jbiosc.2011.06.011

20. Safatov A.S., Andreeva I.S., Buryak G.A., Marchenko V.V., Ol'kin S.E., Reznikova I.K., Repin V.E., Sergeev A.N., Belan B.D., Panchenko M.V. Tropospheric bioaerosols of Southwestern Siberia: Their concentrations and variability, distributions and long-term

dynamics // Nucleation and Atmospheric Aerosols / eds by C.D. O'Dowd, P.E. Wagner. Dordrecht : Springer, 2007. PP. 741-745. doi: 10.1007/978-1-4020-6475-3_146

21. Андреева И.С., Сафатов А.С., Пучкова Л.И., Емельянова Е.К., Буряк Г.А., Олькин С.Е., Резникова И.К., Охлопкова О.В. Культивируемые микроорганизмы в высотных пробах аэрозолей воздуха севера Сибири в ходе самолетного зондирования атмосферы // Вестник Нижневартовского государственного университета. 2019. № 2. С. 3-11. doi: 10.36906/2311-4444/19-2/01; URL: https://e.lanbook.com/journal/ issue/312018 (дата обращения: 08.11.2021).

22. Andreeva I.S., Safatov A.S., Morozova V.V., Tikunova N.V., Emelyanova E.K., Solovyanova N.A., Babkin I.V., Buryak G.A., Puchkova L.I. Saprophytic and pathogenic yeasts in atmospheric aerosols of Southwestern Siberia // Atmospheric and Oceanic Optics. 2020. Vol. 33, № 5. PP. 505-511. doi: 10.1134/S1024856020050024

23. Gusareva E.S., Gaultier N.P.E., Premkrishnan B.N.V., Kee C., Lim S.B.Y., Heinle C.E., Purbojati R.W., Nee A.P., Loha S.R., Yanqing K., Kharkov V.N., Drautz-Moses D.I., Stepanov V.A., Schuster S.C. Taxonomic composition and seasonal dynamics of the air microbiome in West Siberia // Scientific Reports. 2020. Vol. 10, № 1. PP. 21515. doi: 10.1038/s41598-020-78604-8

24. Методы общей бактериологии. Т. 3 / под ред. Ф. Герхарда, Р. Мюррэя, Р. Костилоу, Ю. Нестера, В. Вуда, Н. Крита, Г. Филипса. М. : Мир, 1984. 264 с.

25. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Volume 3. The Firmicutes / еds by P. Vos,

G. Garrity, D. Jones, N.R. Krieg, W. Ludwig, F.A. Rainey, W.B. Whitman. Springer-Verlag,

2009. 1450 p.

26. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М. : Мир, 1984. 480 с.

27. Yasuda T., Nadano D., Tenjo E., Takeshita H., Kishi K. The zymogram method for detection of ribonucleases after isoelectric focusing: analysis of multiple forms of human, bovine, and microbial enzymes // Anal. Biochem. 1992. № 206 (1). РР. 172-177. doi: 10.1016/s0003-2697(05)80029-6

28. Singh V., Haque S., Singh H., Verma J., Vibha K., Singh R., Jawed A., Tripathi CR.M. Issolation, Screening, and Identification of Novel Isolates of Actinomycetes from India for Antimicrobial Applications // Front. Microbiol. 2016. № 7. РР. 1-9. doi: 10.3389/ fmicb.2016.01921

29. Wang Y., Qian P.-Y. Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies // PLoS One. 2009. Vol. 10. Articlee 7401. doi: 10.1371/journal.pone.0007401

30. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л. : Медгиз, 1962. 180 с.

31. Руководство по медицинской микробиологии. Частная медицинская микробиология и этиологическая диагностика инфекций. Кн. II / под ред. А.С. Лабинской,

H.Н. Костюковой, С.М. Ивановой. М. : БИНОМ, 2010. 1152 с.

32. Bottone E.J. Bacillus cereus, a volatile human pathogen // Clinical Microbiology Review.

2010. Vol. 23, № 2. PP. 382-398. doi: 10.1128/CMR00073-09

33. Страчунский Л.С., Козлов С.Н. Современная антимикробная химиотерапия. Руководство для врачей. М. : Боргес, 2002. 432 c.

