Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ИММУНОГЕНЕТИКИ И ТКАНЕВОГО ТИПИРОВАНИЯ» Санкт-Петербург, 30–31 мая 2018 г. Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

КОНФЕРЕНЦИЯ С МЕЖДУНАРОДНЫМ УЧАСТИЕМ Санкт-Петербург

«АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ИММУНОГЕНЕТИКИ И ТКАНЕВОГО ТИПИРОВАНИЯ» 30-31 мая 2018 г.

Абдрахимова А. Р., Кузьминова Е. П., Урыбин И. Ю., Хамаганова Е. Г.

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва

ОСОБЕННОСТИ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА ИЬАОРБ1 У ДОНОРОВ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК РЕГИСТРА «НМИЦ ГЕМАТОЛОГИИ», САМООПРЕДЕЛИВШИХСЯ КАК РУССКИЕ

Введение. Трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) является методом спасения многих пациентов с заболеваниями системы крови. У большинства больных, нуждающихся в алло-ТГСК, отсутствует HLA-идентичный родственный донор, поэтому для них необходим поиск неродственного донора. Совпадение донора и реципиента по аллелям генов HLA-A, — B, — C, — DRB1, — DQB1 повышает выживаемость после алло-ТГСК. Селекция неродственного донора по гену HLA-DPB1 не является обязательной из-за низкого уровня экспрессии молекул DP. Однако слабое неравновесное сцепление локуса HLA-DP с другими генами HLA-системы ведёт к тому, что несовпадение по аллелям HLA-DPB1 наблюдается при ~80 % неродственных алло-ТГСК. Классификация HLA-DPB1 -аллелей по группам TCE (Т-клеточных эпитопов) позволяет идентифицировать пермиссивные (допустимые) комбинации донор-реципиент, ассоциирующиеся с низким клиническим риском, и не-пермиссивные (недопустимые) комбинации с высоким клиническим риском. В доступной литературе имеются лишь единичные работы, изучавшие распределение аллелей гена HLA-DPB1 в российских популяциях — у жителей Санкт-Петербурга и Тувы.

Цель исследования — провести анализ распределения аллелей гена HLA-DPB1 и групп TCE у доноров гемопоэтических стволовых клеток регистра «НМИЦ гематологии», самоопределившихся как русские.

Материалы и методы. По гену DPB1 HLA-типированы 202 донора регистра «НМИЦ гематологии», самоопределившиеся как русские, из них мужчин 73 (36 %), женщин 129 (64%). Средний возраст доноров составил 30 лет. ДНК получали из венозной крови, взятой в пробирки с ЭДТА. Выделение ДНК проводили с помощью набора «Arrow Blood DNA 200» (NorDiag ASA, Norway) на приборе для автоматического выделения нуклеиновых кислот NorDiagArrow в соответствии с реко-

мендациями производителя. Генотипирова-ние HLA-DPB1 проводилось двумя методами: PCR-SSO (полимеразной цепной реакции с сиквенс-специфическими олигонуклеоти-дами) с использованием наборов LIFECODES на платформе Luminex; PCR-SSP (полимераз-ной цепной реакции с сиквенс-специфиче-скими праймерами) с использованием наборов Olerup (Olerup SSP, Sweden). Определение частот HLA-DPB1 аллелей проводилось с использованием компьютерной программы «Арлекин», версия 3.5. Аллели DPB1 были классифицированы в соответствии с TCE3 алгоритмом, доступном на www.ebi.ac.uk/ipd/ imgt/hla/dpb.html. Частоты ТСЕ групп определялись как сумма частот аллелей, составляющих группу.

Результаты. У 202 доноров регистра «НМИЦ гематологии», самоопределившихся как русские, выявлено 20 различных аллелей HLA-DPB1. Преобладающим являлся аллель DPB1*04:01, его частота составляла 0,386 (39 %). С относительно высокой частотой выявлялись аллели DPB1*02:01 - 0,163 (16%), DPB1*04:02 - 0,151 (15 %) и DPB1*03:01 - 0,116 (12 %), что характерно для большинства европейских популяций. На все другие установленные DPB1-аллели приходилось 18 %.

Выявленные аллели были классифицированы по степени иммуногенности в соответствии с TCE3 алгоритмом. Наиболее частотной у наших доноров являлась группа слабой иммуногенности (TCE3) — 0,827 (83%), ее составили аллели DPB1*01:01, DPB1*02:01, DPB1 *02:02, DPB1*04:01, DPB1*04:02, DPB1 *05:01, DPB1 *11:01, DPB1 *13:01, DPB1*15:01, DPB1 *16:01, DPB1*20:01, DPB1 *23:01, DPB1*105:01, в группу промежуточной иммуногенности (TCE2) входили аллели DPB1*03:01, DPB1*06:01, DPB1*14:01, DPB1*19:01, их частота - 0,134 (13 %), к высо-коиммуногенной группе (TCE1) относились аллели DPB1*09:01, DPB1*10:01, DPB1*17:01, на них приходилось только 0,039 (4 %). Высокая частота группы слабой иммуногенности

(ТСЕ3) объясняется вхождением в нее аллелей DPB1*02:01, DPB1*04:01, DPB1*04:02, преобладающих в нашей выборке.

Выводы. Как и в большинстве европейских популяций, у доноров регистра «НМИЦ гематологии», самоопределившихся как русские, преобладают аллели DPB1*04:01, DPB1*04:02, DPB1 *02:01, DPB1*03:01. Носителями DPB1-аллелей повышенной иммуногенности (группы ТСЕ1+ТСЕ2) являются 17% доноров

регистра «НМИЦ гематологии», самоопределившихся как русские. Если больной и донор относятся к разным ТСЕ-группам, при наличии у больного нескольких HLA-A*, — B*,— ^ — DRB1*, — DQB1*- совместимых доноров типирование гена HLA-DPB1 позволяет исключить доноров-носителей потенциально опасных (иммуногенных) аллелей этого гена, что может способствовать увеличению эффективности алло-ТГСК.

Балашова В. А., Ругаль В. И., Бессмельцев С. С., Грицаев С. В., Волошин С. В., Семенова Н. Ю., Чубукина Ж. В.

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства», Санкт-Петербург

КОРРЕЛЯЦИЯ МЕЖДУ ЧИСЛОМ КОЛОНИЕОБРАЗУЮЩИХ КЛЕТОК И СЭ34ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГСК В АФЕРЕЗНОМ ПРОДУКТЕ МОБИЛИЗОВАННОЙ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ С ЛИМФОПРОЛИФЕРАТИВНЫМИ НОВООБРАЗОВАНИЯМИ

Введение. Высокодозная химиотерапия (ВХТ) с последующей аутотрансплантацией ге-мопоэтических стволовых клеток (АутоТГСК) широко применяется в лечении больных множественной миеломой (ММ) и злокачественными лимфомами (ЗЛ). Основным источником гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) является периферическая кровь (ПК), обогащенная мобилизованными из костного мозга ГСК. После мобилизации ПК подвергают аппаратному цитаферезу, и заготовленную клеточную взвесь замораживают. После ее размораживания осуществляют АутоТГСК. Успех трансплантации зависит от эффективности мобилизации, количества, качества и функции ГСК. Маркером ГСК является антиген СЭ34 и количество СЭ34+ клеток определяет пригодность трансплантата. От дозы перелитых СЭ34+ клеток зависит успешность трансплантации, а именно, сроки восстановления гемо-поэза. Однако успех трансплантации зависит не только от количества перелитых СЭ34+ клеток, но также от их функциональной активности. Показателем этой активности является способность СЭ34+ ГСК формировать колонии в условиях клеточных культур. Определение колониеобразующей способности (КОС) ГСК позволяет оценивать потенциал кроветворного пула трансплантата.

Цель. Определение корреляции между количеством СЭ34+ ГСК и числом колониео-

бразующих единиц (КОЕ) в культуре клеток в одних и тех же образцах продукта афереза ПК до и после криоконсервирования у больных множественной миеломой ММ и ЗЛ с тем, чтобы оценить клиническую значимость этих показателей.

Материал и методы. Материалом для исследования послужили образцы клеточной взвеси аферезного продукта ПК до и после консервирования и клеточные культуры 25 больных ЗЛ и 32 больных ММ, которым была выполнена АутоТГСК. Для сопоставления результатов оценивали число СЭ34+ ГСК и количество колоний в одной и той же единице объема — в 100 000 клеток исследуемого аферезного продукта.

В процессе исследования использовались: метод мобилизации клеток из костного мозга; метод аппаратного цитафереза; метод культивирования клеток в полной культу-ральной среде МеШоСи1Ш4435 на основе метилцеллюлозы; метод проточной цитоме-трии для определения числа СЭ34+-клеток в продукте афереза мобилизованной ПК.

Результаты. В результате проведенного исследования была выявлена статистически значимая прямая корреляция между количеством СЭ34+ ГСК и числом всех КОЕ до и после криоконсервирования у больных ЗЛ (коэффициент Спирмена +0,53). Также обнаружена статистически значимая корреляция между

числом СЭ34+ клеток и гранулоцито-макро-фагальных КОЕ в культуре клеток у больных ММ и ЗЛ до криоконсервирования (коэффициент Спирмена +0,312 и +0,302).

Выводы. Таким образом, можно утверждать, что показатели КОС клеток, используемой для учета функциональной активности

ГСК, и количество СЭ34+клеток являются дополняющими друг друга характеристиками пролиферативного пула трансплантата, и что для оценки количественного и качественного состояния аутотрансплантата необходимо использование обоих методов исследования.

Белянская Ю. В., Полякова А. П., Волкова О. Я.

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Санкт-Петербург

ОЦЕНКА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОГО ХИМЕРИЗМА ПОСЛЕ АЛЛОГЕННОЙ ГАПЛОИДЕНТИЧНОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

Аллогенная трансплантация гемопоэти-ческих стволовых клеток (ТГСК) является высокотехнологичным методом лечения различных онкогематологических заболеваний, широко применяемым в настоящее время. В связи со значительными трудностями подбора полностью совместимого донора, в последние годы получила распространение ТГСК от гаплоидентичного родственного донора (гапло-ТГСК). Данный вид трансплантации сопровождается повышенным риском осложнений, в числе которых неприживление трансплантата, а также развитие острой и хронической реакции «трансплантат против хозяина», приводящей в ряде случаев к отторжению аллотрансплантата. Для оценки приживления трансплантата после ТГСК применяется определение гемопоэтическо-го химеризма (ГХ) на разных сроках после трансплантации.

Целью настоящего исследования была сравнительная оценка ГХ у пациентов после аллогенной ТГСК от совместимого или гапло-идентичного донора.

Материалы и методы. Исследование ГХ проводилось у 101 пациента, перенесшего ал-логенную ТГСК. Всего было выполнено 84 га-плоидентичные трансплантации (из них 8 повторных) и 28 — от HLA-совместимого донора (в том числе 3 — неродственные и 3 повторные родственные). Количественная оценка ГХ выполнялась методом фрагментного анализа коротких тандемных повторов нуклеотидов (STR — short tandem repeats) с помощью разработанной нами диагностической панели. Методика определения ГХ включала в себя

два этапа: скрининг — определение информативных БТЯ локусов и мониторинг ГХ на разных сроках после ТГСК. Первое определение ГХ выполнялось в день приживления трансплантата (13 - 17-й день после ТГСК), затем на 30-й день (Д+30) и далее с периодичностью один раз в месяц на протяжении 1 года. Отсутствие донорского химеризма (ДХ) на Д+30 после ТГСК расценивалось как первичное неприживление трансплантата (ПНТ), ДХ менее 95% — как неполное приживление (НПТ), а снижение ДХ позднее 30 дня после проведенной трансплантации — как вторичное отторжение (ВОТ).

Результаты. В группе пациентов, перенесших гапло-ТГСК, полный ДХ на Д+30 наблюдался в 79,8 % (у 67 пациентов), ПНТ — в 7,1 % случаев (6 человек), смешанный ГХ ниже 95 %, свидетельствующий о НПТ — у 11 человек (13,1 %). Среди пациентов после аллоген-ной совместимой трансплантации полный ДХ выявлялся в 85,7 % случаев (у 24 человек), НПТ —у 4 пациентов (14,3%). При этом ПНТ в этой группе обнаружено не было. В обеих исследуемых группах ВОТ регистрировалось с равной частотой: 26,2 % при гапло-ТГСК и 25,0 % при совместимой трансплантации.

Выводы. Сравнительный анализ полученных данных показал отсутствие значимых отличий в исходах гаплоидентичных и совместимых аллогенны х ТГСК у обследованных пациентов. Различия в частоте случаев ПНТ в исследуемых группах свидетельствуют о повышенном риске данного посттрансплантационного осложнения у пациентов после гапло-ТГСК.

Беркос А. С., Терентьева М. А., Беляева Е. В., Ерохина Л. В., Бакаи В. В., Моисеева Л. М., Бубнова Л. Н.

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства», Санкт-Петербург

ПОДБОР РОДСТВЕННОГО И НЕРОДСТВЕННОГО ДОНОРА ГСК ДЛЯ ПАЦИЕНТОВ КЛИНИКИ РОССИЙСКОГО НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОГО ИНСТИТУТА ГЕМАТОЛОГИИ И ТРАНСФУЗИОЛОГИИ

Введение. Несмотря на то, что поиск ИЬЛ идентичного донора среди сиблингов пациентов остаётся основным источником подбора, выявление совместимого неродственного донора ГСК среди потенциальных доноров регистра является единственным способом, позволяющим проведение трансплантации костного мозга пациентам, не имеющим ИЬЛ-идентичного родственного донора. В соответствии с законами кодоминантного наследования вероятность обнаружения в семье двух ИЬЛ идентичных сиблингов составляет 25 %. При этом можно предположить, что вероятность выявления совместимого сиблин-га в семьях с количеством детей более двух может увеличиваться.

Цель. Анализ результатов поиска ИЬЛ идентичного родственного и ИЬЛ-совместимого неродственного донора ГСК для пациентов гематологической клиники ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России.

Материалы и методы. Было проведено ИЬЛ-Л, В, С, ОЯБ1, DQB1 типирование 200 больных гемобластозами, 262 их сиблингов для подбора родственного донора, а также 21 пациента для подбора неродственного донора в отечественном объединённом регистре (регистр), включающем около 80 тысяч потенциальных доноров костного мозга. Молекулярное типирование проводилось методом

SSP с использованием наборов сиквенс-спец-ифических праймеров фирмы «Рго1:гап$».

Результаты. Для 61 пациента (31%) был обнаружен сиблинг, полностью совпадающий по антигенам ИЬЛ. В семьях с количеством детей более двух обнаружено значительное увеличение частоты выявления ИЬЛ совместимого сиблинга по сравнению с семьями с двумя детьми (50 % и 25% соответстствен-но). Частота встречаемости идентичных, га-плоидентичных и полностью отличающихся по фенотипу сиблингов соответствовала классическому менделевскому распределению (24 %, 51 % и 25 % соответственно).

Для 7 (31%) пациентов, нуждавшихся в подборе неродственного донора, в регистре было обнаружено 16 ИЬЛ-Л, В, С, DRB1, DQB1 (базовое разрешение) совместимых доноров. Для 3 пациентов подобранные доноры в дальнейшем оказались совместимыми и на уровне высокого разрешения.

Выводы. Полученные результаты в основном согласуются со статистикой подборов родственных и неродственных доноров в других трансплантационных центрах. Важно отметить, что поиск ИЬЛ-совместимых неродственных доноров даже в относительно небольшом регистре для пациентов, не имеющих ИЬЛ-идентичного сиблинга, может быть достаточно успешным.

Блау Игорь-Вольфганг

Университетская клиника Шарите, Берлин, Германия

КЛЕТОЧНАЯ ТЕРАПИЯ И АЛЛОГЕННАЯ ТРАНСПЛАНТАЦИЯ СТВОЛОВЫХ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

Аллогенная трансплантация стволовых гемопоэтических клеток приводит к замене кроветворения и созданию новой иммунной системы. Иммунные клетки донора, особенно, Т-клетки, распознают опухолевые анти-

гены реципиента и уничтожают остаточный лейкозный клон. Это хорошо известный эффект — реакция «трансплантат против лейкемии» (РТПЛ). Изучение РТПЛ явилось основой для развития клеточной терапии.

Первым клиническим применением клеточной терапии было переливание лимфоцитов донора (Donor Lymphocyte Infusion, DLI), предложенное в конце 80-х годов И. Колбом и опубликованное в 1990 году. DLI подтвердила эффективность иммунной Т-клеточной терапии сначала у пациентов с хроническим миелолейкозом, и позже у больных с опухолями кроветворной системы, особенно, с низкой пролиферативной активностью, такими как лимфомы низкой степени злокачественности (Champlin, 2001).

В течение последних 20 лет происходит накопление опыта по возможности применения генной терапии в лечении опухолевых заболеваний кроветворения. В девяностые годы 20 века были опубликованы данные, что трансфекция генов человека с использованием ретровирусов в качестве вектора к CD34-положительным стволовым клеткам в некоторых случаях привела к развитию острого Т-клеточных лейкоза через стадию длительной моноклональной лимфопролиферации. В этих случаях генная терапия была применена для лечения больных с врожденной незлокачественной патологией (Adenosine deaminase (ADA) deficiency). После такой серьезной неудачи исследования были сосредоточены на развитии контролируемой транс-фекции генов, особенно в Т-клетках, чтобы научиться направлять их действие против

Универси,

Аллогенная трансплантация стволовых гемопоэтических клеток (аллоТСГК) эффективно применяется для лечения широкого спектра как злокачественных, так и незлокачественных заболеваний. Своевременное и эффективное приживление стволовых клеток доноров является важной предпосылкой для окончательного клинического успеха аллоТСГК как с точки зрения восстановления иммунной системы, снижения опасности рецидива, так и с точки зрения борьбы иммунной системы трансплантата против

Санкт-Петербург 30-31 мая 2018 г.

опухолевых антигенов без развития неконтролируемой моноклональной пролиферации трансфецированных клеток.

