CC BY
7Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология, химия». Том 25 (64). 2012. № 3. С. 179-186.
УДК 581.131
ВПЛИВ УМОВ М1НЕРАЛЬНОГО ЖИВЛЕННЯ НА ЗМ1НИ
АНТИОКСИДАНТНОГО СТАТУСУ РОСЛИН ОЗИМО1 ПШЕНИЦ
1 ¡2 Сандецька Н.В. , Каменчук О.П. , Ситар О.В.
11нститут фтологИрослин i генетики НацюнальноИ академи наук Украти, Ктв, Украгна 2Кшвський нащональний утверситет 1мет Тараса Шевченка, Кшв, Украгна E-mail: [email protected]
Дослщжено актившсть глютатюнредуктази, глютатюнпероксидази, супероксиддисмутази, вмют малонового диальдепду та SH-груп в 14-добових рослинах пшениц за дй позакоренево! обробки рiзними концентрацiями сульфату та ортофосфату. Виявлено змши у антиоксидантному статуа рослин за позакоренево! обробки мшеральними добривами.
Ключовi слова: озима пшениця, позакореневе тдживлення, SH-групи, глютатюнредуктаза, глютатюнпероксидаза, малоновий диальдепд, супероксиддисмутаза.
ВСТУП
Одним iз ключових завдань землеробства е пiдвищення продуктивност культурних рослин. Тiсна залежнiсть врожайност зернових та iнших сiльськогосподарських культур вщ рiвня застосування мiнеральних добрив доведена багаторiчним досвiдом ведення землеробства [1, 2].
Удосконалення технологiй вирощування, збалансування систем живлення, досягнення високих коефщенпв засвоення елементiв живлення е важливими складовими пiдвищення врожайностi, поряд зi створенням нових сортiв iз високим генетичним потенцiалом продуктивностi [2].
Розробка нових пiдходiв до регулювання i розкриття потенцiалу продуктивност сiльськогосподарських рослин мае стратегiчне значення для рослинництва. Одним iз таких пiдходiв е дослiдження регуляци субстрат-ферментних взаемодш i методи дiагностики ферментативное' активностi рослинно! тканини або органу. В якосп такого показника нами запропоновано дослiдження вмiсту сульфгiдрильних груп, що може мати дiагностичну щншсть при дослiдженнi змiн вмiсту фермент1в прооксидантно-антиоксидантно! системи захисту. Каталiтична роль сульфпдрильних груп ^И-груп), ферментiв добре вщома.
Величини концентрацiй анiонiв - ортофосфату i сульфату в рослинах можуть суттево впливати на кшьюсть 8И-груп. Фосфор в бiльшостi грунт1в свiту мiститься у важкодоступнiй мшеральнш та органiчнiй формi. Його концентращя в грунтовому розчинi зазвичай низька (вщ 2 до 10 мкМ). Вш е одним iз важкодоступних грунтових макроелементiв, який може лiмiтувати врожайнють рослин. Ускладнюе засвоювання фосфору рослинами також низька швидкiсть його дифузи в грунтi:
вона складае всього вщ 10-12 до 10-15 м/с, внаслщок чого прикоренева зона рослин
швидко виснажуеться [3]. Велика частина необхщно! рослинам шрки поглинаеться
2-
корiнням у формi сульфату (SO4 ). Орка включаеться в амiнокислоти цисте!н, цистин i метiонiн, фосфор - в аденозинтрифосфат (АТФ) та iншi аденозинфосфати, що грають ключову роль в енергетичному обмiнi клiтини, а також в фосфолшщи клiтинних мембран та в нуклеlновi кислоти [4]. ^рка пiдвищуе ефективнiсть використання iнших поживних речовин рослинами, насамперед азоту i фосфору. Найчастiше дефiцит сульфатiв спостер^аеться на глинистих i суглинистих грунтах. Дефщит елементу зростае за умов внесення сечовини, амiачно! селiтри, дiамонiйфосфату, амiачно! води i безводного амiаку тощо. Перерахованi добрива мiстять шрку в малих кiлькостях або взагалi li не мiстять [5].