34. Yibar A., Qetinkaya F., Soyutemiz E., Yaman G. Prevalence, enterotoxin production and antibiotic resistance of Bacillus cereus isolated from milk and cheese // Kafkas Universitesi Veteriner Fakultesi Dergisi. 2017. Vol. 23, № 4. PP. 635-642. doi: 10.9775/kvfd.2017.17480

35. Kumar S.N., Mohandas C., Nambisan B. Purification of an antifungal compound, cyclo(l-Pro-d-Leu) for cereals produced by Bacillus cereus subsp. thuringiensis associated with entomopathogenic nematode // Microbiological Research. 2013. Vol. 168, № 5. PP. 278288. doi: 10.1016/j.micres.2012.12.003

36. Zheng D., Zeng Z., Xue B., Deng Y., Sun M., Tang Y.-J., Ruan L. Bacillus thuringiensis produces the lipopeptide thumolycin to antagonize microbes and nematodes // Microbiological Research. 2018. Vol. 215. PP. 22-28. doi: 10.1016/j.micres.2018.06.004

37. Nakamura N., Nakano K., Sugiura N., Matsumura M. A novel cyanobacteriolytic bacterium, Bacillus cereus, isolated from a Eutrophic Lake // Journal of Bioscience and Bioengineering. 2003. Vol. 95, № 2. PP. 179-184. doi: 10.1016/s1389-1723(03)80125-1

38. Silo-Suh L.A., Lethbridge B.J., Raffel S.J., He H., Clardy J., Handelsman J.O. Biological activities of two fungistatic antibiotics produced by Bacillus cereus UW85 // Applied and Environmental Microbiology. 1994. Vol. 60, № 6. PP. 2023-2030. doi: 0.1128/ aem.60.6.2023-2030.1994

39. Vilas-Boas G.T., Santos C.A. Conjugation in Bacillus thuringiensis: Insights into the plasmids exchange process // Bacillus thuringiensis Biotechnology / ed. by E. Sansinenea. Dordrecht : Springer, 2012. doi: 10.1007/978-94-007-3021-2_8

40. Андреева И.С., Закабунин А.С. Исследование внеклеточных нуклеотических ферментов штаммов Bacillus thuringiensis методом зимографии // Colloquium-Journal. 2017. № 2 (2). С. 7-14. URL: https://www.elibrary.ru/item.asp?id=28922173 (дата обращения: 16.11.2021).

41. Shah Mahmud R., Ilinskaya O.N. Antiviral activity of binase against pandemic influenza A (H1N1) virus // Acta Naturae. 2013.Vol. 5, № 4 (19). PP. 44-51. doi: 10.32607/207582512013-5-4-44-51

Поступила в редакцию 04.04.2021 г.; повторно 17.08.2021 г.;

принята 25.11.2021 г.; опубликована 29.12.2021 г.

Авторский коллектив:

Андреева Ирина Сергеевна, канд. биол. наук, доцент, в.н.с. отдела биофизики и экологических исследований, Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора (Россия, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область).

E-mail: [email protected]

Cафатов Александр Сергеевич, д-р техн. наук, зав. отделом биофизики и экологических исследований, Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора (Россия, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область).

E-mail: [email protected]

Пучкова Лариса Ивановна, канд. биол. наук, в.н.с. отдела биофизики и экологических исследований, Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора (Россия, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область). E-mail: [email protected]

Емельянова Елена Константиновна, канд. биол. наук, с.н.с. отдела биофизики и экологических исследований, Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора (Россия, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область); доцент кафедры гигиены и экологии, Новосибирский государственный медицинский университет (Россия, 630091, г Новосибирск, Красный проспект, 52). E-mail: [email protected]

Соловьянова Надежда Алексеевна, н.с. отдела биофизики и экологических исследований, Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора (Россия, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область). E-mail: [email protected]

Буряк Галина Алексеевна, н.с. отдела биофизики и экологических исследований, Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора (Россия, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область). E-mail: [email protected]

Терновой Владимир Александрович, канд. биол. наук, зав. лабораторией отдела молекулярной вирусологии, Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора (Россия, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область).