Недавно стали развиваться направления, объединяющие оба этих принципа, клеточную терапию и применение генетически модифицированных Т-клеток доноров. Одним из них является хорошо известная и введенная в клиническую практику терапия CAR-T-клетками с использованием модифицированных Т-клеток против CD19, но также и против других антигенов, например CD269 (BCMA). Недавно разработано так называемое «второе поколение» CAR-T-клеток. На последнем международном гематологическом конгрессе (ASH 2017) было представлено много новых подходов. Один из протоколов включает в себя два этапа Т-клеточной терапии с аутологич-ными и аллогенными трансфецированными клетками. Другие группы исследователей используют следующий подход: активация естественного, обусловленного HLA-молекулами Т-клеточного иммунитета против опухолевых антигенов. В нашей клинике мы разрабатываем протокол генетической модификации Т-клеток против MAGEA1 — опухолевого антигена, который расположен на поверхностях клеток некоторых опухолей, в том числе и на миеломных плазматических клетках. В докладе будут представлен опыт по разработке этого протокола.

остаточных злокачественных клеток. Изучение гемопоэтического химеризма после аллоТСГК является рутинным методом для оценки приживления трансплантата, раннего выявления слабости или отторжения трансплантата, а также рецидива заболевания.

Мониторинг химеризма в отдельных клеточных популяциях повышает чувствительность и специфичность молекулярного исследования. Применение предварительной селекции клеточных популяций позволяет выявлять в них остаточные клетки реципи-

Блау Ольга Владимировна

тетская клиника Шарите, Берлин, Германия

ГЕМОПОЭТИЧЕСКИЙ ХИМЕРИЗМ В КЛЕТОЧНЫХ СУБПОПУЛЯЦИЯХ У БОЛЬНЫХ ПОСЛЕ АЛЛОГЕННОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ СТВОЛОВЫХ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

ента даже при наличии полного донорского химеризма в общей популяции лейкоцитов. Рецидив заболевания остается основным осложнением после аллоТСГК, особенно у больных с острым миелобластным лейкозом (ОМЛ). Было показано, что уменьшение донорского химеризма в субпопуляциях молодых клеток (таких как CD34+) позволяет обнаружить рецидив заболевания значительно раньше, до появления развернутой клинической картины. Кроме того, больные с высоким риском ОМЛ, которые составляют большую группу больных, нуждающихся в аллоТСГК, часто не имеют опухолевых специфических маркеров для анализа минимальной остаточной болезни. В таких ситуациях анализ гемопоэтического химеризма в клеточных популяциях остается методом выбора при контроле за эффективностью лечения.

Длительное персистирование смешанного химеризма после аллоТСГК — достаточно часто наблюдаемый феномен у больных с незлокачественными заболеваниями, хроническими лимфопролиферативными заболеваниями, а также у пациентов после применения режимов кондиционирования со сниженной интенсивностью. Несмотря на то, что смешанный химеризм может предполагать неприживление трансплантата с возможным возвратом гемопоэза пациента, долгосрочное сосуществование клеток пациентов и донора часто ассоциируется с развитием статуса иммунологической толерантности, опосредуемой регуляторны-

ми Т-клетками. Удаление Т-клеток (in vivo или ex vivo) может быть использовано для предотвращения отторжения трансплантата и развития реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ), но также может приводить к задержке воссоздания иммунных клеток. РТПХ является одним из наиболее частых и серьезных осложнений после аллоТСГК. Ранняя диагностика этого осложнения и его своевременное лечение увеличивают долгосрочную выживаемость больных. Продолжительный мониторинг химеризма в CD3+ Т-клетках может быть применен для прогнозирования развития РТПХ.

В настоящее время «золотым стандартом» для изучения гемопоэтического химеризма являются методы, основанные на анализе STR (short tandem repeat) с применением капиллярного электорофореза. Этот метод был первоначально разработан для судебных целей и имеет ряд преимуществ, в том числе, высокий уровень стандартизации, надежности и эффективности времени и затрат. Однако недостатком метода является его внутренняя ограниченная чувствительность от 1 % до 3 %. Эта проблема может быть преодолена использованием количественной ПЦР в реальном времени (qPCR). В последние годы появилось много коммерчески разработанных методов, основанных на qPCR. Высокая чувствительность таких методов делает исследования периферической крови не менее показательными и специфичными, чем анализ химеризма в костном мозге.

Ищенкова И. В.1, Кудинова Э. Е.1, Савченко О. А.1, Труфанова Т. И.1, Шатохин Ю. В.2, Рябикина Е. В.2, Снежко И. В.2, Алавердян А. И.2

1 Государственное бюджетное учреждение Ростовской области «Станция переливания крови», г. Ростов-на-Дону

2 Федеральное государственное бюджетное учреждение высшего образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Ростов-на-Дону

ГЕНЫ ИЬА II КЛАССА ОЯБ1* И DQБ1* У ДОНОРОВ РЕГИСТРА ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК Г. РОСТОВА-НА-ДОНУ

Введение. Изучение ИЬЛ-профиля здорового населения популяций в пределах одной страны, ее регионах и в разных странах мира, является важным для практической медицины, в частности, для решения проблем, связанных с аллогенной трансплантацией костного мозга. Удобной контрольной группой, отражающей иммуногенетическую характе-

ристику популяции, могут быть доноры гемо-поэтических стволовых клеток, с учетом их этнической принадлежности. К настоящему времени изучено и популяционное разнообразие русских и других народов, проживающих в различных регионах России и за рубежом. В Ростовской области, расположенной в Европейской части России — в Южном фе-

деральном округе, исследование генов ИЬЛ II класса не проводилось.

Основным этносом Ростовской области являются русские, однако она относится к полиэтническим регионам вследствие своего географического положения и истории заселения. Заселение низовья Дона и Приазовья активно происходило в XVI - XVIII веках. На Дон переселялись в основном беглые великорусские крестьяне, калмыки, поляки, литовцы, запорожские казаки, татары. В конце XVIII века произошло массовое переселение на Дон армян и греков. Согласно Всероссийской переписи населения 2010 г. в г. Ростове-на-Дону проживают русские — 89,35%, армяне — 3,4 %, украинцы —1,5 %, азербайджанцы — 0,6 %, татары — 0,5 %, белорусы— 0,3%. Кроме того, большие этнические группы представляют евреи, греки, чеченцы, турки, молдаване, корейцы, удмурты, цыгане и т.д.

Цель исследования. Установить распределение генов ИЬЛ II класса у доноров г. Ростова-на-Дону, считающих себя русскими. Провести сравнительный анализ с аналогичными исследованиями в популяциях русских и других народов, проживающих в России и за рубежом.

Материалы и методы. Исследование проводили в государственном бюджетном учреждении Ростовской области «Станция переливания крови» в Зональной лаборатории иммунологического типирования тканей. На оборудовании и расходных материалах, предоставленных нам благотворительным фондом «Русфонд», в 2015-2017 гг. было проведено ДНК-типирование 694 доноров крови, давших согласие быть донорами ГСК. Это — случайные, здоровые люди, считающие себя русскими в трех поколениях, в возрасте от 18 до 42 лет. Из них— 358 — мужчины и 336 — женщины.

Геномную ДНК выделяли из венозной крови доноров реагентами «Рго1гапз» (DNA Вох500). Молекулярно-генетическое типиро-вание (базовое разрешение) проводили по-лимеразной цепной реакцией набором сик-венс-специфических праймеров (РСЯ^Р). Детекцию проводили в 2 % агарозном геле с использованием электрофореза. Все исследования выполняли стандартными реактивами фирмы «Рго1гапз» (Германия). Расчет основных иммуногенетических показателей: частоты 13 специфичностей гена DRB1*

Санкт-Петербург 30-31 мая 2018 г.

и 5 специфичностей гена DQB1*, частоты двухлокусных гаплотипов ИЬЛ DRB1* - ИЬЛ DQB1*, величины неравновесного сцепления ф') был проведен с помощью компьютерной программы Арлекин 3.5. Достоверность различий между группами оценивали с помощью критерия х2. Полученные нами результаты сравнивали с популяциями русских из разных регионов России — Архангельской, Волгодонской, Костромской, Смоленской, Челябинской областей; городов Астрахани, Москвы, Санкт-Петербурга; а также с белорусами, украинцами, армянами, гагаузами (самоопределившиеся жители Молдовы), курдами, калмыками, татарами, казахами, удмуртами.

Результаты. С высокой частотой в ростовской популяции русских встречались аллель-ные семейства гена HLA-DRB1*11 (0,159), DRB1*15(0,142), DRB1*07 (0,132), DRB1*13 (0,131), DRB1*01 (0,106), DRB1*04 (0,103). С одинаковой частотой, редко встречались ал-лельные семейства ^Л DRB1*09 и DRB1*10 (0,009); DRB1*12 и DRB1*14 (0,017). Частота гена HLA DRB1* у русских г. Ростова оказалась сопоставимой с 8 популяциями русских из разных регионов России. Особенность ростовской популяции — повышенная частота DRB1*11 и несколько сниженная частота DRB1*01 по сравнению с другими популяциями русских. Вероятнее всего, особенности распределения этих специфичностей гена ^Л DRB1 связаны с влиянием других больших этнических групп, длительно проживающих на одной территории. Можно предположить, что частота DRB1*11 оказалась повышенной из-за контактов с популяциями, имеющими высокую частоту данной специфичности — украинцев, армян, гагаузов, курдов (0,185; 0,229; 0,240; 0,260 соответственно), имеющих низкую частоту данной специфичности.

У русских доноров г. Ростова наблюдалась высокая частота аллельного семейства ^Л DQB1*03 (0,354) и низкая — ^Л DQB1*04 (0,027).

Частота этих специфичностей сопоставима с частотой в популяциях Санкт-Петербурга и Челябинской области. Частота DQB1*02 в г.Ростове (0,178) и г. Санкт-Петербурге (0,175) почти одинакова, но достоверно снижена по сравнению с Челябинской областью (0,201; х2-10,76; р<0,05).

Наиболее характерными для ростовской популяции русских были гаплотипы: DRB1*11 — DQB1*03 (^ - 0,154; ^ — 0,96),

DRB1*15 — DQB1*06 (^ - 0,134; D' —1,0), DRB1*04 — DQB1*03 (ИF - 0,097; ^ — 0,9). Га-плотип DRB1*11 — DQB1*03 в ростовской популяции встречался несколько чаще (15,4 %), чем в Челябинской области (11,84 %).

Выводы. Можно отметить, что иммуноге-нетическая структура популяции г. Ростова, состоящая из доноров регистра ГСК, считающих себя русскими, имеет типичный западноевропейский вариант распределения частоты аллельных семейств гена ИЬЛ DRB1*,

частоты распределения двухлокусных гапло-типов DRB1*- DQB1*, величины неравновесного сцепления, что характеризует ее как европейскую. Полученные нами данные могут быть использованы для успешного поиска донора для неродственной трансплантации костного мозга и в качестве контрольной группы в научных исследованиях по проблеме «ИЬЛ и болезни», в этнологии для изучения генетического родства популяций.

Злотникова М. В., Семёнов Г. В., Карпенко Ф. Н., Расюк Е. Д.

Государственное учреждение «Республиканский научно-практический центр трансфузиологии и медицинских биотехнологий», г. Минск, Республика Беларусь

ДИНАМИКА ЧИСЛЕННОСТИ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ДОНОРОВ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В ОРГАНИЗАЦИЯХ ПЕРЕЛИВАНИЯ КРОВИ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

Введение: В настоящие время трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) является признанным и широко используемым в мире методом терапии целого ряда гематологических, онкологических и наследственных заболеваний. Вероятность найти идентичного по системе HLA сиблинга для пациентов, нуждающихся в трансплантации, составляет около 25 %. В остальных случаях поиск донора трансплантата осуществляется среди неродственной когорты лиц, давших своё согласие на сдачу гемопоэтических стволовых клеток.

Цель исследования. Изучить динамику численности HLA-типированных потенциальных доноров ГСК в организациях службы крови Республики Беларусь.

Материалы и методы. В Республике Беларусь с 2013 года функционирует реестр доноров гемопоэтических стволовых клеток, объединяющий в себе информацию об HLA-фено(гено)типах потенциальных доноров ГСК из 7 баз данных организаций переливания крови. Организовано проведение серологического типирования по I классу в областных станциях переливания крови (ОСПК) на типи-рующих панелях производства РНПЦ транс-фузиологии и медицинских биотехнологий (РНПЦ ТиМБ). Молекулярно-генетическое ти-пирование по II классу осуществляется в РНПЦ ТиМБ по технологии SSO для всех потенциальных доноров ГСК, рекрутированных из донорского контингента крови и её компонентов.

Результаты. К 2014 году в Республике Беларусь сформировалась четкая система рекрутирования потенциальных доноров ГСК в базу данных Центрального реестра. Общее количество ИЬЛ-типированных потенциальных доноров ГСК в организациях переливания крови составляет около 34 000, из которых на долю РНПЦ ТиМБ приходится около 50%. По HLA-АВСDR типировано 18 920 доноров, что составляет более 55 % от общего количества доноров ГСК. Показатель эффективного развития Республиканского реестра находит свое отражение в ежегодном увеличении числа потенциальных доноров ГСК ОПК за последние несколько лет, преимущественно за счёт кадровых и первичных доноров крови. На 2014 год в Центральный реестр были внесены данные о 12 386 рекрутированных потенциальных донорах ГСК. В 2015 году база пополнилось на 5521 донора, в 2016 и 2017 гг.— увеличилась на 7193 и 8602 человека, что позволило провести 8 аллогенных трансплантаций.

Выводы. Динамичное нарастание информационной базы ИЬЛ-типированых доноров гемопоэтических стволовых клеток Центрального реестра Республики Беларусь и перспективное объединение с регистрами Российской Федерации и Республики Казахстан повысит вероятность нахождения идентичного донора для трансплантации ГСК.

Иоффе Ю. Г.1, Шмидт А.Х.2, Заутер Ю.2, Кипяткова В. А.3, Красильщиков А. М.4

1 Благотворительный фонд «Карельский регистр неродственных доноров гемопоэтических стволовых клеток», г. Петрозаводск,

2 DKMS-Tuebingen, г. Тюбинген (Германия),

3 СПб ЭМИ РАН, г. Санкт-Петербург,

4 ФТИ им. А. Ф. Иоффе, г. Санкт-Петербург

ВИЧРЕЗИСТЕНТНЫЕ ГЕНОТИПЫ В КАРЕЛЬСКОМ РЕГИСТРЕ НЕРОДСТВЕННЫХ ДОНОРОВ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК: КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

Введение. В 1996 г. было показано, что гомозиготное носительство делеции 32 гена CCR5 (CCR5 Del32) связано с резистентностью к вирусу ВИЧ. В 2007 г. в берлинской клинике Charite успешно проведена неродственная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) от донора, гомозиготного по CCR5 Del32 пациенту, страдавшему ВИЧ инфекцией и острым миелобластным лейкозом. В результате пациент был излечен одновременно от ВИЧ инфекции и лейкемии. Однако в последующие годы уже не было столь оптимистичных сообщений об успешных неродственных ТГСК от ВИЧ-резистентных доноров пациентам, страдавшим одновременно ВИЧ инфекцией и онкогематологи-ческими заболеваниями. Международная поисковая система доноров костного мозга (BMDW) не аккумулирует в себе данные о ВИЧ-резистентных донорах. Тем не менее, некоторые регистры доноров ГСК и банки пуповинной крови, в частности, Покровский банк пуповинной крови (Санкт-Петербург) и Челябинский регистр доноров костного мозга, тестируют своих доноров на наличие CCR5 Del32, формируя базы данных ВИЧ-резистентных доноров. Помимо CCR5 Del32 с ВИЧ-резистентностью ассоциируются некоторые HLA-генотипы, в частности, группы аллелей В*27, В*57 и гаплотип DRB1*13 -DQB1*06.

С 2015 г. всем первичным и повторным донорам Карельского регистра неродственных доноров ГСК проводится определение гена CCR5 в лаборатории DKMS Life Science Lab (Германия). В этой же лаборатории проводится HLA-типирование доноров высоким разрешением.

Цель. Целью настоящее работы явилась оценка количества ВИЧ-резистентных доноров Карельского регистра и частотностей генотипов, ассоциируемых с ВИЧ-резистентностью: анализ частот CCR5 Del32,

а также частот групп аллелей В*27, В57* и га-плотипа DRB1*13 - DQB1*06.

Материалы и методы. В анализ были включены данные доноров, которым HLA-типирование осуществлено молекулярно-биологическим методом. Оценки частот групп аллелей и гаплотипов получены как впрямую, так и с помощью ЕМ-алгоритма («expectation-maximization», вариант метода максимального правдоподобия). Кроме того, было проверено, что равновесие Харди-Вайн-берга для групп аллелей В*27, В57* и гаплоти-па DRB1*13 - DQB1*06 соблюдается на уровне лучше 2 стандартных отклонений (95 %).

Результаты. Гомозиготы CCR5 Del32 оказались у 15 доноров из 1468 протипирован-ных по этому гену, что составило 1,0% +/-0,26 %. Гетерозиготное носительство CCR5 Del32 / WT выявлено у 288 доноров из 1468 (19,6% +/- 1,03%), гомозиготы HLA-B*27 — у 13 из 3656 (0,36% +/- 0,1%), гомозиготы HLA-B*57 — у 6 из 3656 (0,16 % +/- 0,07 %). Ге-терозиготы, у которых в одной из хромосом имеется HLA-B*27, а в другой HLA-B*57, обнаружены в 12 из 3656 случаев (0,3 % +/- 0,1 %). Также выявлено 14 из 1504 протипирован-ных доноров, гомозиготных по HLA-DRB1*13 и одновременно по HLA-DQB1*06 (0,93 % +/-0,16 %). Все статистические ошибки указаны на уровне 68 % (1 стандартное отклонение).

Выводы. Полученные данные свидетельствуют о том, что донорская база Карельского регистра ГСК содержит 9 % ВИЧ-резистентных доноров: 330 человек из 3656 (c учетом 3 совпадений по перечисленным выше признакам) имеют генотипы, ассоциируемые с ВИЧ-резистентностью. Следует надеяться на то, что ВИЧ-резистентные доноры ГСК окажутся востребованными для проведения неродственных ТГСК пациентам, страдающим ВИЧ и онкогематологическими заболеваниями.

Кострома И. И., Жернякова А. А., Чубукина Ж. В., Семенова Н. Ю., Запреева И. М., Тиранова С. А., Бессмельцев С. С., Чечеткин А. В., Грицаев С. В.

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства», Санкт-Петербург

ФАКТОРЫ, АССОЦИИРОВАННЫЕ С ЭФФЕКТИВНОСТЬЮ ОТДЕЛЬНЫХ ЭТАПОВ ТРАНСПЛАНТАЦИИ АУТОЛОГИЧНЫХ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК (АУТОТГСК) У БОЛЬНЫХ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМОЙ

Введение. АутоТГСК — составляющая часть алгоритма лечения больных множественной миеломой (ММ). Эффективность АутоТГСК опосредована циторедуктивным действием режима кондиционирования. Не менее важным условием является скорость и надежность восстановления кроветворения после высокодозной химиотерапии. В свою очередь, сроки приживления трансплантата зависят от количественных и качественных характеристик, в частности, от объема инфузированных CD34+ клеток.