Таким чином, метою нашо! роботи було простежити залежнiсть мiж рiвнем сульфпдрильних груп у органах пшеницi, вмютом малонового диальдегiду та активностi супероксиддисмутази, глютатiонредуктази та глютатiонпероксидази в залежност вiд умов позакореневого пiдживлення шркою та фосфором.
МАТЕР1АЛИ I МЕТОДИ
Рослини озимо! пшенищ сорту Смуглянка вирощували методом водно! культури в лабораторних умовах на середовищi Хогленда-Арнона (Х-А).
Середовище Хогленда-Арнона розчиняли водою 1:10 та використовували у дослщах. Проростки озимо! пшеницi у фазi двох листкiв обробляли шляхом занурення листкiв у розчини на 5 хв при 23 оС за наступною схемою: 1 - 1/10 Х-А (контроль); 2 - 1/10 Х-А + позакоренева обробка K2SO4 (1,0 мкМ); 3 - 1/10 Х-А + позакоренева обробка K2SO4 (0,1 мМ); 4 - 1/10 Х-А + позакоренева обробка KH2PO4 (10 мкМ); 5 - 1/10 Х-А + позакоренева обробка KH2PO4 (100 мкМ); 6 - 1/10 Х-А + позакоренева обробка K2SO4 (1,0 мкМ) + KH2PO4 (10 мкМ).
Рослини озимо! пшенищ на 7 день тсля позакоренево! обробки використовувалися для визначення кшькосп сульфпдрильних груп, глютатюнредуктази, супероксиддисмутази та вмюту малонового дiальдегiду. Кiлькiсть сульфгiдрильних груп визначали за методикою Велча i Норвела [6].
Актившсть глютатiонпероксидази (III) визначали за методом Pinto R.E. та Bartley W. [7] в модифшаци Кругликово! Г.А. та Штутман Ц.М. [8]. В якостi окислювального субстрату використовували пероксид водню. Актившсть ощнювали за рiзницею мiж кшьюстю вiдновленого глутатiону в контрольнiй пробi (без Н2О2) та дослiднiй [9].
Для визначення активност СОД (КФ 1.15.1.1) використовували спещальний кит для визначення активносп СОД (SOD Assay Kit-WST, Sigma-Aldrich). Рослиннi кштини мають кiлька форм СОД. Зокрема, нами був проведений аналiз цитозольно! фракцп ферменту. Наважку листкiв гомогешзували в 50 мМ калiй-фосфатного буфера, рН 7,8. Гомогенат центрифугували, а супернатант використовували як грубий екстракт цитозольно! фракци СОД. Оптичну щшьшсть вимiрювали при 450 нм.
Актившсть ГР (КФ 1.6.4.2) визначали спектрофотометрично по зменшенню оптично! щiльностi при довжиш хвилi 340 нм в результат окиснення НАДФ*Н в присутносп окисненого глутатiону [10]. Реакцiйне середовище мютило 100 мМ
фосфатного буфера (рН 7,8), 1 мМ EDTA, 0,2 мМ НАДФН та 0,5 мМ окисненого глутатюну. Вимiрювання оптично! щiльностi проводили протягом 10 хв. Активнiсть ферменту ро зраховували в мкМ / (мг х хв) на основi коефщента молярно! екстинкцiï s = 6,2 мМ-1 х см-1.
Результати оброблеш статистично за допомогою програми Microsoft Excel.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ
Кiлькiсне визначення вмiсту сульфгiдрильних груп у коренях озимоï пшеницi показало, що ïx вмiст залежить вщ концентрацiï сiрки та фосфору в поживному розчиш. Обробка рiзними концентращями сульфату i ортофосфату призводила до збшьшення вмiсту SH-груп в коренях озимоï пшеницi (рис. 1).
12 3-156
Рис. 1. Вплив позакоренево! обробки рiзними концентрацiями сульфату та ортофосфату на вмют 8Н-груп в коренях озимо! пшенищ сорту Смуглянка.