E-mail: [email protected]

For citation: Andreeva IS, Safatov AS, Puchkova LI, Emelyanova EK, Solovyanova NA, Buryak GA, Ternovoi VA. Occurrence and characteristics of Bacillus cereus group bacterial atmospheric aerosols in Novosibirsk region. Vestnik Tomskogo gosudarstvennogo universiteta. Biologiya = Tomsk State University Journal of Biology. 2021;56:60-85. doi: 10.17223/19988591/56/3

Irina S. Andreeva1, Aleksandr S. Safatov1, Larisa I. Puchkova1, Elena K Emelyanova12, Nadezda A. Solovyanova1, Galina A. Buryak1, Vladimir A. Ternovoi1

'State Scientific Research Center of Virology and Biotechnology "Vector" of Rospotrebnadzor, Koltsovo, Novosibirsk region, Russian Federation

2Novosibirsk State Medical University of the Ministry of Health, Novosibirsk, Russian Federation

Occurrence and characteristics of Bacillus cereus group bacterial atmospheric aerosols in Novosibirsk region

The microbial diversity of atmospheric bioaerosols involves microorganisms that can cause allergic and infectious diseases or toxic effects. They include bacteria of the Bacillus cereus group (B. cereus, B. thuringiensis, B. anthracis, B. mycoides, B. pseudomycoides, etc.), which can result in diarrhea, pneumonia, meningitis, septicemia, and other infectious diseases. Accordingly, monitoring the presence of Bacillus cereus group bacteria in aerosols is critical. However, practically no data exist on Bacillus cereus and other cereus-group bacteria in southwestern Siberia's poorly investigated atmospheric aerosol environment. Bacteria of the cereus group are capable of effective production of various biologically active compounds, with important implications for biotechnology; microorganism strains with new capabilities are being investigated. This study aimed to determine the occurrence and characteristics of B. cereus group bacteria in ground-level and high-altitude atmospheric aerosols in Novosibirsk region of southwestern Siberia, and to evaluate the biotechnological potential of the obtained microbial isolates.

High-altitude atmospheric samples were collected over Karakan Pine Forest, approximately 50 km south ofNovosibirsk, at altitudes of7000, 5500, 4000, 2000, 1500, 1000, and 500 m, by aircraft sounding. Boundaries of the aircraft flight path: 54° 26'38'' N, 82° 30'47'' E; 54°10'55'' N, 81° 44'00'' E. Ground-level samples were collected at various sites in Koltsovo settlement, Novosibirsk region. Impingers with a flow rate of 50 L/min containing 50 ml of Hanks' solution were used for air sampling. The obtained aerosol samples were sown on a set of nutrient media and incubated at 28-30°C and 6-10 °C. The titers of microorganisms in high-altitude and ground-level samples were determined in terms of 1 m3 of atmospheric air. Standard microbiological methods were employed to study the phenotypic characteristics of the identified microbial isolates. Lipolytic activity was determined on yolk agar and LB agarized medium containing fatty acid esters with 0.01% CaCl2. The substrates used were 1.0% monolaurate (tween-20) and monooleate (tween-80). Amylolytic activity of the cultures was determined by their isolation on starch-ammonia agar, and proteolytic activity by their ability to hydrolyse milk gelatin and casein (Maniatis T et al., 1984). The ability to hemolysis was taken into account when cultures were plated on LB medium with the addition of ram's blood. Nuclease activity was studied on LB medium with the addition of Sigma DNA (USA) (Maniatis T et al., 1984). The content of plasmid DNA in the isolates was determined

by screening according to Maniatis T et al. (1984). The capacity for RNAase secretion in culture medium (peptone - 9.27 g/l, yeast extract - 5 g/l, NaCl - 3.00; 10 ml of 50% glycerin, 2 ml of 20% glucose; pH 7.07.2) during cultivation of bacteria at 30 °C, for 18-24 h, was determined by the accumulation of acid-soluble products, formed upon hydrolysis of high-polymer RNA of yeast (1 mg/ml). Antibiotic activity of the studied strains was determined by cross-strics (Yasuda T et al., 1992) on LB medium at 37 °C. The following pathogenic test strains were used: Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Candida albicans 620, Klebsiella pneumoniae B-4894, Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium 2606, and Shigella sonnei 32 (collection of FSBI State Research Centre Vektor of the Rospotrebnadzor). The genetic analysis of bacterial isolates was performed using PCR with specific primers on 16S rRNA. The calculation of the number of cultivated microorganisms in the samples was carried out according to the Kerber method [Bottone EJ, 2010], and the number of microorganisms was averaged over three parallels of the inoculated samples. The annual average numbers of cultivated microorganisms were calculated as a mean ± the confidence interval at a significance level of 95% of t-Student's (p < 0.05).