В литературе представлено большое число показателей, сопряженных с вероятностью неудачной мобилизации ГСК из костного мозга в периферическую кровь, а также с длительностью посттрансплантационной аплазии. Внедрение в клиническую практику новых лекарственных препаратов, совершенствование режимов мобилизации и интенсификация схем кондиционирования может оказать негативное влияние на состав продукта афереза и длительность периода посттрансплантационной цитопении.

Цель. Поиск предикторов эффективности АутоТГСК у больных ММ. Для решения поставленной цели были сформулированы 2 задачи. Первая — выявить факторы, ассоциированные с количеством CD34+ в аутотран-сплантате. Вторая — установить показатели, сопряженные со сроками приживления трансплантата.

Материалы и методы. Для решения первой задачи были проанализированы данные 75 больных с медианой возраста 56 (26 - 67) лет, включая 42 больных миеломой G, 21 больного миеломой Л и 8 больных миеломой Бенс-Джонса. Миелома D была верифицирована у одной больной и у 3 больных диагностирован несекретирующий вариант (данные этих больных в анализ влияния варианта ММ на клеточность трансплантата не вошли).

Режим мобилизации, за исключением одного случая, когда был использован грану-

лоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) в режиме монотерапии, состоял из внутривенного введения циклофосфана в дозе 3,0 г/м2 (47 больных) или внутривенного введения винорелбина в дозе 35 мг/м2 (27 больных) в комбинации с Г-КСФ.

Перед инициацией режима мобилизации были констатированы следующие варианты ответа: полный ответ (ПО) у 20 (26,7 %) больных, очень хороший частичный ответ (ОХЧО) у 23 (30,7%) и частичный ответ (ЧО) у 32 (42,6 %) больных.

Для решения второй задачи анализу были подвергнуты данные 72 больных, которым в общей сложности было выполнено 112 АутоТГСК: 32 (44,4 %) больным одиночная и 40 (55,6%) больным двойная, включая тандем-ную АутоТГСК. Статус болезни перед инициацией режима кондиционирования был следующим: ПО у 54 (48,2 %) больных, ОХЧО у 18 (16,1 %) больных и ЧО у 40 (35,7 %) больных.

Медиана количества трансфузирован-ных CD34+ клеток составила 2,65х106/кг веса тела и находилась в диапазоне от 0,77 до 10,45х106/кг веса тела. Ни в одном случае заготовки аутотрансплантата в состав режима мобилизации плериксафор не входил. Всем больным в посттрансплантационном периоде назначался Г-КСФ.

Результаты. При анализе результатов заготовки аутотрансплантата установлена корреляционная связь количества CD34+ клеток со следующими показателями: с числом схем, которые назначались больным в период, предшествующий проведению аферезов: 1 схема против >2 схем, г= - 0,278, р <0,05; с режимом мобилизации: циклофосфан против винорелбина, г=0,320, р < 0,05; с качеством ответа: ПО против других вариантов, г=0,262, р < 0,05. Возраст, вариант ММ и предшествующий прием леналидомида прогностического значения не имели.

Анализ сроков приживления трансплантата выявил корреляционную связь длительно-

сти периода восстановления кроветворения с порядковым номером АутоТГСК; г= - 0,025; р <0,05. Данная находка сопряжена с тем фактом, что при проведении повторной Ау-тоТГСК значимо чаще использовался режим кондиционирования «Ме1140»: в 53,2 % случаев против 17,5% при выполнении первой АутоТГСК; р=0,001. Наблюдаемое при этом снижение миелоаблативного воздействия на костномозговое кроветворение способствовало укорочению периода агранулоцито-за: 9 дней и 10 дней при повторной и первой АутоТГСК соответственно; р=0,001. Другим фактором, который влияет на сроки восстановления АЧН и тромбоцитов, является количество трансфузированных CD34+ клеток; г= -0,296, p <0,05 и г= -0,412, p <0,05 соответственно.

Выводы. Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что качество аутотрансплантата и, соответственно сроки восстановления гемопоэза после АутоТГСК, во многом определяются эффективностью терапии в предтрансплантационном периоде. Корректный выбор индукционной схемы, способствующий достижению ответа в максимально короткие сроки, и выбор интенсивности режима мобилизации, адоптированного к характеру предшествующей терапии, возрасту больного, интенсивности режима кондиционирования и числу предполагаемых АутоТГСК, могут обеспечить максимальное быстрое приживление трансплантата после АутоТГСК.

Котова А. В., Скакун В. Н., Клементьева Н. А., Золина Т. Л., Елсукова Л. В., Енукашвили Н. И.

ООО «Покровский банк стволовых клеток», Санкт-Петербург, ООО «Медико-биологический центр», Великий Новгород

5ТЯПРОФИЛИРОВАНИЕ — НЕОТЪЕМЛЕМЫЙ ЭТАП КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ПРИ БАНКИРОВАНИИ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР И БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ

Введение. Аутентификация клеточных культур — одна из важнейших задач контроля качества при создании банка клеток и биологических образцов. Банкирование клеток требует абсолютной уверенности в отсутствии перекрестного заражения другими образцами, а при производстве аутологичных клеточных продуктов важно удостовериться, что клетки, используемые для их изготовления, принадлежат пациенту, поскольку это является вопросом его безопасности. В соответствии с Федеральным законом «О биомедицинских клеточных продуктах» ФЗ-180, в Российской Федерации формируется обращение биомедицинских клеточных продуктов, что повышает требования к обеспечению и контролю качества, и, следовательно, становится необходимым использование надежного метода идентификации клеточных культур и биологических образцов при бан-кировании.

Материал и методы. Анализ полиморфизма STR (Short tandem repeat) — это стандартный метод идентификации клеток, позволяющий исследовать высокополиморфные

участки (генетические локусы) ДНК, строго специфичные для каждой клеточной культуры. Этот метод широко применяется в международных банках клеточных культур. Американский национальный институт стандартов (ANSI) и Американская коллекция типовых культур (American Type Culture Collection, ATCC) создали стандарт профилирования (ASN-0002) для клеточных линий человека, основанный на использовании коротких тан-демных повторов (STR), согласно которому для идентификации культуры необходимо исследовать 17 маркеров STR и локус амело-генина.

Результаты. С 2017 года в Покровском банке каждая клеточная культура мезенхималь-ных стволовых клеток (МСК), полученная из периваскулярного пространства пупочной вены человека, идентифицируется методом STR-профилирования, и результат такого исследования оформляется в виде отдельного паспорта. При поступлении пупочного канатика в лабораторию, осуществляют отбор образца ткани для генетического анализа коротких тандемных повторов и создания

референтного профиля. Анализ проводится в лаборатории ООО «Медико-биологический центр» с использованием набора «COrDIS Plus» для идентификации 19 маркеров STR и локуса амелогенина человека. Анализ включает 13 классических систем комбинированного индекса ДНК-CODIS (D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, VWA), 5-ENFCI (D1S1656, D2S441, D10S1248, D12S391, D22S1045), а также SE33 и амелоге-нин. Перед криоконсервацией клетки отбираются для повторного STR-профилирования и сравнения референтного профиля и профиля после культивирования, что обеспечивает контроль перекрестной контаминации. На настоящий момент проанализирован 261 образец. Применение подобного метода позволило быстро и эффективно идентифицировать образцы. Этот метод оказался крайне полезен в ряде сложных случаев идентификации биологического материала. Например, при заборе пупочного канатика от двойни в родильном доме были перепутаны сопроводительные документы, что выяснилось толь-

ко после проведения STR-профилирования, так как дети были разного пола. Культуры, предназначенные для именного хранения, можно подвергнуть повторной аутентификации по запросу пациента. Определить принадлежность клеток возможно в случае полной утраты любых идентификационных знаков в процессе хранения (например, при утрате штрих кодов или стирании надписей на пробирке). С помощью STR-профилирования также можно выявить наличие спонтанных мутаций и перестроек в геноме клеточной культуры, что является критичным для безопасности и контроля качества. Для всех исследованных культур не показано изменений в геноме.

Выводы. Применение STR-

профилирования позволяет на любом этапе обработки и заготовки клеточного продукта и биологического образца проверить его биологическую принадлежность, что обеспечивает качество и безопасность биологических образцов, делая их пригодными для производства биомедицинских продуктов в дальнейшем.

Кузьминова Е. П., Хамаганова Е. Г., Абдрахимова А. Р.

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва

ЧАСТОТЫ АЛЛЕЛЬНЫХ ГРУПП И ГАПЛОТИПОВ ИЬА В ПОПУЛЯЦИИ ОСЕТИН ВЛАДИКАВКАЗА

Введение. Регистр потенциальных доноров костного мозга ФГБУ «НМИЦ гематологии» г. Москва в своем большинстве представлен донорами, проживающими в Москве и Московской области и самоопределившимися, как русские. Однако в состав регистра входят также представители других этнических групп и регионов проживания, в частности осетины Владикавказа. Осетины являются носителями осетинского языка, который принадлежит к иранской группе индоевропейских языков, и предположительно являются потомками Алан — племени скифо-сарматского происхождения. Генетические исследования осетин (митохондриальной ДНК и Y-гаплогрупп) выявили большее их сходство с русскими, чем с соседями — другими популяциями Кавказа. Исходя из всего вышесказанного, оценка иммуногенетического

профиля осетин по генам HLA представляется особенно интересной.

Целью данной работы было оценить частоты встречаемости аллельных групп и га-плотипов HLA у осетин Владикавказа.

Материалы и методы. Исследуемая выборка представлена 127 здоровыми донорами, которые проживают в г. Владикавказ Северной Осетии и являются осетинами в третьем поколении. Материал для исследования— венозная кровь. Выделение ДНК — Blood DNA Extraction Kit на приборе NorDiag Arrow (NorDiag, Норвегия). Типирование по 6 локусам генов HLA проводили методом PCR-SSO на платформе Luminex с использованием наборов Lifecodes SSO Typing Kit (Immucor, США), для уточнения неоднозначностей пользовались наборами Olerup (Швеция). 127 доноров типированы по локусам HLA-A,—

B,— C,— DRB1,— DQB1, из них 119 доноров дополнительно типированы по локусу -DQA1. Статистическую обработку данных и соответствие наблюдаемого распределения ал-лельных групп равновесию Харди-Вайнбер-га проводили с использованием программы Arlequin 3.5.

Результаты. Согласно закону Харди-Вайн-берга исследуемая выборка находится в состоянии равновесия по всем локусам. В результате типирования осетин по генам HLA I класса было выявлено 14 аллельных групп в локусе А, 20 аллельных групп в локусе B и 13 аллельных групп в локусе C. Наиболее распространенными вариантами в локусе HLA-A оказались A*02 (24.8 %), A*30 (13.4 %) и A*03 (12.6 %). В локусе HLA-B — B*49 (15.7 %), B*51 (12.6 %), B*07 (11 %). Среди аллельных групп локуса HLA-C высокие частоты наблюдались для C*07 (41.3 %), C*06 (15.3 %), C*04 (8.3 %) и C*12 (8.3 %).

При типировании осетинской популяции по генам HLA II класса было выявлено 12 аллельных групп в локусе HLA-DRB1, 6 аллельных групп в локусе HLA-DQA1 и 5 аллельных групп в локусе HLA-DQB1. Самыми высокочастотными в локусе HLA-DRB1 аллельны-ми группами оказались DRB1*13 (21.7%), DRB1*11 (17.3 %), DRB1*15 (13 %).

В локусах HLA-DQA1 и HLA-DQB1 наиболее частотными были DQA1*01 (47%), DQA1*05 (31%), DQA1*02 (11%), DQB1*06 (34.2%), DQB1*03 (30.2 %), DQB1*02 (23.6 %).

При оценке шестилокусных гаплотипов в популяции осетин (2n=238) наиболее частым оказался гаплотип A*30-B*49-C*07-DRB1*13-DQA1*01-DQB1*06 (9%). Данный гаплотип с подобной частотой не встречается ни в одной доступной для сравнения попу-

ляции, однако с меньшей частотой есть у турок (0.02%), итальянцев (0.13%) и жителей Никарагуа (0.22 %). Следующие гаплотипы, выявленные в популяции осетин: А*03-В*07-С*07^В1*15^А1*01^В1*06 (встретился с частотой 4.6%) и А*32-В*08-С*07-DRB1*03-DQA1*05-DQB1*02 (с частотой 2.5 %) довольно распространены в европейских популяциях и среди русских доноров регистра ФГБУ «НМИЦ гематологии»; и гаплотип А*02-В*51-С*16^В1*11^А1*05^В1*03 с частотой 3.7% — характерен прежде всего для представителей азиатских популяций. Гапло-тип, который преобладает в большинстве европейских популяций и у русских доноров регистра ФГБУ «НМИЦ гематологии» — А*01-В*08-С*07^В1*03^А1*05^В1*02, у осетин занимает пятое по частоте место и встречается в 1.7 % случаев.

Выводы. Таким образом, осетины Владикавказа представляют собой популяцию, уникальность которой заключается в одновременном присутствии у них с высокой частотой таких аллельных групп, как ИЬА-А*02 и А*30, ИЬА-В*51 и В*07, а также гаплотипов А*03-В*07-С*07^В1*15^А1*01^В1*06 и А*02-В*51-С*16^В1*11^А1*05-

DQB1*03, характерных для европейцев и для азиатов. Кроме того, отличительной чертой осетин, выделяющей их среди мировых и основных российских популяций, можно считать высокие частоты аллельных групп ИЬА-В*49, ИЬА-С*07, ИЬА^В1*13 и гаплотипа А*30-В*49-С*07^В1*13^А1*01^В1*06. Типи-рование и включение в регистр доноров с подобными генотипами повысит вероятность нахождения совместимых неродственных доноров для пациентов из того же региона и пациентов с редкими генотипами ИЬА.

Кузьмич Е. В., Алянский А. Л., Ермолина В. В., Мерзлякова С. В., Тяпушкина С. С., Насрединова А. А., Иванова Н. Е., Зубаровская Л. С., Афанасьев Б. В.

НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р. М. Горбачевой, ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. И. П. Павлова Минздрава России, Санкт-Петербург

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ HLA~A*~B*~C*~DRB1*~DQB1* ГАПЛОТИПОВ В РЕГИСТРЕ ДОНОРОВ КОСТНОГО МОЗГА ПСПБГМУ им. И. П. ПАВЛОВА. АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫСОКОРАЗРЕШАЮЩЕГО ^А ТИПИРОВАНИЯ

Введение. Аллогенная трансплантация злокачественных заболеваний системы кро-гемопоэтических стволовых клеток (алло- ви. К числу факторов, оказывающих суще-ТГСК) является ведущим методом терапии ственное влияние на результаты алло-ТГСК,

относятся совместимость пары донор/реципиент по HLA аллелям, HLA гаплотипам. Развитие сети регистров потенциальных доноров костного мозга на территории Российской Федерации повышает доступность неродственных доноров с оптимальными им-муногенетическими характеристиками для российских пациентов, которым необходимо проведение алло-ТГСК.

Цель исследования. Изучить распределение пятилокусных HLA-A*~B*~C*~DRB1*~DQB1* гаплотипов в регистре доноров костного мозга Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П.Павлова.

Материалы и методы. Обследованная когорта включала 1000 доноров. Высокоразрешающее HLA типирование выполнено с помощью метода моноаллельного секвенирования по Сэнгеру с использованием реагентов фирмы Protrans (Германия), программного обеспечения для анализа HLA аллелей Sequence Pilot version 4.1.2. Определение частот HLA га-плотипов осуществлено на основе алгоритма максимизации ожидания (EM алгоритм) с помощью программы Arlequin version 3.5.1.2.

Результаты. В обследованной когорте выявлено 1325 HLA~A*~B*~C*~DRB1*~DQB1* гаплотипов из 27125 потенциально возможных. Определены гаплотипы, которые встречаются у доноров регистра с максимальной частотой:

1. A*01:01~B*08:01~C*07:01~DRB1*03:01~D QB1*02:01 - 3,36 %

2. A*03:01~B*07:02~C*07:02~DRB1*15:01~D QB1*06:02 -3,12%

3. A*03:01~B*35:01~C*04:01~DRB1*01:01~D QB1*05:01 -1,81 %

4. A*02:01~B*07:02~C*07:02~DRB1*15:01~D QB1*06:02 - 1,34%

5. A*25:01~B*18:01~C*12:03~DRB1*15:01~D QB1*06:02 -1,03%

6. А*02:01~Б*13:02~С*06:02~ВЯБ1*07:01~Б ((Б1*02:01 -1,01 %

7. А*24:02~Б*07:02~С*07:02~0ЯБ1*15:01~0 (Б1*06:02 - 0,83 %

Выполнен сравнительный анализ результатов исследования с данными, опубликованными регистром NMPD, США (Ы±р://шшш. allelefrequencies.net). Наиболее распространенные в нашем регистреА*01:01~Б*08:01~С*07:01~ БЯБ1*03:01~ Б(Б1*02:01, А*03:01~Б*07:02~С*07 :02~БЯБ1 *15:01~Б(Б1 *06:02, А*02:01~Б*07:02~ С*07:02~БЯБ1*15:01~0(Б1*06:02 гаплотипы встречаются с высокой частотой в когорте доноров европейского происхождения NMDP (6,53%, 3,11% и 1,97% соответственно). Га-плотип А*03:01~Б*35:01~С*04:01~БЯБ1*01:01 ~й(Б1*05:01 встречается в когорте доноров NMDP с несколько более низкой частотой (1,12%). Информация об идентификации А*0 2:01~Б*13:02~С*06:02~БЯБ1*07:01~0(Б1*02:01, А*25:01~Б*18:01~С*12:03~БЯБ1*15:01~0 (Б1*06:02 гаплотипов у доноров европейского происхождения NMDP не представлена.

К числу гаплотипов, принадлежащих к группе высокочастотных по данным NMDP, относятся А*02:01~Б*44:02~С*05:01~ БЯБ1 * 04:01 ~0(Б1 *03:01, А *29:02~Б*44:03~ С*16:01~БЯБ1*07:01~0(Б1*02:01 (частота 1,85% и 1,57%). В нашем регистре данные гаплотипы встречаются с частотой 0,20 % и 0,35% соответственно. Таким образом, результаты анализа демонстрируют, что распределение ^Л гаплотипов в группах сравнения имеет характерные особенности.