Умовш позначки тут i далi: 1 - 1/10 Х-А; (контроль) 2 - 1/10 Х-А + К2Б04 (1,0 мкМ); 3 - 1/10 Х-А + К2Б04 (0,1 мМ); 4 - 1/10 Х-А + КН2Р04 (10 мкМ); 5 - 1/10 Х-А + КН2Р04 (100 мкМ); 6 - 1/10 Х-А+ К2Б04 (1,0 мкМ) + КН2Р04 (10 мкМ).
Зпдно з отриманих даних, позакоренева обробка КН2Р04 (100 мкМ) призводила до збшьшення вмюту 8Н-груп на 34%; обробка К2804 (1,0 мкМ), К2804 (1,0 мкМ) + КН2Р04 (10 мкМ) - на 26%; а обробка КН2Р04 (10 мкМ) - на 18%. Максимальний ефект спостер^ався за позакоренево! обробки 100 мкМ КН2Р04, що в даному випадку може свщчити про пiдвищення ферментативно! активностi в тканинах кореня.
Також паралельно було дослiджено вмют 8Н-груп в листках рослин пшенищ (рис. 2). Показано, що в листках порiвняно з коренями вмют 8Н-груп був меншим, але було вiдмiчено тенденцiю до бшьшо! величини зростання вмiсту 8Н-груп за ди добрив.
Данi по вмiсту 8Н-груп в листках варiанту з обробкою КН2Р04 (100 мкМ) були вищими за контрольнi значення на 21%, а у варiантi К2804 (1,0 мкМ)+ КН2Р04 (10 мкМ) вмют 8Н-груп зростав на 18% порiвняно з контролем. Вiдомо, що зростання вмюту 8Н-груп за ди певного антропогенного чинника е захисною реакщею при розвитку оксидного стресу. Так, зростання вмюту сполук тюлово! природи, що
мютять 8Н-групи та фенолiв, флавоно!дав, пролiну, а також активностi супероксиддисмутази, пероксидази було показано за умов ди ультрафiолетового опромiнення та нiкелю [11].
Рис. 2. Вплив позакоренево! обробки рiзними концентрацiями сульфату та ортофосфату на вмют 8Н-груп в листках озимо! пшенищ сорту Смуглянка.
Вщомо, що у структурi глутатюну знаходиться бiльша частину пулу вшьних тiолових груп у бiологiчних системах. Вщновлений глутатiон е основним водорозчинним антиоксидантом в процесах фотосинтезу i в нефотосинтетичних тканинах, реагуе прямо або опосередковано з активними формами кисню, сприяе цiлiсностi клiтинних структур i певним функцiям рiзних метаболiчних шлях1в [12, 13].
Для шдтвердження нашого припущення стосовно пiдвищення ферментативно! активностi в фотосинтетичних тканинах за умов дп сульфату та ортофосфату було дослщжено активнiсть глютатiонредуктази, глютатюнпероксидази (рис. 3, 4).
Рис. 3. Вплив позакоренево! обробки рiзними концентращями сульфату та ортофосфату на актившсть глутатiонпероксидази в листках озимо! пшенищ сорту Смуглянка.
Як i в тканинах кореня, так i в листках показано зниження активност глутатiонпероксидази, що в свою чергу пов'язано зi зростанням вмiсту 8Н-груп. Вiдомо, що важлива функцiя глутатiону полягае в детоксикащ! при оксидному стресi: глутатюн е косубстратом для глутатiонпероксидази при захиснш реакцi!' для
зниження вмюту гiдроперекисiв при окислювальному CTpeci [14]. Тому, в нашому експериментi ми спостерiгали значне зростання вмюту SH-груп як в листках, так i в коренях за позакоренево! обробки. Суттеве зростання було вiдмiчено при позакореневiй обробцi з K2SO4, тому додаткове пiдживлення аркою у формi K2SO4 може як сприяти пiдвищенню вмiстy SH-груп, так i створюе умови для розвитку оксидного стресу, який в свою чергу може забезпечити предадаптащю для рослин пшенищ за даних умов.