Percentages of spore-forming cultured bacteria in aerosol samples varied significantly across the years of observation (1998-present): in high-altitude samples, the minimum and maximum were 0.5% (in 2005) and 55% (in 2011), respectively, and, in ground-level samples, the minimum and maximum were 0.1% (in 2002) and 83% (in 2016), respectively (See Fig. 1 and 2). Annual averages of total concentration of microorganisms ranged from < 1 to 5*105 CFU/m3. The number of cereus-group bacteria also varied significantly from sample to sample, with averages ranging from 0.01% to 6.5% of the total number of isolated microorganisms. A total of2.025 bacterial isolates, of which 62 formed endospores, were isolated from ground-level and high-altitude aerosol samples collected during the predominance of south-westerly winds from Kazakhstan in autumn 2016, and were characterized by increased dust-component content. Spore-forming bacteria were identified as belonging to the genera Bacillus, Paenibacillus, Brevibacillus, Lysinibacillus, and some others. Both high-altitude and ground-level aerosol samples were shown to contain bacteria of the cereus group: Bacillus cereus (Bc) and Bacillus thuringiensis (Bt), Bt ssp. kurstaki, Bt ssp. galleriae subspecies; Bt strains with indefinite serotype were also found. Notably, Bacillus anthracis species were not found (See Table 1). Screening for enzyme secretion revealed Bt and Bc strains with pronounced proteolytic, phosphatase, lipolytic, and amylolytic activities in a medium pH range from 5.0 to 9.0 (See Table 2). An atypical strain of B. thuringiensis Cb-527, which demonstrates high production of RNase, was isolated. All strains demonstrated hemolysis capability, were multi-resistant to antibiotics (resistant to 6-15 drugs (See Table 3), and suppressed the growth of the pathogenic yeast, Candida albicans, to varying degrees. The Bt Cb-527 strain, as well as several Bc strains, also effectively inhibited the growth of Gram-positive test strains of Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis. Gram-negative bacterial test strains were low-sensitive to the action of metabolites of the studied Bc and Bt strains (See Table 4).

In high-altitude and ground-level samples of the studied atmospheric aerosols, bacteria of the cereus group belonging to Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis species were found in amounts ranging from 0.01 to 6.5% of the total number of cultured microorganisms isolated under experimental conditions. The presence of aggression enzymes such as phospholipases, hemolysins, proteases, and nucleolytic enzymes typical of representatives of these taxa, was found. We isolated Bc and Bt strains with high levels of secretion of enzymes and metabolites that possess antibiotic activity; these strains are promising as producers. The Bacillus thuringiensis Cb-527 strain (with

a pronounced secretion of the RNase complex) can be used for the development of anti-RNA-containing virus drugs. The isolated Bc and Bt strains demonstrated multiple antibiotic resistance, which confirms literature data on the increasing prevalence of polyresistance among the identified natural microbial isolates. The paper contains 4 Figures, 4 Tables, and 41 References. Key words: Bacillus cereus; Bacillus thuringiensis; atmospheric bioaerosols; spore-forming microorganisms; enzymatic, antibiotic activity

Funding: The work was performed as a part of the state order of Rospotrebnadzor (Russian Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing).

The Authors declare no conflict of interest.

References

1. Smets W, Moretti S, Denys S, Lebeer S. Airborne bacteria in the atmosphere: Presence, purpose, and potential. Atmos. Environ. 2016;139:214-221. doi: 10.1016/j. atmosenv.2016.05.038

2. Wei K, Zheng Y, Li J, Shen F, Zou Z, Fan H, Li X, Wu C, Yao M. Microbial aerosol characteristics in highly polluted and near-pristine environments featuring different climatic conditions. Science Bulletin. 2015;60:1439-1447. doi: 10.1007/s11434-015-0868-y

3. Soleimani Z, Goudarzi G, Sorooshian A, Marzouni MB, Maleki H. Impact of Middle Eastern dust storms on indoor and outdoor composition of bioaerosol. Atmospheric Environment. 2016;138:135-143. doi: 10.1016/j.atmosenv.2016.05.023

4. Akila M, Priyamvada H, Ravikrishna R, Gunthe SS. Characterization of bacterial diversity and ice-nucleating ability during different monsoon seasons over a southern tropical Indian region. Atmospheric Environment. 2018;191:387-394. doi: 10.1016/j.atmosenv.2018.08.026

5. Madsen AM, Zervas A, Tendal K, Nielsen JL. Microbial diversity in bioaerosol samples causing ODTS compared to reference bioaerosol samples as measured using Illumina sequencing and MALDI-TOF. Environmental Research. 2015;140:255-267. doi: 10.1016/j. envres.2015.03.027