Выводы. Выполнен анализ распределения ^Л гаплотипов в регистре доноров костного мозга ПСПбГМУ им. акад. И.П.Павлова. Результаты исследования могут быть использованы для оценки вероятности подбора оптимального донора в российских или международных регистрах российским пациентам, которым показано проведение алло-ТГСК.

КОНФЕРЕНЦИЯ С МЕЖДУНАРОДНЫМ УЧАСТИЕМ Санкт-Петербург

«АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ИММУНОГЕНЕТИКИ И ТКАНЕВОГО ТИПИРОВАНИЯ» 30-31 мая 2018 г.

Кузьмич Е. В., Алянский А. Л., Ермолина В. В., Мерзлякова С. В., Тяпушкина С. С., Насрединова А. А., Иванова Н. Е., Зубаровская Л. С., Афанасьев Б. В.

НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р. М. Горбачевой, ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. И. П. Павлова Минздрава России, Санкт-Петербург

АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫСОКОРАЗРЕШАЮЩЕГО ^А ТИПИРОВАНИЯ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ДОНОРОВ РЕГИСТРА ДОНОРОВ КОСТНОГО МОЗГА

ПСПБГМУ им. И. П. ПАВЛОВА

Введение. Аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) от неродственного донора является вариантом выбора для пациентов, не имеющих HLA идентичного родственного донора. Скорость и успешность поиска неродственного донора для конкретного больного зависит от ряда факторов. Среди них — наличие у пациента распространенного или редкого HLA гаплотипа, редких вариантов HLA аллелей, а также количество и уровень иммуногенети-ческого обследования потенциально совместимых доноров.

Цель исследования. Изучить распределение частот HLA-A,— B,— C,— DRB1,— DQB1 аллелей, установленных с помощью HLA ти-пирования высокого уровня разрешения, в регистре доноров костного мозга ПСПбГМУ им. акад. И. П. Павлова.

Материалы и методы. Выполнено им-муногенетическое обследование 1000 потенциальных доноров. Высокоразрешающее HLA типирование осуществлено с помощью метода моноаллельного секвенирования по Сэнгеру с применением реагентов фирмы Protrans (Германия), программного обеспечения Sequence Pilot version 4.1.2. Определение частот HLA аллелей выполнено с помощью программы Arlequin version 3.5. 1.2.

Результаты. Анализ результатов высокоразрешающего HLA типирования 1000 потенциальных доноров позволил идентифицировать три новых HLA аллеля, выявить присутствие редких HLA аллелей, определить наиболее распространенные HLA аллели в регистре ПСПбГМУ им. И. П. Павлова. Новые аллели, официально названные B*44:02:45, DQB1 *02:85, DRB1*01:01:30, зарегистриро-

ваны Номенклатурным Комитетом по факторам HLA системы Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) (Marsh S. G.E., 2017). Аллели HLA-A*02:460, HLA-A*31:66, HLA-B*08:138, обнаруженные у доноров регистра, согласно информации AFND (Allele Frequency Net Database) относятся к группе редких (http://www.allelefrequencies.net).

Установлено, что у потенциальных доноров регистра ПСПбГМУ им. И. П. Павлова наиболее распространенными аллелями локуса HLA-A являются: A*02:01 - 23,9 %, A*03:01 - 13,9 %, A*01:01 - 10,9 %, A*24:02 - 10,2 %,

A*11:01 - 4,6 %, A*25:01 - 4,2 %. В локусе HLA-B наиболее часто встречаются: B*07:02 - 11,6 %, B*08:01 - 6,7 %, B*18:01 - 5,1 %,B*13:02 - 4,9 %, B*35:01 -4,9%, B*44:02 - 4,7 %. В локусе HLA-C с максимальной частотой представлены аллели: C*07:02 - 13,1 %, C*07:01 - 10,7 %, C*04:01 - 9,3 %, C*06:02 - 9,0 %, C*12:03 - 8,9 %, C*02:02 - 5,5 %. Наиболее высокочастотными аллелями локуса HLA-DRB1 являются: DRB1**07:01 - 13,2 %, DRB1*15:01 - 11,5 %, DRB1*01:01 - 10,2 %, DRB1*03:01 - 8,2 %, DRB1*13:01 -5,2 %, DRB1*16:01 - 4,4 %.

В локусе HLA-DQB1 наиболее часто определяются аллели: DQB1*03:01 -14,6%, DQB1*02:01 - 13,9 %, DQB1*05:01 - 11,5 %, DQB1*06:02 - 10,7 %, DQB1*03:02 - 6,3 %, DQB1*06:03 -5,8%.

Выводы. Применение методов высокоразрешающего HLA типирования для иммуноге-нетического обследования потенциальных доноров регистра будет способствовать сокращению времени поиска неродственного донора для проведения алло-ТГСК, а также изучению полиморфизма генов системы HLA.

Кутявина С. С., Смирнова Д. Н., Черанев В. В., Логинова М. А.

Федеральное государственное бюдЦжетноеучреждение науки «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови» Федерального медико-биологического агентства, Киров

АНАЛИЗ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПОДБОРА СОВМЕСТИМЫХ ДОНОРОВ ДЛЯ ПАЦИЕНТОВ, НУЖДАЮЩИХСЯ В ТГСК

Введение. Трансплантация гемопоэтиче-ских стволовых клеток (ТГСК) является одним из наиболее эффективных методов лечения ряда гематологических, онкологических и наследственных заболеваний. Ежегодно в мире проводится около 50 - 60 тысяч ТГСК от совместимого родственного, неродственного или гаплоидентичного донора. Одним из важнейших условий успешного проведения ТГСК является подбор донора, совместимого по генам HLA-системы (Human Leukocyte Antigens—человеческие лейкоцитарные антигены).

Гены HLA-системы, определяемые в процессе проведения тканевого типирования, очень полиморфны и имеют высокую степень вариабельности. По состоянию на декабрь 2017 года зарегистрировано 17 695 аллелей HLA (I класс—12893 аллеля, II класс — 4802 аллеля). Это приводит к большому генетическому разнообразию, существенно осложняющему подбор совместимого донора.

Цель работы. Проведение анализа эффективности подбора совместимых доноров для пациентов, нуждающихся в ТГСК.

Материалы и методы. Проведен ретроспективный анализ результатов подбора совместимых родственных, неродственных, га-плоидентичных доноров для 109 пациентов института, нуждающихся в ТГСК (55—женщины, 54 - мужчины). По диагнозам пациенты распределялись следующим образом: миелолейкоз — 47 (43,1%), лимфобластный лейкоз — 24 (22,0%), апластическая анемия—11 (10,1%), лимфомы — 11 (10,1%), другие —16 (14,7%).

Подбор HLA-совместимых доноров осуществляли по 5 локусам — HLA-A,— B,— C,— DRB1,— DQB1. HLA-типирование пациентов и доноров проведено молекулярно-генетиче-скими методами — SSP и SBT.

При подборе донора использовали следующую стратегию: после получения результата высокоразрешающего типирования пациента производили сбор данных о наличии потенциальных родственных доноров.

В случае наличия сиблингов проводили ИЬЛ-типирование локусов II класса в низком разрешении. При выявлении несовместимости исследование прекращали, при выявлении совместимости — типировали локусы I класса в низком разрешении. При полной совместимости пары донор-реципиент на уровне низкого разрешения осуществляют высокоразрешающее типирование донора.

Подбор потенциальных неродственных доноров в объединенной базе данных о российских донорах BMDS проводили для каждого пациента.

При отсутствии совместимых родственных и неродственных доноров и наличии врачебного заключения о возможности проведения гаплотрансплантации производили типирование родителя/ребенка в низком разрешении. При выявлении гаплосовмести-мости (не менее чем 5/10) пары донор-реципиент проводили высокоразрешающее ИЬЛ-типирование.

Результаты. В ходе анализа данных установлено, что 37,6 % (41) пациентов имеют одного или нескольких сиблингов. В ходе подбора потенциального родственного донора протипировано 48 сиблингов: для 21 донора исследование прекращалось на этапе изучения локусов II класса, 5 доноров оказались несовместимыми с пациентами после получения результатов типирования в низком разрешении по всем пяти локусам, 1 донор оказался частично совместим (9/10), 21 донор был полностью совместим с пациентом (10/10).

На основании врачебного заключения га-плоидентичная ТГСК показана 14 пациентам (12,8 %), для которых были протипированы 17 родственных доноров (родителей/детей), все из которых оказались гаплосовместимы-ми.

Для остальных 74 пациентов требовался поиск потенциального неродственного донора. В объединенной базе данных о российских донорах BMDS были найдены полностью совместимые неродственные доноры для 29

(39,2 %) пациентов (при этом для 10 число совместимых доноров было более чем 2), для 23 (31,1 %) —частично совместимые (9/10), для 22 пациентов (29,8%) — потенциальный неродственный донор не был найден. Это подчеркивает важность увеличения числа потенциальных неродственных доноров в России.

Выводы. Установлено, что только 19,3 % пациентов имеют совместимого родственного донора. Для 39,2 % пациентов, не имеющих родственных доноров, удалось подобрать совместимого неродственного донора. 20 % пациентов не имеют совместимых доноров.

Лексина Я. А., Габидуллина Р. И., Ананьева А. В., Шагимарданова Е. И.

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Казанский (приволжский) федеральный университет», Казань

ОПЫТ ВНЕДРЕНИЯ СЕКВЕНИРОВАНИЯ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ (N05) ДЛЯ ДАМПИРОВАНИЯ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ДОНОРОВ КОСТНОГО МОЗГА В РФ

Введение. С момента появления метода секвенирования нового поколения (Next Generation Sequencing — NGS) наблюдается его быстрое внедрение в научные и клинические молекулярно-генетические лаборатории. Преимущество метода по сравнению с другими технологиями типирования связано с относительно небольшой стоимостью, меньшей трудозатратностью, скоростью обработки большого количества образцов. В первую очередь, метод стал востребованным для поиска патогенных вариантов (мутаций), ассоциированных с различными генетическими заболеваниями. В последние годы наблюдается все более широкое внедрение метода NGS для типирования генов гистосовместимости во всем мире. Этот метод дает возможность разрешать аллельные неоднозначности и обеспечивает наивысшую степень разрешения. Успешному внедрению данного метода в рутинную практику имму-ногенетических лабораторий способствует и появление на рынке множества компаний, предоставляющих реагенты для пробопод-готовки и автоматизированное программное обеспечение для высокоточного определения фенотипа каждого образца.

Цель. Целью данного исследования явилось внедрение метода NGS для HLA-типирования потенциальных доноров костного мозга на платформе Illumina в лабораторию Казанского федерального университета.

Материалы и методы. В качестве объекта исследования использовали образцы венозной крови потенциальных доноров костного мозга, рекрутированных в рамках выполнения гранта Президента РФ Благотворитель-

ному фонду «Русфонд» (№ 17 - 2 - GG4129). Стальная ДНК выделялась из 2GG мкл крови с использованием автоматизированной станции MagNA Pure LS2.G (Roche Life Science). Концентрация и качество выделенной ДНК оценивалась с помощью спектрофотометра Implen NanoPhotometer NP 8G (Implen). Для дальнейшей подготовки библиотек были использованы наборы двух производителей: NGSgo (GenDX, Нидерланды) и Holotype (Omixon, Венгрия). Cеквенирование проводили с использованием MiSeq reagent kit v.2 и секвенатора MiSeq (Illumina, CШA). Aнализ результатов проводили с использованием программного обеспечения, предоставляемого производителями наборов для подготовки библиотек: NGSengine и HLA Twin.

Результаты. Протокол подготовки библиотек для секвенирования двух производителей достаточно схож и включает в себя локус-специфичную ПЦР, фрагментацию ам-пликонов, лигирование адаптеров (необходимых для связывания с ячейкой и введения сайта для сиквенсового праймера) и индексов (необходимых для введения штрих-кода каждого образца), секвенирование и анализ данных. Подготовка библиотек для секве-нирования в формате 96-луночного планшета занимала 2 рабочих дня. При работе двух лаборантов за два дня удавалось получить два пула, содержащих по 96 образцов. Эти образцы смешивались так, что за один запуск секвенатора было возможно протипировать 192 образца одновременно. Результаты сек-венирования получали на третьи сутки после запуска, дальнейший анализ занимал от 12 до 24 часов в зависимости от использован-

ного программного обеспечения и мощности компьютера. Каждый образец, вне зависимости от протокола подготовки, был проанализирован с использованием двух программных обеспечений. Как правило, результаты анализа полностью совпадали.

Выводы. При условии работы двух лаборантов в 96-луночном формате с использо-

ванием метода NGS возможно типировать до 192 образцов в неделю. Оба протокола позволяют получить достоверные результаты в высоком разрешении. Таким образом, метод NGS является достаточно производительным и позволяет организовать большое количество типирований для пополнения регистров потенциальных доноров костного мозга.

Логинова М. А.1, Павлов А. Е.2, Зайцева М. А.2, Симакова Т. С.2, Пильщикова Н. С.2, Парамонов И. В.1

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови» Федерального медико-биологического агентства, Киров

2 ООО «ПАРСЕКЛАБ», Санкт-Петербург

ОТЕЧЕСТВЕННАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОГО HLA- ГЕНОТИПИРОВАНИЯ: РАЗРАБОТКА И ВЕРИФИКАЦИЯ

Введение. По состоянию на 28 февраля 2018 года число потенциальных доноров ге-мопоэтических стволовых клеток (ГСК), зарегистрированных в объединенной базе данных о российских донорах BMDS, составляет 79 595 человек, в неё включены 15 регистров из 11 регионов Российской Федерации. Такое количество безвозмездных доноров на сегодняшний день обеспечило 202 трансплантации ГСК для пациентов российских клиник.

В последние пять лет наметился явный прогресс во взаимодействии трансплантационных клиник с BMDS, однако многие российские пациенты по-прежнему зависят от материала, получаемого из-за рубежа, либо вообще остаются без совместимого неродственного донора.

Сложившаяся ситуация требует увеличения числа потенциальных доноров ГСК в короткие сроки, а требования трансплантационных центров определяют необходимость ИЬЛ-типирования доноров молекулярно-ге-нетическими методами как минимум по пяти ИЬЛ-локусам. Прогресс в расширении донорской базы ограничивается прежде всего высокой стоимостью реагентов, используемых для проведения массового ИЬЛ-типирования доноров и низкой процессивностью анализа. Разработка и внедрение отечественного продукта с высокими технико-экономическими показателями представляется крайне актуальной задачей.

Цель работы. Разработка и верификация тест-системы для высокопроизводительного

HLA-типирования локусов HLA-A,— В,— C,— DRB1,— DQB1 в разрешении 4-digit.

Материалы и методы. Протокол про-боподготовки включал следующие этапы: таргетная амплификация регионов 5 HLA локусов методом Long-Range PCR, ферментативное фрагментирование продуктов ПЦР, лигирование адаптеров, молекулярное бар-кодирование. Секвенирование ДНК библиотек проводилось с использованием оборудования Illumina MiSeq System. Анализ данных выполняли с использованием 3 алгоритмов, многоуровневой оценкой качества и последующим объединением результатов согласно разработанным правилам. Идентификация HLA аллелей осуществлялась с использованием базы данных IMGT/HLA (версия 3.28.0).

Верификацию тест-системы осуществляли на контрольной выборке из 93 образцов ДНК с установленными генотипами по локусам HLA-A,— B,— C,— DRB1,— DQB1 с использованием наборов реагентов HLAssure SE SBT Kit и программного обеспечения AccuType. Верификация осуществлялась с применением специально разработанного программного пакета и позволила выполнить оценку свойств тест-системы по долям совпадающих и неоднозначных аллелей. На основании полученных результатов верификации были рассчитаны аналитические свойства тест-системы.

Результаты. Высокоспецифичные прайме-ры позволяют покрывать весь ген для локусов HLA-A,— B и -C (за исключением части 3'-

UTR), 5'-иТ^ 1-4 экзоны для локуса DQB1, 2-4 экзоны для локуса DRB1.

Вся процедура пробоподготовки может быть выполнена одновременно для 96 образцов и занимает 2,5 рабочих дня. После измерения концентрации и пулирования барко-дированных библиотек, образец загружается в секвенатор для проведения парноконцево-го секвенирования продолжительностью 24 часа.

Анализ данных проводится полностью в автоматизированном режиме. Для 96 образцов общая продолжительность биоинформа-тической обработки — до 6 часов.

Таким образом, общая производительность системы позволяет провести геноти-пирование 5 ИЬА-локусов в высоком разрешении для 10 000 образцов в год силами 2-3 человек.

В ходе верификации были определены чувствительность и специфичность тест-

системы по каждому из ИЬА-локусов — для А, В они составили 1.0 и 1.0 соответственно, для локуса С — 1.0 и 0.99, для локуса DRB1 - 0.98 и 0.99, для локуса DQB1 - 0.98 и 0.93.

Создан комплект технологической документации для организации производства разработанной тест-системы на территории Российской Федерации.

Выводы.

1. Разработана тест-система для проведения высокопроизводительного ИЬА-типирования локусов ИЬА-А,— В,— С,— DRB1,— DQB1 с разрешением

2. Тест-система верифицирована на выборке из 93 образцов, определены аналитические характеристики.

3. Созданы условия для организации производства и внедрения в практику отечественной тест-системы для высокопроизводительного ИЬА-типирования.

Назарова Е. Л., Минаева Н. В., Зорина Н. А., Хоробрых М. Н., Сухорукова Э. Е., Шардаков В. И., Парамонов И. В.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства», Киров

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ТРАНСПЛАНТАЦИИ АУТОЛОГИЧНЫХ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПРИ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМЕ

Введение. Успехи, достигнутые в лечении множественной миеломы (ММ) в последние годы, связаны с использованием высокодозных режимов терапии с последующей трансплантацией аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (ау-тоТГСК). Это увеличило как общую (ОВ), так и безрецидивную выживаемость пациентов с ММ, а также улучшило качество их жизни. В большинстве случаев в раннем посттрансплантационном периоде наблюдаются токсические и инфекционные осложнения различной степени тяжести, зачастую негативно влияющие на показатели выживаемости и требующие ресурсоемкой сопроводительной терапии.

Цель. Оценить влияние полиморфизма генов иммунного ответа на результат индукционной терапии и особенности течения посттрансплантационного периода у больных ММ после высокодозного лечения и аутоТГСК.