Крiм того, ГР е ферментом, що каталiзyе НАДФН-залежне вiдновлення окисненого глутатюну i пiдтримyе його внутршньокл^инний пул у вiдновленомy станi [15]. Утилiзацiя H2O2, що утворюеться в хлоропластах, забезпечуеться ферментом глутатюнредуктазою, що здшснюе НАДФН-залежне вiдновлення окисненого димерного глутатюну [16]. Було показано, що iндyкцiя ГР в рослинах вщбуваетъся в рiзних стресових умовах [17]. В експериментах Tsai [18] вщзначено збiльшення активностi ГР в коренях рису у вщповщь на дда NaCl. Дослiдження Dixit [19] показали подiбнi залежностi при обробцi рослин гороху кадмiем. Зростання активностi ГР спостерпали i в рослинах пшенищ за обробки рiзними концентрацiями сульфату та ортофосфату (рис. 4). Наведет результата дозволяють припустити, що рiзнi стресовi фактори, до яких можна вщнести позакореневу обробку мiнеральними добривами, можуть викликати в рослинах подiбнi процеси.
1.2
Рис. 4. Вплив позакоренево! обробки рiзними концентращями сульфату та ортофосфату на активнють глутатiонредуктази в листках озимо! пшенищ сорту Смуглянка.
Поряд з цим, вивчення маркеру оксидного стресу - вмюту малонового диальдепду та активност ферменту СОД продемонструвало тенденцiю до зростання вмюту МДА у вшх дослщжуваних варiантах (рис. 5).
Дане зростання свщчить про розвиток оксидного стресу ^ на нашу думку, оксидний стрес при позакореневiй обробщ мiнеральними добривами (сiрка та фосфор) може являти собою явище предадаптаци, оскiльки активно функцiонуe проантиоксидантна система i паралельно зростае вмiст 8И-груп, а змiн у вмiстi антиоксидантного ферменту СОД вiдмiчено не було (рис. 6).
1 2 3 4 5 6
Рис. 5. Вплив позакоренево! обробки рiзними концентращями сульфату та ортофосфату на вмют малонового диальдепду (МДА) в листках озимо! пшенищ сорту Смуглянка.
1 2 3 4 5 6
Рис. 6. Вплив позакоренево! обробки рiзними концентращями арки та фосфору на актившсть супероксидисмутази в листках озимо! пшенищ сорту Смуглянка.
СОД е одним iз ключових ферменив системи захисту клiтин i тканин вщ окислювально! деструкцi!. Вона каталiзуе реакцiю дисмутацi! супероксидного анiон радикалу (О-2) до О2 та Н2О2, регулюючи таким чином внутрiшньоклiтинну концентращю вiльних радикалiв кисню. Активнiсть СОД за ди несприятливих факторiв навколишнього середовища, при збiльшеннi утворення активних форм кисню у органiзмах рослин, може змшюватися диференцiйовано в залежносп вiд тривалостi й iнтенсивностi ди стресового чинника, а також вщ стiйкостi органiзму, стадi! розвитку рослин тощо [20]. Результати детектування змiн активностi СОД не показали статистично достовiрних змiн величин, що на фонi зростання активностi ГР та вмюту 8И-груп може свщчити про бiльшу активнiсть прооксидантно! системи захисту.
Зростання активност ГР та незначш змiни у вмiстi СОД, що були визначеш у рослин пшенищ, також було вiдмiчено при шфшуванш рослин нуту &сег апеШит Ь. Нановiрусами з подальшим розвитком оксидного стресу [21]. Для ф^остресу е характерною активащя основних антиоксидантних ферментiв та збiльшення пулу низькомолекулярних антиоксидантiв на фонi зростання !х окиснення [22, 23]. Поряд з цим, у рослин гороху за умов ди ппертерми, екзогенного пероксиду водню було
виявлено обмеження активностi глутатiонредуктази при оксидному CTpeci i зроблено припущення про рiзнi механiзми вiдповiдi антиоксидантно! системи хлоропластiв на дiю рiзних абiотичних факторiв [24].