6. Kobayashi F, Maki T, Kakikawa M, Yamada M, Puspitasari F, Iwasaka Y. Bioprocess of Kosa bioaerosols: Effect of ultraviolet radiation on airborne bacteria within Kosa (Asian dust). Journal of Bioscience and Bioengineering. 2015;119(5):570-579. doi: 10.1016/j. jbiosc.2014.10.015

7. Griffin DW. Terrestrial microorganisms at an altitude of 20,000 m in Earth's atmosphere. Aerobiologia. 2000;20(2):135-140. doi: 10.1023/B:AER0.0000032948.84077.12

8. Griffin DW. Atmospheric movement of microorganisms in clouds of desert dust and implications for human health. Clinical Microbiology Reviews. 2007;20(3):459-477. doi: 10.1128/CMR.00039-06

9. Yang Y, Itahashi S, Yokobori SI, Yamagishi A. UV-resistant bacteria isolated from upper troposphere and lower stratosphere. Biological Science in Space. 2008;22:18-25. doi: 10.2187/bss.22.18

10. Yoo K, Han I, Ko KS., Lee TK., Yoo H, Khan MI, Tiedje JM, Park J. Bacillus-dominant airborne bacterial communities identified during Asian dust events. Microbial Ecology. 2019;78(3):677-687. doi: 10.1007/s00248-019-01348-0

11. Liu Y, Du J, Lai Q, Zeng R, Ye D, Xu J, Shao Z. Proposal of nine novel species of the Bacillus cereus group. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2017;67(8):2499-2508. doi: 10.1099/ijsem.0.001821

12. Buehler AJ, Martin NH, Boor KJ, Wiedmann M. Psychrotolerant spore-former growth characterization for the development of a dairy spoilage predictive model. Journal of Dairy Science. 2018;101(8):6964-6981. doi: 10.3168/jds.2018-14501

13. Patogeny nasekomykh: strukturnye i funktsional'nye aspekty [Insect Pathogens: structural and functional aspects]. Glupov VV, editor. Moscow: Kruglyy god Publ.; 2001. 736 p. In Russian

14. Ramarao N, Lereclus D, Sorokin A. The Bacillus cereus group. In: Molecular Medical Microbiology. Vol. 2. Chap. 59. Tang Y-W, Sussman M, Liu D, Poxton I, Schwartzman J, editors. New York: Elsevier Publ.; 2015. pp. 1041-1078.

15. Bottone EJ. Bacillus cereus, a volatile human pathogen. Clinical Microbiology Reviews. 2010;23(2):382-398. doi: 10.1128/CMR.00073-09

16. Williams LD, Burdock GA, Jiménez G, Castillo M. Literature review on the safety of Toyocerin, a non-toxigenic and non-pathogenic Bacillus cereus var. toyoi preparation. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 2009;55(2):236-246. doi: 10.1016/j. yrtph.2009.07.009

17. Pokhilenko VD, Perelygin VV. Probiotiki na osnove sporoobrazuyushchikh bakteriy i ikh bezopasnost' [Probiotics on the basis of spore-forming bacteria and their safety]. Khimicheskaya i biologicheskaya bezopasnost'. 2007;2-3:20-41. In Russian

18. Mefoyd KM, Osipova IG, Vasilyeva EA. The results of the'comparative study of new vet probiotics irilis and paciflor. Vestnik Rossiyskogo universiteta druzhby narodov. Seriya: Meditsina = Rudn Journal of Medicine. 2006;2:27-31. In Russian

19. Yeo IC, Lee NK, Cha C-J, Hahm YT. Narrow antagonistic activity of antimicrobial peptide from Bacillus subtilis SCK-2 against Bacillus cereus. Journal of Bioscience and Bioengineering. 2011;112(4):338-344. doi: 10.1016/j.jbiosc.2011.06.011

20. Safatov AS, Andreeva IS, Buryak GA, Marchenko VV, Ol'kin SE, Reznikova IK, Repin VE, Sergeev AN, Belan BD, Panchenko MV. Tropospheric bioaerosols of Southwestern Siberia: Their concentrations and variability, distributions and long-term dynamics. In: Nucleation and Atmospheric Aerosols. O'Dowd CD, Wagner PE, editors.Dordrecht: Springer; 2007. pp. 741-745. doi: 10.1007/978-1-4020-6475-3_146