Материалы и методы. Исследования проведены у 20 больных ММ: 8 мужчин и 12 женщин с медианой возраста 51,5 г. (диапазон 32 - 67 лет), которым выполнена аутоТГСК после режима кондиционирования с использованием высоких доз мелфалана (200 мг/ м2). В постиндукционном периоде у 7 больных отмечена частичная ремиссия (ЧР), у 9 — очень хорошая частичная ремиссия (ОХЧР) и у 4 — полный ответ (ПО). У половины пациентов (п=10) после ауто-ТГСК выявлено раннее восстановление (в пределах первых 13 суток; 11 - 13 суток) числа лейкоцитов >1000 клеток/мкл. У остальных период агранулоци-тоза занимал свыше двух недель (>14 суток; 14 - 19 суток). Независимо от продолжительности периода нейтропении, у всех больных после ауто-ТГСК отмечалось развитие муко-зитов различной степени тяжести. Степень их выраженности оценивали на основании критериев СТСАЕ, 2009. У 7 больных поражение

слизистых оболочек соответствовало 0-I степеням, у 13 — II - III степеням токсичности. В периоде агранулоцитоза у 11 из 20 пациентов наблюдались клинически и микробиологически подтвержденные инфекционные осложнения. Из них, в 5 случаях — бактериальные стоматиты, эзофагиты, энтеропатии (E. faecium, E. faecalis, S. viridans Р. aeruginosa,); в 4 — вирусные пневмонии, гепатиты, поражения кожи и слизистых оболочек (CMV, HBV, HCV, H. simplex, H. zoster). У 2 пациентов установлен инвазивный аспергиллез легких (КТ-признаки, галактоманнан Aspergillis+). Геноти-пирование 21 полиморфного участка 15 генов иммунного ответа (TLR2 (Arg753Gln); TLR3 (Phe421Ile); TLR4 (Asp299Gln), (Thr399Ile); TLR6 (Ser249Pro); TLR9 (T-1237C), (A2848G); ILlß (T-31C), (T-511C), (G-1473C), (C-3953T); IL2 (T-330G); IL4 (C-589T); IL6 (C-174G); IL10 (C-819), (G-1082A); IL17A (G-197A); CD14 (C-159T); TNFa (G-308A); FCGR2A (His166Arg); TGF (G-915C)) проводили методом ПЦР с аллель-специфичными праймерами до начала режима кондиционирования. Статистический анализ осуществляли методами вариационной статистики с уровнем достоверной значимости результатов p < 0,05.

Результаты. Группа пациентов с ОХЧР отличалась от группы больных с ПО после проведения индукционной терапии отсутствием мутантных гомозигот гена IL10 - 1082 (р=0,02), а от группы с ЧР — мутантных гомо-

зигот гена TLR6 (р=0,03). Более длительный период нейтропении после аутоТГСК ассоциирован с наличием в генотипе в гомозиготном состоянии аллеля дикого типа гена IL17A (р=0,03) и с преобладанием в гетерозиготном состоянии мутантного аллеля гена IL1ß-31 (р=0,04). Группу пациентов с мукози-том II — III степеней от группы больных с му-козитом более легких степеней тяжести (0 — I) отличало полное отсутствие мутантных гомозигот гена IL1ß-1473 (р=0,01) и меньшее число носителей гетеро- и гомозиготных гаплотипов с мутантным аллелем гена IL10 -819 (р=0,01). Осложнения бактериальной этиологии (в сравнении с вирусными инфекциями) коррелировали с наличием гомозигот дикого типа гена IL1ß-1473 (р=0.03) и мутантных гомозигот гена IL17A (р=0.03). Обследованных с инвазивным аспергилле-зом легких от пациентов с вирусными осложнениями отличало полное отсутствие носи-тельства аллеля дикого типа в гомозиготном состоянии гена TNF (р=0.01).

Выводы. Полученные нами данные указывают на вклад генов иммунного ответа в формирование полноты ответа на индукционную терапию, скорость восстановления гемопо-эза, тяжесть течения мукозитов и в реализацию противоинфекционного иммунитета у больных ММ после аутоТГСК, что позволяет формировать персонифицированную тактику их ведения.

Полякова А. П., Белянская Ю. В., Волкова О. Я.

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Санкт-Петербург

ПРИМЕНЕНИЕ НАБОРОВ ALLELESEQR (ОЕШХ, НИДЕРЛАНДЫ) ДЛЯ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ГЕНОВ ^А НА СЕКВЕНАТОРЕ «НАНОФОР05» (РОССИЯ)

Введение. Секвенирование генов HLA (Human Leucocyte Antigens) является необходимым условием подбора совместимого донора для аллогенной трансплантации гемопоэ-тических стволовых клеток. Секвенирование по методу Сэнгера до сих пор остается «золотым стандартом» высокоразрешающего ти-пирования генов HLA. Существуют две разновидности этого метода, отличающиеся между собой первым этапом амплификации иско-

мого участка геномной ДНК: моноаллельное и биаллельное секвенирование.

Генетический анализатор «Нанофор-05», разработанный в Институте аналитического приборостроения Российской академии наук (ИАП РАН, Россия), является первым отечественным прибором для секвенирования ДНК по методу Сэнгера. По своим техническим характеристикам он аналогичен анализатору ABI3500 (Applied Biosystems, США),

КОНФЕРЕНЦИЯ С МЕЖДУНАРОДНЫМ УЧАСТИЕМ Санкт-Петербург

«АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ИММУНОГЕНЕТИКИ И ТКАНЕВОГО ТИПИРОВАНИЯ» 30-31 мая 2018 г.

который широко применяется в клинической практике для секвенирования генов HLA.

Целью настоящего исследования была оценка возможности использования наборов реагентов AlleleSEQR (GenDX, Нидерланды) для секвенирования генов HLA на платформе генетического анализатора «Нанофор-05» (ИАП РАН, Россия).

Материалы и методы. Валидация методики секвенирования на генетическом анализаторе «Нанофор-05» с использованием наборов реагентов AlleleSEQR (GenDX, Нидерланды) проводилась на 4 клинических и 4 контрольных образца ДНК с известными HLA-генотипами. Контрольные образцы ДНК были получены лабораторией для прохождения международного контроля качества в 2016 году. Клинические образцы представляли собой ДНК из периферической крови пациентов гематологических отделений, выделенную ручным методом с использованием реагентов QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Германия). Типирование контрольных образцов выполнялось по генам HLA-A и -DQB1, клинических образцов — по гену HLA-C. В качестве референсной методики высокоразрешающего типирования генов HLA использовалась стандартизованная и ранее применяемая в лаборатории методика моноаллельного секвенирования реагентами S4 Protrans (Protrans, Германия). Анализ полученных результатов выполнялся с помощью программного обеспечения Sequencing Analysis, версия 5.3.1 (Applied Biosystems, США) и SBTengine, версия 3.17.0 (GenDX, Нидерланды).

Результаты. Выполнено типирование генов ИЬА в клинических и контрольных образцах ДНК с использованием реагентов AlleleSEQR (GenDX, Нидерланды) для би-аллельного секвенирования и реагентов Рго^апз S4 (Рго^апз, Германия) для моноал-лельного секвенирования по стандартизованной в лаборатории методике. Проведенное исследование показало полное соответствие наших результатов высокоразрешающего типирования, полученных с применением двух методик секвенирования, а также результатов ИЬА-типирования референсной лаборатории-организатора международного контроля качества. Валидированная нами методика секвенирования была внедрена в рутинную лабораторную практику и использована для исследования образцов ДНК, полученных от пациентов онкогематологи-ческих отделений и их потенциальных доноров. Высокоразрешающее типирование генов ИЬА с использованием реагентов AlleleSEQR (GenDX, Нидерланды) было выполнено у 11 человек.

Выводы. Наборы реагентов AlleleSEQR (GenDX, Нидерланды) для секвенирования генов ИЬА совместимы с генетическим анализатором «Нанофор-05» (ИАП РАН, Россия). Использование данных наборов реагентов позволяет получать точные и достоверные результаты высокоразрешающего типирова-ния генов ИЬА, сопоставимые с результатами моноаллельного секвенирования.

Рамильева И. Р., Буркитбаев Ж. К., Абдрахманова С. А. Турганбекова А. А.

Научно-производственный центр трансфузиологии Министерство здравоохранения Республики Казахстан, г. Астана

ХАРАКТЕР РАСПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ ИЬА У ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ДОНОРОВ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, ПРОЖИВАЮЩИХ В РЕСПУБЛИКЕ КАЗАХСТАН

Актуальность. Одним из первых шагов для развития трансплантации гемопоэтических свтоловых клеток (ТКСГ) в Казахстане было включение в Государственную программу развития здравоохранения Республики Казахстан на 2011-2016 годы «Саламатты Казахстан» положения о необходимости внедрения ТГСК и молекулярного метода типирования системы Human Leukocyte Antigens (HLA).

Несколько крупномасштабных исследований показали, что полное совпадение между донором и реципиентом по антигенам системы ИЬА способствует улучшению общей выживаемости трансплантата, уменьшению частоты и тяжести острой и хронической болезни «трансплантат против хозяина».

Цель исследования. Целью исследования является изучение распределения генетиче-

ского полиморфизма антигенов гистосовме-стимости у здоровых лиц, проживающих в Республике Казахстан.

Материалы и методы. Изучили частоту встречаемости HLA-антигенов I-класса и II-класса у здоровых лиц, проживающих в Казахстане. Обследовали 3646 потенциальных доноров гемопоэтических стволовых клеток. Средний возраст донора составил 41 год (диапазон от 18 до 64 лет). Распределение по половому признаку среди доноров: лица мужского пола — 2161 (59%) и женского пола —1485 (41%).

Препараты ДНК для проведения HLA-типирования были получены из свежей цельной крови (антикоагулянт — ЭДТА) методом колоночной фильтрации с использованием наборов реагентов PROTRANS DNA Box 500 Fast DNA. Концентрация препаратов ДНК, определенная на спектрофотометре UV-vis NanoDrop 2000 (Канада), составляла 25-40 нг/мкл при соотношении А260/А280 = 1,75 - 1,95. Образцы крови HLA-A, B, С, DRB1, DQB1 локусов определяли молекулярно-гене-тическим методом на высоком разрешении на наборах Рго^^ ^rottans, Германия).

Результаты исследования. Проведенный анализ выявил характерный профиль распределения специфичностей системы HLA в казахстанской популяции.

При изучении особенностей распределения HLA-А отмечено, что антиген А*02 встречается в 49,8 % (данный антиген часто встречается в странах Европы, Северной, Южной и центральной Америки), А*24 был определен в 28,6 % случаев (отмечается в Северной и Юго-Восточной Азии), антиген А*03 был обнаружен у 19,4% потенциальных доноров, А*11 —у 14,4%.

В локусе В наиболее распространенными антигенами в нашей популяции явились В*35 (20 %), *40 (15,8 %), *07 (14,4 %), *44 (14,3 %),

*51 (14,1%), *13 (14%). При этом в других странах мира наиболее распространенными антигенами локуса В были другие виды.

Самым часто встречающимся в локусе С среди проживающих в Казахстане стал С*07 (37,9 %). При этом данный антиген преобладает в странах Европы. Также в казахстанской популяции часто обнаруживаются С*03 (29,5 %), *06 (26,1 %), *04 (19,2 %), *12 (18,9%).

По ИЬА II классу в локусах DRB1, наиболее часто встречающимися оказались DRB1*04 (26,7%), *07 (24,7%), *15 (23,9%). В локусе DQB1 наиболее часто встречались в нашем исследовании DQB1*06 (43,5 %), *02 (37,5 %). При этом, по данным allelefrequencies.net, HLA-DQB1*03 встречается у 64,8 % доноров в странах Европы, в Северо-Восточной, Юго-Восточной и Западной Азии.

Также следует отметить, что в ходе нашего исследования не были обнаружены антигены ИЬА-А*36; ИЬА-В*42, *59, *78, *81, *82, *83.

Заключение. Результаты нашего исследования показали, что среди населения Казахстана характерно определенное распределение антигенов. Относительно высокая частота встречаемости выявлена для следующих антигенов: ИЬА-А*02; А*03, *11, *24; ИЬА-В*07, *13, *15, *35, *40, *44, *51; ИЬА-С *03, *04, *06, *07, *12; ИLA-DRB1 *04, *07, *15; ИЬА^В1*02, *03, *06.

Проводимое в рамках создания Регистра потенциальных доноров ГСК ИЬА-типирование народов, проживающих на территории Казахстана, дает возможность полностью охарактеризовать популяцию по лейкоцитарным антигенам. Данная антигенная характеристика популяции имеет большое значение для прогноза вероятности нахождения неродственного донора внутри страны и развития трансплантации ГСК в Республике Казахстан.

Рисинская Н. В., Чабаева Ю. А., Судариков А. Б., Куликов С. М.

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва

ВАРИАНТЫ КОРРЕКЦИИ ЗАВЫШЕННЫХ ИЛИ ЗАНИЖЕННЫХ ЗНАЧЕНИЙ ХИМЕРИЗМА, РАССЧИТАНННЫХ ПО РАЗНЫМ ЛОКУСАМ КОРОТКИХ ТАНДЕМНЫХ ПОВТОРОВ

Введение. Анализ профилей коротких тандемных повторов для вычисления доли ДНК донора и реципиента после трансплан-

тации костного мозга остаётся «золотым» стандартом мониторинга химеризма. Метод характеризуется высокой воспроизводимо-

стью, достаточной чувствительностью для выявления более 1 % минорной ДНК в образце, однако точность метода колеблется в зависимости от выбора маркеров химериз-ма. Известно, что эффективность амплификации в полимеразной цепной реакции разных аллелей гетерозиготного локуса может не совпадать. Если мы выбираем в качестве информативного маркера менее эффективно амплифицируемый аллель реципиента и соотносим его с более эффективно ампли-фицируемым аллелем донора, рассчитанный по этим маркерам результат оказывается сильно заниженным. В обратной ситуации — более эффективно амплифицируемый аллель реципиента и менее эффективно амплифи-цируемый аллель донора — результат будет завышен. Поэтому доля ДНК реципиента, вычисляемая в одном образце по разным маркерам, может флуктуировать в диапазоне 10 % и даже выше. Ещё одна причина завышения значений химеризма — совпадение маркера реципиента со статтер-пиком маркера донора. Такие маркеры принято не брать в расчет, однако в случае трансплантации от близкого родственника, когда выбор маркеров химе-ризма ограничен, других вариантов может просто не быть.

Цель. Исследование «поведения» гетерозиготных аллелей и пар статтер/маркер во времени для последующей коррекции завышенных и заниженных значений химеризма.

Материалы и методы. Был проведен ретроспективный анализ архивных файлов профилей коротких тандемных повторов пациентов с сохраняющимся полным донорским химеризмом после трансплантации костного мозга, проведенной в НМИЦ гематологии. Исследовано соотношение эффек-тивностей амплификации (соотношение высот пиков) для 14 гетерозиготных локусов (п=5 D12S391, п=3 D10S1248, п=2 D1S1656, п=2 SE33, п=1 уШЛ, п=1 D16S529) у 11 пациентов в нескольких временных точках (от 5 до 14 в зависимости от времени наблюдения за пациентом после ТКМ) для каждого. Разница в длине амплифицируемых фрагментов была более 8 пар нуклеотидов, что исключало возможное перекрытие со статтер-пиками друг друга. Кроме того, было исследовано соотношение высот пиков для 40 пар статтер/ пик-хозяин в линейках образцов донор/пациент после ТКМ (для пациента от 5 до 14 вре-

менных точек при условии подтвержденного полного донорского химеризма).

Результаты. Для гетерозиготных локусов было показано, что соотношение эффективности ПЦР сохраняется во времени, и ампли-фикат более короткого аллеля составляет от 54 до 62 % от общего ПЦР продукта для данного локуса. Значит, можно ввести поправочный коэффициент для используемого в калькуляции химеризма маркера, учитывающий эффективность амплификации (к=высота пика более короткого амплифика-та/высота пика длинного амплификата). Для пар статтер/маркер-хозяин отношение стат-тера к суммарному сигналу статтера и информативного маркера сохраняется в воспроизводимых условиях проведения ПЦР. Причем информативный маркер может быть как основным пиком для этого статтера, так и реципрокным пиком в случае гетерозиго-ты. Для 11 из исследуемых маркеров, сопровождаемых статтерами, у 9 пациентов было проанализировано также по 8 параллельных проб в последней временной точке. Средние значения доли статтеров и стандартные отклонения в параллельных пробах были близки к этим же параметрам для доли статтера в разных временных точках, т. е. флуктуации доли статтера во времени сопоставимы с ошибкой измерения. Вероятно, отношение высоты статтера к сумме высот статтера и основного пика является индивидуальной константой для каждого выбранного маркера химеризма. Определив долю статтера по образцу ДНК донора, можно использовать маркеры со статтерами для калькуляции хи-меризма. Нами было показано, что при вычитании доли статтера из рассчитанного значения химеризма результат занижается незначительно, но более корректно использовать формулу R=(A-stutter):(1-stutter), где R — истинное значение химеризма, А — химе-ризм до учета доли статтера, stutter — доля статтер-пика в общем сигнале.

Выводы. используя сохраняющееся во времени соотношение эффективности ПЦР двух аллелей в гетерозиготе, а так же константный характер доли статтер-пиков, можно вводить корректирующие поправки для более точного расчёта химеризма.

Благодарности. работа поддержана грантом РФФИ 18-015-00399.

Семенов Г. В.

Государственное учреждение «Республиканский научно-практический центр трансфузиологии и медицинских биотехнологий», г. Минск, Республика Беларусь

ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПРЕДПОСЫЛКИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ДОНОРСКОГО РЕГИСТРА РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ С РЕГИСТРАМИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

И РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

Введение. Трансплантация гемопоэти-ческих стволовых клеток входит в арсенал специализированной помощи при онкоге-матологических, иммунологических и других заболеваниях. Однако родственный совместимый донор обнаруживается только у 30 % пациентов, нуждающихся в этом виде лечения. Для 70 % пациентов требуется поиск неродственного ИЬА-совместимого донора, который осуществляется в национальных и международных регистрах ИЬА-типированных доноров. В Республике Беларусь банк ИЬА-типированных в учреждениях службы крови доноров ГСК насчитывает около 34000. Недостаточная численность реестра доноров приводит необходимости взаимодействия с аналогичными регистрами, и первую очередь стран СНГ. Однако следует учитывать, что генетические различия между представителями разных этнических групп населения могут отразиться и на частоте встречаемости ИЬА-параметров.