21. Andreeva IS, Safatov AS, Puchkova LI, Emel'yanova EK, Buryak GA, Ol'kin SE, Reznikova IK, Okhlopkova OV. Kul'tiviruemye mikroorganizmy v vysotnykh probakh aerozoley vozdukha severa Sibiri v khode samoletnogo zondirovaniya atmosfery [Culturable microorganisms in high-altitude atmospheric aerosol samples collected above northern Siberia by aircraft sounding]. Vestnik Nizhnevartovskogo gosudarstvennogo universiteta. 2019;2:3-11. doi: 10.36906/2311-4444/19-2/01 In Russian

22. Andreeva IS, Safatov AS, Morozova VV, Tikunova NV, Emelyanova EK, Solovyanova NA, Babkin IV, Buryak GA, Puchkova LI. Saprophytic and pathogenic yeasts in atmospheric aerosols of Southwestern Siberia. Atmospheric and Oceanic Optics. 2020;33(5):505-511. doi: 10.1134/S1024856020050024

23. Gusareva ES, Gaultier NPE, Premkrishnan BNV, Kee C, Lim SBY, Heinle CE, Purbojati RW, Nee AP, Lohar SR, Yanqing K, Kharkov VN, Drautz-Moses DI, Stepanov VA, Schuster SC. Taxonomic composition and seasonal dynamics of the air microbiome in West Siberia. Scientific Reports. 2020;10(1):21515. doi: 10.1038/s41598-020-78604-8

24. Metody obshchey bakteriologii. T. 3. [General bacteriology methods. Vol. 3]. Pod red. Gerkhard F, Myurrey R, Kostilou R, Nester Yu, Vud V, Krig N, Filips G, editors. Moscow: Mir Publ.; 1984. 264 p. In Russian

25. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Vol. 3. The Firmicutes. Vos P, Garrity G, Jones D, Krieg NR, Ludwig W, Rainey FA and Whitman WB, editors. New York: Springer-Verlag Publ.; 2009. 1450 p. doi: 10.1007/978-0-387-68489-5

26. Maniatis T, Fritsch E, Sembrook J. Molecular cloning: A Laboratory Manual. Translated from English by Baev AA and Skryabin KG. Moscow: Mir Publ.; 1984. 480 p. In Russian

27. Yasuda T, Nadano D, Tenjo E, Takeshita H, Kishi K. The zymogram method for detection of ribonucleases after isoelectric focusing: analysis of multiple forms of human, bovine, and microbial enzymes. Anal. Biochem. 1992;206(1):172-177. doi: 10.1016/s0003-2697(05)80029-6

28. Singh V, Haque S, Singh H, Verma J, Vibha K, Singh R, Jawed A, Tripathi CRM. Issolation, screening, and identification of novel isolates of Actinomycetes from India for antimicrobial applications. Front. Microbiol. 2016;7:1-9. doi: 10.3389/fmicb.2016.01921

29. Wang Y, Qian P-Y. Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies. PLoS One. 2009;4(10):e7401. doi: 10.1371/journal.pone.0007401

30. Ashmarin IP, Vorob'ev AA. Statisticheskie metody v mikrobiologicheskikh issledovaniyakh [Statistical methods in microbiological research]. Leningrad: Medgiz Publ.; 1962. 180 p. In Russian

31. Rukovodstvo po meditsinskoy mikrobiologii. Chastnaya meditsinskaya mikrobiologiya i etiologicheskaya diagnostika infektsiy. Kniga II [Guide to Medical Microbiology. Private medical microbiology and etiological diagnosis of infections. Book II]. Labinskaya AS, Kostyukova NN, Ivanova SM, editors. Moscow: Izdatel'stvo BINOM; 2010. 1152 p. in Russian

32. Bottone EJ. Bacillus cereus, a volatile human pathogen. Clinical Microbiology Review. 2010;23(2):382-398. doi: 10.1128/CMR.00073-09

33. Strachunskiy LS, Kozlov SN. Sovremennaya antimikrobnaya khimioterapiya. Rukovodstvo dlya vrachey [Modern antimicrobial chemotherapy. A guide for doctors]. Moskow: Borges Publ.; 2002. 432 p. In Russian

34. Yibar A, Qetinkaya F, Soyutemiz E, Yaman G. Prevalence, enterotoxin production and antibiotic resistance of Bacillus cereus isolated from milk and cheese. Kafkas Universitesi VeterinerFakultesi Dergisi. 2017;23(4):635-642. doi: 10.9775/kvfd.2017.17480