Цель исследования. Изучить полиморфизм генов ИЬА II класса среди потенциальных доноров регистров Беларуси, России и Казахстана.

Материалы и методы. Определение генов II класса системы ИЬА локуса DRB1* методами молекулярно-генетического ти-пирования. Технология с использованием метода обратной гибридизации с олигону-клеотидными зондами (PCR-SSO) позволяет проводить скрининговое ИЬА генотипирова-ние в автоматическом режиме. Генотипирова-

ние образцов крови потенциальных доноров гемопоэтических клеток проводится на платформе «BeeBlot, AutoRELI 48» реагентами «FUJIREBIO», Бельгия для локуса HLA-DRB1* с уровнем разрешения от «низкого» к «среднему». Интерпретация результатов и управление системой обеспечивается сканирующим устройством RELI-Scan и компьютерной программой LIRAS. При неоднозначных результатах генотипирования проводится подтверждающее типирование по технологии PCR-SSP с использованием аллель-специфических праймеров. В работе использовались наборы «OLERUP», Швеция c лиофилизиро-ванными праймерными смесями «низкого» и «высокого» разрешения.

Результаты. Результаты проведенного им-муногенетического анализа свидетельствуют о том, что во всех представленных регистрах встречаются с различной частотой все гены локуса HLA DRB1*. В Казахском регистре по сравнению с Белорусским и Российским у доноров превалируют гены DRB1* 09, 10, 12 и достоверно увеличен DRB1*14 при заметном снижении DRB1* 16.

Выводы. Близкие значения большинства генов локуса DRB1* в рассматриваемых регистрах создают предпосылки взаимодействия (объединения) регистров России, Беларуси и Казахстана. Вышеуказанные различия позволят в ряде случаев, касающихся редких генов, проводить взаимодополнение для более эффективного поиска совместимого по системе HLA донора.

Семенова Н. Ю.1, Бессмельцев С. С.1, Грицаев С. В.1, Енукашвили Н. И.2, Ругаль В. И.

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства», Санкт-Петербург

2 Покровский банк стволовых клеток, Санкт-Петербург

РОЛЬ ГЕМОПОЭТИЧЕСКОИ НИШИ В ПРИЖИВЛЕНИИ ГСК ПРИ АУТОЛОГИЧНОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ

Введение. Множественная миелома (ММ) — заболевание, обусловленное злокачественной трансформацией В-лимфопоэза, при котором происходит развитие клона ми-еломных клеток, пролиферирующих в интра-медуллярных пространствах костной ткани. Наряду с характерными для гемобластозов чертами ММ имеет ключевые отличительные особенности — длительная локализация пролиферирующих миеломных клеток в костномозговых пространствах без выхода в циркуляцию, и выраженные нарушения остеогенеза. Несмотря на развитие различных методов лечения множественной мие-ломы, излечения не происходит, что связано с разными факторами, в том числе, с гетерогенностью микроокружения костного мозга. Один из наиболее эффективных методов лечения у больных ММ — аутологичная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (АутоТГСК), позволяет существенно уменьшить объем клеток патологического клона и повысить качество ответа. Тем не менее, остаются группы пациентов с неэффективной АутоТГСК, которая проявляется неудачной мобилизацией или ранним рецидивом после процедуры. Успех АутоТГСК зависит от многих причин, среди которых важную роль играет состояние ниши ГСК, поврежденной как вследствие основного заболевания, так и подвергшейся токсическому воздействию агрессивного лечения.

Цель. Оценить морфофункциональные особенности основных стромальных компонентов ниши гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) у пациентов с ММ и неэффективной АутоТГСК.

Материал и методы. Материал исследований — трепанобиоптаты подвздошной кости 12 больных с прогрессирующей ММ (5 мужчин и 7 женщин) в возрасте 52 - 68 лет (медиана 57 лет). У 7 пациентов неэффективная мобилизация ГСК, у 5 — ранний рецидив после АутоТГСК. У 5 пациентов были выделены мезенхимальные стромальные клетки (МСК).

В работе использовались гистологические, иммуногистохимические, культуральные методы исследования. Контрольную группу составили 5 доноров КМ.

Результаты. При гистологическом исследовании в костном мозге (КМ) больных ММ обнаруживалась неоднородная клеточная инфильтрация миеломными клетками: очаговая (2 случая), интерстициальная 5-10% поражения (4 случая) и 20-30 % поражения (4 случая), диффузная (2 случая). В половине случаев (6 пациентов) объем поражения КМ не превышал 10%. Однако соотношение ни-шеобразующих элементов было отличным от таковых в КМ здоровых доноров. У всех пациентов отмечалось увеличение количества микрососудов, особенно в субэндосталь-ной зоне 15,2±2,8 % по сравнению с 9,1±1,2 % в контрольной группе (р < 0,05). На эндосте отмечается увеличение количества клеток на единицу длины костной трабекулы 2,7±0,5 по сравнению с 1,4±0,2 в контроле (р<0,05). Также в субэндостальной зоне и вокруг синусов КМ отмечалось усиление экспрессии коллагена IV типа и зоны ярко выраженного ретикулинового склероза.

При культуральных исследованиях МСК КМ больных ММ по сравнению со здоровыми донорами наблюдалась задержка экспоненциальной фазы роста и удлинение лаг-фазы. После лечения только у части больных происходит восстановление кривой роста до показателей доноров. Остеогенно-дифференци-ровочная активность различна у МСК КМ при ММ и не восстанавливается полностью после АутоТГСК. Отмечалось усиление экспрессии маркеров, ассоциированных с миофибробла-стоподобным фенотипом и старением (гладко-мышечный актин, р-галактозидаза). После лечения р-галактозидаза синтезируется слабее, чем до лечения., в то время как МСК КМ здоровых доноров КМ данный фермент практически не синтезируют. Был исследован цитокиновый профиль при сокультивирова-нии культур МСК от пациентов с миеломной

1

культурой RPMI-8226. МСК КМ пациентов после лечения существенно отличаются от МСК здоровых доноров и пациентов с ММ по реакции на присутствие миеломных клеток. МСК КМ после лечения активно синтезируют IL-10 и IFN-y по сравнению с МСК КМ при ММ и МСК КМ здоровых доноров. При сокульти-вировании с ММ МСК КМ леченых пациентов снижается синтез IFN-y и TNF, вырастает выработка IL-10, а уровень синтеза VEGF практически не меняется.

Выводы. Таким образом, было показано, что культуры МСК и нишеформирующие элементы КМ пациентов с ММ обладают чертами

опухоль-ассоциированного микроокружения, несмотря на проведенное лечение основного заболевания. В данном исследовании показано, что ниша ГСК в КМ у больных с ММ отличается от таковой у здоровых доноров КМ. Морфофункциональные особенности основных элементов ниши КМ могут быть причиной нарушений в регуляции развития ГСК и их приживления при АутоТГСК.

Работа поддержана Грантом Президента Российской федерации для государственной поддержки молодых российских ученых № МК-6706.2018.7.

Старшинова А. А.12, Овчинникова Ю. Э.1, Беркос А. С.3, Соколова Ю. В.3, Бубнова Л. Н.3, Яблонскии П. К.12

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации

2 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный университет

3 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства»

ВЫЯВЛЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ ИЬА^Б1 И ИЬАОКБ1 У ДЕТЕЙ С ГЕНЕРАЛИЗОВАННЫМИ ФОРМАМИ ТУБЕРКУЛЕЗА

Введение. Развитие инфекционного процесса определяется не только свойствами возбудителя, но и способностью макроорганизма формировать адекватный иммунный ответ, что в свою очередь обусловлено имму-ногенетическими особенностями организма. В настоящее время установлена важная роль генетической предрасположенности индивидуума к развитию различных заболеваний, в том числе и инфекционных. Изучение особенностей распределения антигенов ИЬА-DRB1 и DQB1 может выявить аллели, ассоциированные с развитием генерализованных форм туберкулеза у детей, что послужило основанием для настоящего исследования.

Цель исследования. выявить особенности распределения антигенов HLA-DRB1 и DQB1 у детей с генерализованным формами туберкулеза.

Материалы и методы. В клинике ФГБУ «СПб НИИФ» Минздрава РФ (отделение детской хирургии костно-суставного туберкулеза у детей и подростков) и в ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России с 2008 по 2015 гг. обследовано 40 детей в возрасте от 1 года до 15 лет с генерализованным туберкулезом. Группа по-

пуляционного контроля для сравнения результатов HLA - типирования представлена 100 здоровыми жителями Северо-западного региона России (доноры крови).

Всем детям проведен стандартный комплекс фтизиатрического обследования с включением иммунологических (проба Манту с 2 ТЕ и проба с аллергеном туберкулёзным рекомбинантным), иммуногенети-ческих, лучевых (выполняли компьютерную томографию органов грудной клетки и костно-суставного аппарата на многосре-зовом спиральном компьютерном томографе «Aquilion-32» (фирма Toshiba) по стандартной методике) и лабораторных методов (исследование респираторного материала: промывные воды бронхов, мокрота, смывы из бронхов, и операционного материала с использованием бактериоскопии, посева на плотные питательные среды Левенштей-на-Йенсена, Финна 2, посева на жидкую питательную среду BACTEC MGIT 960, и метода ПЦР в реальном времени с использованием системы амплитуд - RW — производитель «Синтол», Россия) для выявления микобакте-рий туберкулёза.

Определение антигенов DQB1 и DRB1 на уровне базового разрешения проводилось в Республиканском центре иммунологического типирования тканей (EFI аккредитованная лаборатория) методом PCR SSP с использованием коммерческих наборов сиквенс-спец-ифических праймеров. Визуализация продуктов, полученных в результате полимеразной цепной реакции, проводилась посредством электрофореза в горизонтальном агарозном геле.

Проведен анализ материала с применением методов параметрической и непараметрической статистики, а также расчет показателей: величины относительного риска (RR), превентивной фракции (PF), достоверность различий между группами оценивалась с помощью критерия Хи-квадрат.

Результаты и их обсуждение. В фенотипе пациентов по сравнению с контролем выявлены достоверные различия в частоте встречаемости отдельных сочетаний генов. Увеличение частоты внутрилокусного соче-

Санкт-Петербург 30-31 мая 2018 г.

тания DRB1*03,*04 и межлокусного сочетания DRB1*03 DQB1*06 среди детей с генерализованной формой туберкулёза свидетельствует о возможной связи данных фенотипов с предрасположенностью к развитию такого течения инфекционного процесса. Установленное достоверное уменьшение частоты сочетаний DRB1*01 DQB1*05 и DRB1*01 DQB1*06 свидетельствует о возможном протективном свойстве данных фенотипов в отношении развития генерализованной формы туберкулёза у детей.

Заключение. Выявленные особенности в распределении антигенов локусов DQB1 и DRB1 позволят осуществлять персонифицированный подход к прогнозу развития генерализованных формы туберкулёза у инфицированных микобактериями туберкулеза детей и проводить более длительное наблюдение пациентов с фенотипической предрасположенностью к развитию тяжелых форм заболевания.

Старшинова А. А.12, Овчинникова Ю. Э.1, Бубнова Л. Н.3, Яблонский П. К.1 2

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации

2 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный университет

3 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства»

ОСОБЕННОСТИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ HLA-DRB1 У ДЕТЕЙ С ГЕНЕРАЛИЗОВАННЫМ ТУБЕРКУЛЕЗОМ И ЛОКАЛЬНЫМИ ФОРМАМИ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Введение. По данным ВОЗ, туберкулезом заболевает более миллиона человек в год, так, в 2014 году впервые заболевание было диагностировано у 9,6 миллионов человек, а 1,5 миллиона умерло от туберкулезной инфекции, в том числе 140 000 детей.

В последние годы отмечается некоторая стабилизация и снижение показателей заболеваемости и смертности от туберкулеза, что приводит к снижению числа впервые выявленных детей с туберкулёзной инфекцией. Показатель заболеваемости туберкулезом детей в возрасте от 0 до 14 лет уменьшился за последние годы на 7,7% (2013 год -14,3; 2014 год —13,2; 2015-12,4, 2016-11,5 на 100 000 детей) (Нечаева О. Б., 2017). Ведущей формой туберкулеза по-прежнему

остается туберкулез внутригрудных лимфатических узлов, который диагностируется в 75 - 76 % случаев. Генерализованные формы заболевания встречаются значительно реже, что обусловлено общим снижением заболеваемости. Внелегочные локализации регистрируются в 4,6 % случаев в зависимости от возрастной группы (от 3,7% — в возрасте от 7 до 14 лет, и до 5,9 % — от 0 до 4 лет), при этом доля их за последние 15-16 лет имеет тенденцию к уменьшению (Шилова М. В., 2015). Как известно, туберкулез — мульти-факториальное заболевание. При взаимодействии организма с М.шЬегси1оз1з происходит активация собственного иммунитета, регуляция которого в значительной степени зависит от ИЬЛ-генотипа. Попытки найти

комбинации HLA генов, ассоциированных с развитием инфекционного процесса у человека, и доказать взаимосвязь изменений иммунного ответа продолжаются на протяжении многих лет. Однако до настоящего времени нет четкого понимания причин возникновения генерализации инфекции у детей.

Цель исследования. выявить особенности распределения антигенов HLA-DRB1 у детей с генерализованным и локальными формами туберкулеза.

Материалы и методы. В клинике ФГБУ «СПб НИИФ» Минздрава РФ (отделение детской хирургии костно-суставного туберкулеза у детей и подростков) и в ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России с 2008 по 2016 гг. обследовано 188 детей в возрасте от 1 года до 14 лет с различными проявлениями туберкулезной инфекции. Группа популяционного контроля для сравнения результатов HLA-типирова-ния представлена 346 здоровыми жителями Северо-западного региона России (доноры крови).

На основании полученных при обследовании данных туберкулез исключили у 90 (47,9 %) детей, Локальная форма заболевания диагностирована у 98 детей (I группа); 51 ребенок (52,1 %) с туберкулезом внутригруд-ных лимфатических узлов (ТВГЛУ); 4 ребенка имели очаговые и инфильтративные изменения в легких с бактериовыделением. Генерализованный туберкулез был выявлен у 44 (44,9 %) пациентов (II группа) с изолированными специфическими поражениями в кост-но-суставном аппарате, а также в сочетании с туберкулезным поражением легких, вну-тригрудных лимфатических узлов, 2 — с туберкулезным менингитом, 2 — с поражением почек, 1 — с абдоминальным туберкулезом.

Всем детям проведен стандартный комплекс фтизиатрического обследования с включением иммунологических, лучевых и лабораторных методов диагностики.

Молекулярно-генетическое типирование аллелей генов HLA-DRB1 выполняли на уровне базового разрешения посредством полиме-разной цепной реакции (PCR-SSP) c панелью сиквенс-специфических праймеров с помощью стандартных коммерческих наборов реагентов PROTRANS Cyclerplate System Protrans HLA-DRB1*, позволяющих определить следующие группы аллелей: HLA DRB1: *01, *03, *04, *07, *08, *09, *10, *11, *12, *13, *14, *15, *16 в Республиканском центре иммунологи-

ческого типирования тканей (EFI аккредитованная лаборатория).

Статистический анализ проводили с применением программы Microsoft Office Word Excel 2007, а также пакета прикладных программ Statistica 6.0 фирмы Stat.Soft. Inc. (США). Проведен анализ материала с применением методов параметрической и непараметрической статистики, а также расчет показателей: величины относительного риска (RR), превентивной фракции (PF), достоверность различий между группами оценивалась с помощью критерия Хи-квадрат.

Результаты и их обсуждение. На основании результатов иммуногенетического обследования двух выделенных групп детей установлены следующие особенности и различия. У больных туберкулезом детей (II группа) достоверно чаще (36,7 %), чем в группе популяционного контроля (21,1 %), встречается HLA-DRB1*04 (х2 = 10,08; р<0,01). Показатель относительного риска (RR = 2,17) и этиологической фракции (EF = 0,19) указывают на предрасполагающую роль этой группы аллелей в развитии туберкулезного процесса. Кроме того, в этой же группе отмечалась редкая встречаемость аллелей HLA-DRB1* 07 (14,3 % против 27,5 %, х2 = 7,15, р < 0,01) и 15* (18,4 % против 28,3 %, х2 = 3,92; р < 0,01) по сравнению с контрольной группой. Показатели *07 (RR=0,44; PF=0,15), также как *15 (RR=0,56; PF=0,12) аллелей HLA-DRB1 ниже 1,0, что подтверждает их протективную роль.

Анализ особенностей распределения специфичностей HLA-DRB1 показал: при сопоставлении частоты встречаемости генов HLA-DRB1 в исследуемых группах установлено достоверное снижение частоты DRB1*01 у детей с генерализованным туберкулезом по сравнению с группой здоровых лиц, что может быть связано в данном случае с его протективными свойствами. Увеличение частоты внутрилокусного сочетания DRB1*03 DRB1*04 среди детей с генерализованной формой туберкулёза свидетельствует о возможной связи данного фенотипа с предрасположенностью к развитию такого течения инфекционного процесса. Следует отметить, что аллели DRB1*03 и DRB1*04 прочно ассоциируются с предрасположенностью к аутоиммунным заболеваниям, в частности, к аутоиммунным эндокринопатиям. Это лишний раз подтверждает ключевую роль иммуноге-

нетических факторов в развитии и характере течения туберкулёза.

Заключение. Полученные данные демонстрируют значимость генетического статуса в развитии туберкулезной инфекции у детей. Наличие в генотипе HLA-DRB1*04 группы ал-

лелей свидетельствует о предрасположенности к развитию туберкулеза у детей, а также значимость особенностей HLA-DRB1, а именно снижение частоты встречаемости группы аллелей DRB1*01, на развитие генерализованной формы туберкулёза у детей.

Трусова Л. М.1, Ключников Д. Ю.1, Вавилов М. Н.2, Суслова Т. А.2, Тюмина О. В.1

1 Государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Самарский областной медицинский центр Династия», Самара

2 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Челябинский государственный университет», Челябинск

ЧАСТОТА ВСТРЕЧАЕМОСТИ ^ААЛЛЕЛЕЙ И ГАПЛОТИПОВ В РУССКОЙ ПОПУЛЯЦИИ САМАРСКОЙ И ЧЕЛЯБИНСКОЙ ОБЛАСТЕЙ

Введение. Российская Федерация является одним из самых многонациональных государств мира — представители 190 национальностей проживают на территории страны. Самый многочисленный народ — русские, их численность составляет 111016 896 человек или 77,71 % в доле населения России. Согласно данным последней переписи населения 2010 года 89,47 % жителей Самарской области и 86,53 % жителей Челябинской области относят себя по этнической принадлежности к русским.

Цель. Целью настоящей работы было сравнение частот встречаемости HLA-аллелей и гаплотипов среди русской популяции Самарской и Челябинской областей.

Материалы и методы. HLA-типирование было проведено с помощью методов SSO и SSP на низком уровне разрешения по локусам A, B и DRB1. Проанализированы результаты HLA-типирования 2795 единиц пуповинной крови, находящихся на хранении в банке ГБУЗ «МЦ Династия» и 591 донора кроветворных клеток регистра ГБУЗ «ЧОСПК». Подсчет частот встречаемости аллелей и гаплотипов проводился с использованием EM алгоритма и программного обеспечения Arlequin v3.5. Родители детей, чья кровь находится на хранении в публичном банке, и потенциальные доноры прошли анкетирование для определения национальности и постоянно проживают на территории Самарской и Челябинской областей.

Результаты. Наиболее частые аллели были одинаковы у обеих популяций. Однако мы нашли существенные отличия в частоте встречаемости Л*02 (27,3% в популяции Самарской области против 30,7 % в популяции Челябинской области), Л*30 (3,3 % против 1,1 %), Л*68 (4,4 % против 2,7 %), B*07 (10,8 % против 13,2%), B*14 (3,0% против 1,9%), B*45 (0,1 % против 0,4 %). В частотах встречаемости аллелей локуса DRB1 существенных отличий выявлено не было. Несмотря на то, что были выявлены некоторые различия в частотах встречаемости аллелей, наиболее частые гаплотипы (а именно, 10 наиболее частых) в обеих популяциях были одинаковы: A*01-B*08-DRB1*03, A*03-B*07-DRB1*15, A*03-B*35-DRB1*01, A*02-B*13-DRB1*07, A*02-B*07-DRB1*15, A*02-B*41-DRB1*13, A*25-B*18-DRB1*15, A*24-B*07-DRB1*15, A*02-B*27-DRB1*01 и A*26-B*38-DRB1*13.

Выводы. Таким образом, в русской популяции Самарской и Челябинской областей были отмечены некоторые различия в частотах встречаемости HLA- аллелей, но, с другой стороны, 10 наиболее частых гаплотипов были одинаковы. Данные о частотах встречаемости аллелей и гаплотипов ^А могут быть использованы в области популяцион-ной генетики, установления ассоциаций с заболеваниями, разработке стратегий для ^Л-типирования и поиска в регистрах доноров кроветворных клеток.

Турганбекова А. А., Буркитбаев Ж. К., Абдрахманова С. А., Рамильева И. Р.

Научно-производственный центр трансфузиологии Министерства здравоохранения Республики Казахстан, г. Астана

УРОВЕНЬ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ ЛЕЙКОЦИТАРНЫМИ АНТИТЕЛАМИ ПАЦИЕНТОВ С ОСТРЫМ ЛЕЙКОЗОМ

Введение. Обеспечение иммунологической безопасности переливания компонентов крови остается важнейшей проблемой трансфузиологии. В ее решении основное значение принадлежит мероприятиям, направленных на предупреждение аллосенсибилизации реципиентов и профилактику посттрансфузи-онных реакций и осложнений.

Цель. Изучить уровень сенсибилизации пациентов, получающих гемотрансфузии тромбоцитов в Казахстане.

Материалы и методы. В Научно-производственном центре трансфузиологии города Астаны было обследовано 23 пациента с гематологическими заболеваниями, получающих гемотрансфузии тромбоцитов, для установления уровня сенсибилизации. Забор крови проводился трижды: в первый день при поступлении пациента в отделение и дважды с интервалом 2 недели. Образцы сывороток пациентов обследовались на наличие лейкоцитарных, направленных на антигены первого класса HLA-системы. Использовали метод проточной цитофлюорометрии на анализаторе LABScan 3D (One Lambda, USA).

Результаты исследования. Обследование сывороток, полученных до проведения трансфузии тромбоцитов, показало наличие лейкоцитарных антител к I классу ИЬА у 14 (61%) пациентов, у 9 (39%) пациентов лейкоцитарных антител не было обнаружено. Мониторинг антител среди 9 пациентов с негативным статусом показало, что у 7 пациентов антитела были обнаружены в сыворотке, полученной через 2 недели от начала гемо-трансфузионной терапии. У 2 пациентов положительный результат был получен по истечении 4 недель. Двух- и четырехнедельный мониторинг антител среди 14 пациентов с положительным статусом показал повышение уровня сенсибилизации.

Выводы. Мониторинг сенсибилизации к антигенам ИЬА 1-класса путем определения антилейкоцитарных антител показал, что многократные переливания тромбоцитов приводят к увеличению процента сенсибилизированных пациентов. Исходя из этого, необходимо переливание тромбоцитов с индивидуальным подбором, учитывая ИЬА-антигены донорских клеток и пациента.

Турганбекова А. А.1, Буркитбаев Ж. К.1, Абдрахманова С. А.1, Рамильева И. Р.1, Оспанова М. Е.1, Нургалиев Д. Ж.2

1 Научно-производственный центр трансфузиологии Министерства здравоохранения Республики Казахстан, г. Астана

2 «Национальный научный центр материнства и детства» корпоративного фонда «University Medical Center», г. Астана

АЛЛОГЕННАЯ НЕРОДСТВЕННАЯ ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В КАЗАХСТАНЕ

Введение. Трнасплантация гемопоэтиче-ских стволовых клеток (ТГСК) является одним из ведущих методов лечения пациентов с рецидивами острых лейкозов и другими онкогематологическими, а также аутоим-муными, наследственными заболеваниями и иммуннодефицитными состояниями. Ежегодно в Казахстане в ТГСК нуждаются около 80 - 100 детей. Только у 25 % пациентов возможно нахождение родственных доноров.

Проведение неродственных трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток в Республике Казахстан стало возможным, благодаря функционированию Национального Регистра потенциальных доноров гемопоэтических стволовых клеток Республики Казахстан.

Цель. Оценка приживления трансплантата от неродственного донора гемопоэтических стволовых клеток у пациента с острым лим-фобластным лейкозом.

Материалы и методы. В Научно-производственном центре трансфузиологии города Астаны для формирования Национального Регистра потенциальных доноров ГСК было обследовано 4310 потенциальных доноров по антигенам пяти локусов HLA-системы HLA-A*, B*, Cw*, DRB1*, DQB1* на высоком разрешении.

Пациенту, 2006 года рождения, с диагнозом острый лимфобластный лейкоз, было проведено типирование на высоком разрешении методом секвенирования по локусам HLA-A*, B*, C*, DRB1*, DQB1*. Секвенирование проводилось в прямом и обратном направлении экзонов 2,3 и 4 для локусов HLA-A*, B* и C*, для локуса DRB1* 2 экзон, для DQB1 ло-куса 2 и 3 экзоны.

Поиск совместимого донора среди родственников не дал положительного результата. При поиске неродственного донора из Национального Регистра потенциальных доноров гемопоэтических стволовых клеток Республики Казахстан, был найден донор с совместимостью из 9/10, с одним mismatch в локусе А.

Учитывая тяжесть состояния пациента, первичную резистентность болезни к химиотерапии, было принято решение о проведении неродственной трансплантации гемопо-этических стволовых клеток.

Было проведено две процедуры получения ГСК из периферической крови донора на аппарате Specrta Optia. При первой процедуре

собрано СD34+ 5,1 х 106/кг, при втором СD34+ 1,7 х 106/кг.

Пациенту был проведен миелоаблатив-ный режим кондиционирования: с 6 дня по 4 день — треосульфан, с 6 дня по 2 день — флю-дарабин, 2 день — мелфалан, 0 день — трансплантация ГСК.

Результаты исследования. На 17 день констатировано приживление донорского костного мозга. Результаты общего анализа крови: лейкоциты 1,02 тыс, гемоглобин 83 г/л, эритроциты 2,84 млн., тромбоциты 50 тыс, нейтрофилы 640 кл/мкл.

На 43 день проведено исследование на молекулярный химеризм и результат показал замещение костного мозга пациента донорским на 99 %. В ОАК лейкоциты 1,92 тыс, гемоглобин 94 г/л, эритроциты 2,98 млн., тромбоциты 60 тыс, нейтрофилы 840кл/мкл. Наблюдалась кожная форма РТПХ легкой степени.

В настоящее время общее состояние пациента удовлетворительное, пациент получает такролимус.

Выводы. Для проведения успешных ал-логенных неродственных трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток необходимо дальнейшее развитие Регистра потенциальных доноров ГСК на высокоразрешающем типировании, что значительно сокращает время и упрощает поиск совместимого донора.

Февралева И. С., Рисинская Н. В., Судариков А. Б.

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва

ВЫЯВЛЕНИЕ ОСНОВНЫХ МАРКЕРОВ ТРОМБОФИЛИИ В ПАРЕ ДОНОР/РЕЦИПИЕНТ ТКМ.

Введение. Процесс восстановления кроветворения у пациентов после трансплантации донорского костного мозга (ТКМ) во многом зависит от генетических особенностей пары донор/реципиент, связанных не только с ^Л совместимостью. Полиморфизмы, являющиеся факторами риска возникновения различных заболеваний, никак не проявляющихся до ТКМ, могут стать причиной серьезных осложнений после нее. Среди этих факторов и полиморфизмы, являющиеся маркерами тромбофилии. Часто

описывают посттрансплантационные тромбозы глубоких вен и тромбоэмболии. Кроме того, после ТКМ могут образовываться микротромбы, которые приводят к развитию различного рода воспалений и инфекций. Выявление генетических факторов риска тромбофилии может иметь значение для прогнозирования таких состояний. Представлены результаты исследования полиморфизмов генов F5 G1691A, MTHFR С677Т, F2 G20210A и PAI-15G(-675)4G в парах донор/реципиент ТКМ.

Цель. Проанализировать значение несовпадения донора и реципиента ТКМ по полиморфным аллелям генов F5, MTHFR, F2 и РА1-1 для развития посттрансплантационных тромботических осложнений.

Материалы и методы. ДНК из образцов крови доноров и реципиентов ТКМ выделяли фенольно-хлороформной экстракцией с последовательным осаждением в изо-пропаноле и этаноле. Полиморфизмы F5 G1691A (гб6025), MTHFR С677Т (гб1801133),

Результаты. Было протестировано 90 пар донор/реципиент. Факторами риска возникновения тромбофилии считали гомо/гетеро-зиготность по полиморфизмам гб6025 в гене F5, гб1799963 в гене F2 и гомозиготность по гб1801133 в гене MTHFR и гб1799889 в гене РА1-1. Были выявлены 4 реципиента и 6 доноров, являющихся гетерозиготами по G1691A, и не являющихся трансплантационными парами, три донора и реципиента, являющихся парой при ТКМ и несущих одновременно гетерозиготную мутацию G1691A, один реципиент и один донор, являющиеся гетерозиго-тами по G20210A, 5 реципиентов и 6 доноров, гомозиготы по С677Т, и 12 реципиентов и 21 донор, гомозиготы по PAI-15G(-675)4G. Анализ историй болезни реципиентов, являющихся гетерозиготами G1691A (мутация Лейдена), показал, что у некоторых из них

F2 G20210A (rs1799963), PAI-1 5G( - 675)4G (rs1799889) определяли с помощью аллель-специфической полимеразной цепной реакции в реальном времени (АС-ПЦР-РВ) в модификации TaqMan на приборе RotorGene (Corbett Research). Пробы и зонды собственного дизайна приведены ниже. Условия реакции: предварительная денатурация при 950-300 сек, затем 45 циклов 630- 50 сек и 950 - 15 сек.

развились тромбозы глубоких вен вскоре после ТКМ. У одной пациентки без мутаций возникла тромбоэмболия легочной артерии вскоре после ТКМ от донора с мутацией G1691A. Причина ТЭЛА не ясна. Известно, что факторы свертывания вырабатываются в основном клетками печени. Однако тромбоци-тарный F5 синтезируется и в мегакариоци-тах и, таким образом, донорский дефектный F5 может играть роль после ТКМ. В любом случае необходимо дальнейшее наблюдение за реципиентами, имеющими маркеры тром-бофилии свои или донорские.

Выводы. Мы полагаем, что для оценки риска посттрансплантационных тромбозов имеет значение генетический анализ полиморфизмов факторов, являющихся риском возникновения тромбофилии, в паре донор/ реципиент.

FV WC-F 5'caaggacaaaatacctgtattccac3' PA I 5G-F 5'agtctggacacgtgggtg3'

FV MT-F 5'caaggacaaaatacctgtattccat3' PA I 4G-F 5'agtctggacacgtgggta3'

FV com-R 5'gacatcgcctctgggcta3' PA I R 5'cagccacgtgattgtctagg3'

F2 W-F 5'actgggagcattgaggatc3' MTHFR W-F 5'gagaaggtgtctgcggtagc3'

F2 M-F 5'actgggagcattgaggatt3' MTHFR MT-F 5'gagaaggtgtctgcggtagt3'

F2 R 5'tggaaccaatcccgtgaaag3' MTHFR R 5'tagccctggatgggaaagatc3'

F2 ROX 5' (ROX)gagagtcacttttattgggaaccatag(BHQ2)

FV FAM 5' (FAM)gcctgtccaggg( B H Q1)atctgctcttac3'

MTHFR R&G 5' (R&G)atgcaccgacat(BHQ1)gggcatcacttg3'

PAI_Cy5 5' (Cy5)agccgtgtatca(B H Q3)tcggaggcgg3'

КОНФЕРЕНЦИЯ С МЕЖДУНАРОДНЫМ УЧАСТИЕМ Санкт-Петербург

«АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ИММУНОГЕНЕТИКИ И ТКАНЕВОГО ТИПИРОВАНИЯ» 30-31 мая 2018 г.

Хамаганова Е. Г., Кузьминова Е. П., Абдрахимова А. Р., Чапова Р. С., Чугреева Т. П., Васюков К. В., Гапонова Т. В., Савченко В. Г.

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва

^А-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ДИСТАНЦИИ МЕЖДУ ДОНОРАМИ РЕГИСТРА «НМИЦ ГЕМАТОЛОГИИ», РОССИЙСКИМИ И НЕКОТОРЫМИ ЗАРУБЕЖНЫМИ ПОПУЛЯЦИЯМИ

Введение. Распределение HLA-генов и га-плотипов зависит от расовой и этнической принадлежности. Информация о вариациях HLA-генов в различных популяциях в разных географических регионах способствует успешному поиску донора для трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК).

Цель исследования — провести анализ генетических дистанций (g. d.) по генам HLA-A*,—B*,—DRB1* между донорами регистра «НМИЦ гематологии», российскими и некоторыми зарубежными популяциями, о которых имеются сведения, доступные в открытой печати или в базе данных — http:// www.allelefrequencies.net.

Материалы и методы. В исследование вошли 2230 потенциальных доноров костного мозга (КМ) регистра «НМИЦ гематологии», которые самоопределились как этнически русские. ДНК выделяли из периферической крови, взятой с антикоагулянтом ЭДТА, при помощи станции для выделения ДНК NorDiag Arrow (Norway). HLA-типирование проводили методом гибридизации с олигонуклетид-ными зондами (SSO) — Immucor Transplant Diagnostic, Inc. (USA) на платформе анализатора Luminex 200 по пяти генам HLA-A*,— B*,— C*,— DRB1*,— DQB1*. Частоты групп HLA-аллелей и соответствия наблюдаемого распределения равновесию Харди - Вайн-берга определяли с помощью компьютерной программы Arlequin 3.5 методом максимального правдоподобия при помощи алгоритма максимизации ожидания. Для анализа g. d. использовались данные российских и некоторых зарубежных популяций, которые представлены в базе данных allelefrequencies. net (AF — http://www.allelefrequencies.net) и открытой литературе. Всего привлечены данные по 52 популяциям, включая доноров-москвичей регистра «НМИЦ гематологии», которые самоопределились как русские, доноров «НМИЦ гематологии» — осетин из Вла-

дикавказа и 10 иных российских популяций, исследованных другими коллективами авторами. Критерий включения популяции в анализ — данные минимально по группам аллелей HLA-A*-B*-DRB1* генов, сумма частот гаплотипов по каждому ^Л-гену равная 1. Расчёт генетических расстояний проводили по методу Нея с помощью программы РЬуНр 3.695, как и построение филогенетических деревьев.

Результаты. Доноры-москвичи, самоопределившиеся как русские, близки по частотам групп аллелей HLA-генов к другим популяциям русских и некоторым славянским популяциям. Наиболее приближены к донорам-русским из Москвы самарцы, новосибирцы, русские из Челябинска, и поляки, g.d. <0,1. Несколько дальше отстоят русские из Карелии (g. d.=0,131); Кировской области ^^.=0,136); население Башкортостана — этнически смешанная популяция, состоящая в основном из представителей трёх групп — башкир, русских и татар d.=0,170); население Северо-Западного региона (g. d.=0,198); татары Челябинской области d.=0,24) и Татарстана ^^.=0,338). Наиболее удалёнными по HLA-генам от доноров-москвичей из российских популяций были башкиры Челябинской области (g. d.=1,075), осетины ^^.=1,283) и тувинцы ^^.=1,593). Из включённых в анализ славянских популяций наиболее близки к донорам-москвичам — поляки и словаки (g. d.=0,123), чехи (g. d.=0,143), удалены — хорваты (g. d.=0,230) и сербы ^^.=0,401). Наиболее удалёнными от москвичей европейскими популяциями являлись баски (g. d.=1,66) и саами ^^.=3,012). Наибольшая генетическая дивергенция у доноров-москвичей наблюдалась с аборигенами Австралии и индейцами Северной и Южной Америки d. от 8,204 до 29,519).

На отсутствие значительной дивергенции между популяциями русских указывает взаимное расположение этих популяций

(«листьев») на филогенетическом дереве, а также незначительная длина ветвей, на которых они располагаются. Ветвь, к которой относятся тувинцы, отпочковывается вместе с монгольской ветвью от одного вышележащего узла. Ветвь, на которой располагаются осетины — единственный народ Северного Кавказа, язык которого относится к иранской группе индоевропейской семьи, отпочковывается от одного узла с популяциями Юго-Восточной Европы/Юго-Западной Азии. На своеобразность этой популяции указыва-

ет значительная длина ветви, на которой расположен осетинский «лист».