35. Kumar SN, Mohandas C, Nambisan B. Purification of an antifungal compound, cyclo(l-Pro-d-Leu) for cereals produced by Bacillus cereus subsp. thuringiensis associated with entomopathogenic nematode. Microbiological Research. 2013;168(5):278-288. doi: 10.1016/j.micres.2012.12.003

36. Zheng D, Zeng Z, Xue B, Deng Y, Sun M, Tang Y-J, Ruan L. Bacillus thuringiensis produces the lipopeptide thumolycin to antagonize microbes and nematodes. Microbiological Research. 2018;215:22-28. doi: 10.1016/j.micres.2018.06.004

37. Nakamura N, Nakano K, Sugiura N, Matsumura M. A novel cyanobacteriolytic bacterium, Bacillus cereus, isolated from a Eutrophic Lake. Journal of Bioscience andBioengineering. 2003;95(2):179-184. doi: 10.1016/s1389-1723(03)80125-1

38. Silo-Suh LA, Lethbridge BJ, Raffel SJ, He H, Clardy J, Handelsman JO. Biological activities of two fungistatic antibiotics produced by Bacillus cereus UW85. Applied and Environmental Microbiology. 1994;60(6):2023-2030. doi: 0.1128/aem.60.6.2023-2030.1994

39. Vilas-Boas GT, Santos CA. Conjugation in Bacillus thuringiensis: Insights into the Plasmids Exchange Process. In: Bacillus thuringiensis Biotechnology. Sansinenea E, editor. Dordrecht: Springer Publ.; 2012; pp. 159-174. doi: 10.1007/978-94-007-3021-2_8

40. Andreeva IS, Zakabunin AS. Issledovanie vnekletochnykh nukleoticheskikh fermentov shtammov Bacillus thuringiensis metodom zimografii [Study of extracellular nucleotide enzymes of Bacillus thuringiensis strains by zymography]. Colloquium-Journal. 2017;2(2):7-14. In Russian

41. Shah Mahmud R, Ilinskaya ON. Antiviral activity of binase against pandemic influenza A (H1N1) virus. Acta Naturae. 2013;5(4):44-51. doi: 10.32607/20758251-2013-5-4-44-51

Received 04 April, 2021; Revised 17 August, 2021;

Accepted 25 November, 2021; Published 29 December, 2021.

Author info:

Andreeva Irina S, Cand. Sci (Biol.), Assoc. Professor, Leading Researcher, Department of Biophysics and Environmental Research, FBRI State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector" Rospotreb-nadzor, Koltsovo, Novosibirsk region 630559, Russian Federation. E-mail: [email protected]

Safatov Alexander S, Dr. Sci. (Techn.), Head of the Department of Biophysics and Environmental Research, FBRI State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector" Rospotrebnadzor, Koltsovo, Novosibirsk region 630559, Russian Federation. E-mail: [email protected]

Puchkova Larisa I, Cand. Sci (Biol.), Leading Researcher, Department of Biophysics and Environmental Research, FBRI State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector" Rospotrebnadzor, Koltsovo, Novosibirsk region 630559, Russian Federation. E-mail: [email protected]

Emelyanova Elena K, Cand. Sci (Biol.), Senior Researcher, Department of Biophysics and Environmental Research, FBRI State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector" Rospotrebnadzor, Koltsovo, Novosibirsk region 630559, Russian Federation; Assoc. Professor of Department of Hygiene and Ecology, FSBEI HE Novosibirsk State Medical University, 52 Krasny pr., Novosibirsk 630091, Russian Federation.

E-mail: [email protected]

Solovyanova Nadezhda A, Researcher, Department of Biophysics and Environmental Research, FBRI State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector" Rospotrebnadzor, Koltsovo, Novosibirsk region 630559, Russian Federation. E-mail: [email protected]

Buryak Galina A, Researcher, Department of Biophysics and Environmental Research, FBRI State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector" Rospotrebnadzor, Koltsovo, Novosibirsk region 630559, Russian Federation. E-mail: [email protected]

Ternovoi Vladimir A, Cand. Sci (Biol.), Head of Laboratory, Department of Molecular Virology, FBRI State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector" Rospotrebnadzor, Koltsovo, Novosibirsk region 630559, Russian Federation. E-mail: [email protected]