Выводы. Генетическая дивергенция по ИЬЛ-генам между различными популяциями русских незначительна. Однако российские популяции разного этнического происхождения отличаются существенным ЖЛ-генетическим разнообразием, поэтому необходимо привлекать в российские регистры доноров из различных регионов России с разными этническими составами.

Хамаганова Е. Г., Кузьминова Е. П., Абдрахимова А. Р., Кузьмина Л. А., Паровичникова Е. Н., Савченко В. Г.

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва

ИЬАОРБ1НЕСОВМЕСТИМОСТЬ ПРИ РОДСТВЕННОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ АЛЛОГЕННЫХ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

Введение. Типирование гена ИЬА-0РБ1 не является обязательным при трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) из-за низкой экспрессии ИЬА-ЭР-молекул. Однако между генами ло-куса ИЬА-ЭР и остальными классическими генами ИЬА находится «горячая точка рекомбинации», поэтому совпадение донора и реципиента по 10 из 10 аллелей генов ИЬА-А,—Б,—С,—DRБ1,—DQБ1 не всегда сопровождается совпадением по ИЬА^РБ1. По данным литературы, из-за слабого неравновесного сцепления 1-2% ИЬА-идентичных сиблингов не совпадают по ИЬА^Р. При неродственной алло-ТГСК несовпадение по ИЬА^РБ1 встречается примерно у 80 % пар, совпавшим по ИЬА-А,— Б,— С,— DRB1,— DQB1, при этом два несовпадения по аллелям ИЬА^РБ1 сопровождаются повышением вероятности развития болезни трансплантат-против-хозяина (РТПХ).

Цель исследования — исследовать частоту несовпадений донора и реципиента по гену ИЬА^РБ1 при алло-ТГСК от родственного донора.

Материалы и методы. В исследование вошли 67 больных, которым в отделении ТКМ «НМИЦ гематологии» была выполнена алло-ТГСК от ИЬА-А,— Б,— С,— DRB1,— DQB1-идентичного сиблинга, и их доноры, а также 18 пар больной — потенциальный

HLA-гаплоидентичный родственный донор. ДНК выделяли из 200 мкл крови с антикоагулянтом ЭДТА при помощи станции для выделения ДНК NorDiag Arrow (Norway) в соответствии с рекомендациями производителя. Высокоразрешающее типирование гена HLA-DPB1 проводили методом PCR-SSP (ПЦР с сик-венс-специфическими праймерами) с использованием набора Olerup SSP (Швеция). Каждая пара донор-реципиент была классифицирована, как HLA-DPB1-совместимая, с допустимым несовпадением по HLA-DPB1, и с недопустимым несовпадением, согласно алгоритму (version 2.0), доступному на www. ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/dpb.html.

Результаты. Из 67 пар больной — HLA-идентичный родственный донор расхождение по одному из двух аллелей HLA-DPB1 наблюдалось у двух пар. У первом случае у больного с диагнозом «острый миелоидный лейкоз» алло-ТГСК была выполнена от донора-сестры. У больного на +140 день после алло-ТГСК произошло отторжение трансплантата. При типировании гена HLA-DPB1 выявлено несовпадение больной и донора по одному аллелю этого гена. Расклад HLA-гаплотипов позволил предположить наличие у донора рекомбинантной хромосомы: больная —a) A*03, B*50:01, C*06:02, DRB1*07:01, DQB1*02, DPB1*03:01 / c) A*24:02, B*39:06, C*07:02, DRB1*15:01, DQB1*06:02, DPB1*04:01;

брат —а) Л*03, B*50:01, С*06:02, DRB1*07:01, DQB1*02, DPB1*03:01 / d) Л*26, B*51, С*14, DRB1*11, DQB1*03, DPB1*02:01; сестра-до-нор—а) Л*03, B*50:01, С*06:02, DRB1*07:01, DQB1*02, DPB1*03:01 / с^)? Л*24:02, B*39:06, С*07:02, DRB1*15:01, DQB1*06:02, DPB1*02:01. Во втором случае несовпадения по гену HLA-DPB1 донором больного с диагнозом «хронический миелолейкоз» являлась старшая сестра. У больного на +50 день после алло-ТГСК наблюдалось развитие острой РТПХ. Из-за отсутствия родителей установить природу несовпадения по гену HLA-DPB1 не представлялось возможным.

Из 18 пар больной — потенциальный ^Л-гаплоидентичный родственный донор, ти-пированных по гену HLA-DPB1, 17 пар совпали по одному из двух аллелей этого гена, у 14 пар определялось допустимое несовпадение по второму аллелю ИLЛ-DPB1, у 3 пар — недопустимое. Один потенциальный донор

Санкт-Петербург 30-31 мая 2018 г.

различался с больным по обоим аллелям HLA-DPB1.

Выводы. Хотя типирование гена HLA-DPB1 не входит в стандарты при алло-ТГСК, при селекции HLA-идентичного родственного донора следует учитывать возможное несовпадение больного и донора по этому гену. HLA-DPB1-генотипирование пар реципиент— ^Л-идентичный родственный донор следует выполнять в тех случаях, когда не нужен эффект «трансплантат-против-лей-коза» и надо исключить возможное развитие РТПХ в посттрансплантационном периоде, например, у больных апластическими анемиями или некоторыми наследственными заболеваниями. Также проведение HLA-DPB1-генотипирования может быть показано при селекции ^Л-гаплоидентичного родственного донора для исключения трансплантаций от доноров, несовпадающих с больным по обоим вариантам HLA-DPB1-аллелей.

Чернышов Д. С.1, Кузьминова Е. П.2, Абдрахимова А. Р.2, Чапова Р. С.2, Хамаганова Е. Г.2

1 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Челябинский государственный университет», Челябинск

2 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва

ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПРОФИЛЬ ДОНОРОВ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК РЕГИСТРА ФГБУ «НМИЦ ГЕМАТОЛОГИИ» МИНЗДРАВА РОССИИ, САМООПРЕДЕЛИВШИХСЯ КАК ТАТАРЫ

Введение. Татары в России представлены тремя основными группами: поволжские, сибирские и крымские. Генетические исследования показали, что эти группы не имеют общих предков и их формирование происходило обособленно друг от друга. В Москве татары — третья по численности этническая группа — 149 043(1,4 %).

Цель работы. установить распределение групп ^Л-аллелей и HLA-гаплотипов у потенциальных доноров гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) регистра ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России, самоопределившихся как татары.

Материалы и методы. Проведено HLA-генотипирование у 70 потенциальных доноров ГСК ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России, определивших себя как татары. ДНК для исследования была выделена из 200 мкл крови с антикоагулянтом

ЭДТА с помощью станции для выделения ДНК NorDiagArrow(Norway). HLA-типирование проводили методом SSO, («Immucor Transplant Diagnostic, Inc.», USA) на анализаторе Luminex 200 по 5 локусам HLA-A-B-C-DRB1-DQB1. Частоту групп аллелей HLA-генов, гаплотипов и соответствие наблюдаемого распределения равновесию Харди-Вайнберга определяли с помощью программы Arlequin 3.5. Достоверность различий в частоте встречаемости генов определяли согласно критерию Пирсона. Статистически значимыми считались различия при p < 0,05.

Результаты. У доноров ГСК регистра «НМИЦ гематологии», самоопределившихся как татары, среди групп аллелей HLA-A самыми высокочастотными оказались A*02 (32,14%), А*03 (17,85%), A*24 (10%), А*26 (9,28 %) и А*01 (7,14 %). Выявлена тенденция на статистические различия по группе А*01

между донорами ФГБУ «НМИЦ гематологии» и татарами Челябинской области (ЧО) — 11,8% и Татарстана —10,98% и по группе А*26 между донорами ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России и татарами ЧО — 6,3 % и Татарстана — 4,4 %. В ИЬА-Б самыми высокочастотными являлись группы аллелей В*07 (15%), В*44 (11,4%), В*13 (10,7%), В*35 (9,2 %) и В*15 (5 %). Статистически значимых различий в частотах групп аллелей ИЬА-В между донорами «НМИЦ гематологии» и татарами ЧО и Татарстана не выявлено. В локусе ИЬА-С наиболее высокочастотными были группы С*07 (25,7%), С*06 (17,14%), С*04(13,57 %), С*12(12,14 %) и С*03(10%), что соответствовало данным по Татарстану, кроме значимых различий в частоте встречаемости С*02 - 1,42 % (доноры «НМИЦ гематологии») уб. 6.6 % (Татарстан), данные по ЧО отсутствуют. Среди групп аллелей HLA-DRB1 самыми высокочастотными у доноров «НМИЦ гематологии» оказались группы DRB1*07 (22,8%), DRB1*01 (14,28%), DRB1*15 (14,28%), DRB1*13 (10,71%), что не имеет различий с данными по Татарстану и ЧО. В локусе HLA-DQB1 наиболее высокочастотной группой являлась DQB1*03 (27,8 %), различий между донорами «НМИЦ гематологии» и татарами ЧО нет. Следовательно, различия между донорами «НМИЦ гематологии», которые самоопределились как татары, и татарами ЧО и Татарстана по частотам групп HLA-аллелей незначительны.

Больше различий выявлено между донорами ФГБУ «НМИЦ гематологии», самоопре-

делившимися как татары, и донорами, самоопределившимися как русские. Статистически значимые различия имелись по группам: HLA-B*18, Б*46, Б*58, ИLA-C*02 и С*16. Среди групп аллелей локусов ИLA класса II статистически значимые различия у доноров-татар и доноров-русских были по группам DRB1*09 (5,7 % и 0,9 % соответственно) и DRB1*11 (7,1 % и 13,2 % соответственно).

У доноров «НМИЦ гематологии», самоопределившихся как татары, выявлено 16 пятилокусных ^А-гаплотипов с частотой встречаемости более 1 %, наиболее высокочастотными являлись: А*03-Б*13-С*06^Б1*07^Б1*02 (2,85 %);

А*01-Б*08-С*07^Б1*03^Б1*02(2,14%); А*02-Б*07-С*07^Б1*15^Б1*06 (2,14 %); A*30-Б*13-C*06-DRБ1*07-DQБ1*02 (2,14 %), A*03-Б*07-C*07-DRБ1*13-DQБ1*06 (2,14 %).

Выводы. Доноры ФГБУ «НМИЦ гематологии», самоопределившиеся как татары, по распределению групп ^А-аллелей и ^А-гаплотипов близки к татарам Татарстана и Челябинской области и отличаются от доноров регистра ФГБУ «НМИЦ гематологии», самоопределившихся как русские. Доноры-татары регистра «НМИЦ гематологии» являются представителями группы поволжских татар. Провести более точный анализ распределения групп ^А-аллелей и ^А-гаплотипов у доноров регистра «НМИЦ гематологии», самоопределившихся как татары, позволит увеличение размера их выборки.

Шлегель Н. Ю., Степанов А. А., Каракальчева С. С., Косарев А. Н.

АУ «Югорский научно-исследовательский институт с банком стволовых клеток», Ханты-Мансийск

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ АЛЛЕЛЕЙ ИЬА У ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ДОНОРОВ КОСТНОГО МОЗГА В ХАНТЫ-МАНСИЙСКОМ АВТОНОМНОМ ОКРУГЕ

Введение. Для аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток необходимо наличие HLA-совместимого донора. Даже при наличии кровных родственников вероятность найти ^А-идентичного сиблин-га составляет только 25 %. Остальным пациентам производится поиск неродственных доноров в российских или зарубежных регистрах. Для пациентов, проживающих в наци-

ональных регионах России, успешность поиска может зависеть от наличия в регистрах доноров с уникальными генотипами. С целью увеличения успешности поиска доноров для пациентов Ханты-Мансийского автономного округа был создан региональный регистр. С другой стороны, доноры с редкими генотипами могут быть востребованы для пациентов, проживающих в других регионах России

и заграницей. Поэтому для обеспечения глобального доступа результаты генотипирова-ния вносятся в Национальный регистр доноров костного мозга.

Цель. Исследование особенностей частоты встречаемости ^А-аллелей у потенциальных доноров регистра Ханты-Мансийского автономного округа.

Материалы и методы. Проанализированы результаты ^А-генотипирования 95 образов периферической крови. Образцы получены у кадровых доноров крови Отделения переливания крови Окружной клинической больницы г. Ханты-Мансийска, оформивших согласие стать потенциальными донорами костного мозга. Из 95 потенциальных доноров 43 мужчины и 52 женщины в возрасте от 22 до 55 лет (медиана 33 года). HLA-генотипирование выполнялось методом PCR SSP по трем локусам класса I (HLA-A,— Б,— С) и по двум локусам класса II (HLA-DRB1,— DQB1). Выделение ДНК выполнялось методом колоночной фильтрации реагентами Рго1:гапз (Германия). Концентрация ДНК оценивалась на спектрофотометре. Для амплификации использовали наборы Рго1гапБ (Германия). Разделение продуктов амплификации проводилось методом электрофореза в агарозном геле.

Результаты. В локусе А определились 16 из 21 типируемого варианта гена. Не обнаружены специфичности ^А-А: *36, *43, *69, *74, *89. Часто встречаемый в мире аллельный вариант гена ^А-А*02 также имел самую высокую частоту в настоящем исследовании — 0,258. Вторым по частоте встречаемости в локусе ^А-А у населения, проживающего на территории округа, определен *24 - 0,195. Далее по частоте встречаемости идут специфичности *03-0,142, *01 - 0,1, *25 - 0,042. Высокие частоты данных аллелей типичны для европеоидной популяции. Эти 5 аллель-ных вариантов обнаруживаются в 36,8 % случаев исследованной выборки. Наиболее

редкие варианты *29, *34, *66 имели минимальную частоту — 0,005.

В локусе В определились 25 из 37 типиру-емых вариантов гена. Не обнаружены специфичности ИЬА-В: *13, * 45, *46, *47, *55, *59, *67, *73, *78, *81, *82, *83. Наиболее распространен вариант гена *7, его частота составляет 0,132. Следующими по частоте встречаемости в локусе В являются аллели *35, *13, *18, *40 с частотой соответственно — 0,111, 0,095, 0,079 и 0,068. Наиболее редкие варианты *14, *42, *48, *49, *56 имеют минимальную частоту— 0,0052.

В локусе С с разной частотой обнаружены все исследуемые варианты гена, кроме ^А-С: *18. С частотой 0,258 значительно превалирует вариант ^А-С: *7. Следующими по частоте встречаемости в локусе С являются аллели *6, *12 с одинаковой частотой — 0,142. Наиболее редкие гены локуса HLA-С: *16 и *17 имели частоту 0,005.

В локусе DRB1 с разной частотой обнаружены все 13 исследуемых специфично-стей. С частотой 0,174 превалирует DRB1*15. На втором месте по частоте встречаемости находится ген DRB1*07 - 0,163. По данным литературы достаточно высокая (около 0,20) частота DRB1*07 встречается у представителей Волго-Уральского региона — удмурты (0,231), татары (0,24), представителей центрально-сибирских популяций — буряты (0,26 и 0,13), и центрально-сибирской народности манси (0,17). В настоящем исследовании наиболее редкие гены локуса DRB1: *9, *10, *12, *14 имеют частоту < 0,026.

В локусе DQB1 с разной частотой обнаружены все 5 исследуемых специфичностей. Специфичности *6 и *3 встречались с частотой 0,3, *02 - 0,242, *5 - 0,105, *4 - 0,047.

Вывод. В результате исследования установлены частоты распределения ^А-аллелей у потенциальных доноров костного мозга, проживающих в Ханты-Мансийском автономном округе.

Янкевич Т.1, Трофимов Ю. Д.12, Болдырева М. Н.1, Шубина Е.2, Гольцов А. Ю.2, Алтухова О. С.2, Суслова Т. А.3

1 ООО «НПФ ДНК-ТЕХНОЛОГИЯ»

2 ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В. И. Кулакова МЗ РФ

3 Челябинская областная станция переливания крови

РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ «ИЬАЭКСПЕРТ» ДЛЯ ТИПИРОВАНИЯ ГЕНОВ ИЬА С ВЫСОКИМ РАЗРЕШЕНИЕМ МЕТОДОМ N05. ОПЫТ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ.

Введение. До появления технологий высокопроизводительного секвенирования (англ. Next Generation Sequencing, nGS) HLA-типирование больших массивов образцов с высоким уровнем разрешения для научных исследований или для подбора доноров ге-мопоэтических стволовых клеток было довольно трудоемким, малопроизводительным и дорогостоящим. Появление технологий NGS позволило не только увеличить производительность и скорость прочтения до миллиардов пар оснований, но и существенно снизить стоимость HLA-типирования.

Цель. Разработка системы для типиро-вания HLA-генов с высоким разрешением методом NGS, включая оптимизированную методику приготовления библиотек для последующего высокопроизводительного сек-венирования и программное обеспечение, позволяющее не только обсчитывать результаты секвенирования, но и проследить весь путь образца, начиная с момента регистрации пробы, через все этапы приготовления библиотеки, секвенирования и заканчивая экспортом результатов в различные базы данных.

Материалы и методы. Типирование генов HLA (A, B, C, DRB1, DQB1, DPB1, DRB3/4/5) проводили с использованием праймеров собственного дизайна, собственных реагентов для приготовления библиотек фрагментов ДНК, технологии высокопроизводительного секвенирования Ion Torrent (S5, PGM) и разработанного авторами алгоритма анализа

данных. Всего было проанализировано 580 образцов по 9 генам HLA I и II класса.

Результаты. Были получены следующие результаты типирования:

- 450 образцов из собственных коллекций популяций русских из Архангельска, русских из Вологды, русских из Москвы, удмуртов (здоровый контроль и больные сахарным диабетом 1 типа), предварительно охарактеризованные с помощью наборов реагентов для типирования генов гистосовместимости человека (HLA) II класса методом амплификации ДНК (HLA-ДНК-ТЕХ) с низким разрешением. Результаты совпали.

- 100 образцов доноров первичной крово-дачи Челябинской областной станции переливания крови, также предварительно охарактеризованные с низким разрешением. Результаты совпали.

- 30 образцов External Proficiency Testing СЕТ2015, CET2016, СЕТ2017. По результатам тестирования получены сертификаты.

Выводы. Разработана система «HLA-Эксперт» для типирования генов HLA с высоким разрешением методом NGS. Начата процедура регистрации набора в Росздрав-надзоре. Система «HLA-Эксперт» может быть рекомендована для типирования генов HLA с высоким разрешением для проведения массовых научных исследований и типирования доноров для регистров стволовых клеток.