ВИСНОВОК
Показано, що позакоренева обробка сульфатом та ортофосфатом 14-денних проростюв озимо! пшенищ сорту Смуглянка призводить до збшьшення вмiсту SH-груп в коренях та листках. Найбшьш сильний ефект дала обробка KH2PO4 (100 мкМ), при якiй вмiст сульфпдрильних груп у коренях та листках тдвищувався на 34%. Встановленi змши вмiсту SH-груп в коренях та листках проростюв озимо! пшеницi можуть слугувати основою для фiзiологiчного обгрунтування систем живлення культури на початкових фазах розвитку. Виявлено наявнiсть розвитку оксидного стресу при позакореневш обробщ мiнеральними добривами (сiрка та фосфор), що може являти собою явище предадаптаци, оскiльки активно функцiонуe проантиоксидантна система i паралельно зростае вмют SH-груп, а змш у вмют антиоксидантного ферменту СОД вiдмiчено не було. Зокрема, позакоренева обробка сiркою та фосфором (100 мкМ KH2PO4) впливае на зростання активностi глутатюнредуктази та вмiсту SH-груп у рослинах пшенищ, що може сприяти шдвищенню стiйкостi рослин до стресових факторiв за рахунок зростання пулу шрковмюних сполук.
Список лiтератури
1. Душкин А. Н. Комплексное действие удобрений, микроэлементов и регуляторов роста / А. Н. Душкин, Н. С. Беспалова // Химизация сельского хозяйства. - 1990. - № 6. - С. 59-61.
2. Моргун В. В. Физиологические основы формирования высокой продуктивности зерновых злаков / В. В. Моргун, В. В. Швартау, Д. А. Киризий // Физиология и биохимия культурных растений. - 2010. - Т. 42, № 5. - С. 371-393.
3. Швартау В. В. Особенности реакции растений на дефицит фосфора / В. В. Швартау, Б. И. Гуляев, А. Б. Карлова // Физиология и биохимия культурных растений. - 2009. - Т. 41, № 3. - С. 208-220.
4. Saito K. Sulfur assimilatory metabolism. The long and smelling rood / K. Saito // Plant Physiol. - 2004. - Vol. 136, № 1. - P. 2443-2450.
5. Минеев В. Г. Агрохимия: учебник. 3-е издание / В. Г. Минеев. - М. : Наука, 2006. - 720 с.
6. Rengel Z. Sulfhydryl groups in root-cell plasma membranes of wheat genetypes differing in Zn efficiency / Z. Rengel // Physiologia Plantarum. - 1995. - Vol. 4. - Р. 604-612.
7. Pinto R. E. The nature of the sex-linked differences in glutathione peroxidase activity and aerobic oxidation of glutathione in male and female rat liver / R.E. Pinto, W. Bartley // J. Biochem.- 1969. - Vol. 115, № 3. - P. 449-456.
8. Кругликов Г.О. Глутатионпероксидазная и глутатионредуктазная активность печени крыс после введения селенита натрия / Г.О. Кругликов, И.М. Штутман // Украинский биохимический журнал. -1976. - № 2. - С. 223-227.
9. Sedlak J. Estimation of total, protein-bound, and nonprotein sulfhydryl groups in tissue with Ellman's reagent / J. Sedlak, R. H. Lindsey // Anal. Biochem. - 1968. - Vol. 24; 25, № 1. - P. 192-205.
10. Glutathione reductase activity and isoforms in leaves and roots of wheat plants subjected to cadmium stress / G.G. Yannarelli, A.J. Fernandez-Alvare, D.M. Santa-Cruz [et al.] // Phytochemistry. - 2007. - Vol. 68. - P. 505-512.
11. Response of ultraviolet-B and nickel on pigments, metabolite and antioxidants of Pisum sativum L. / S. Suruchi, M. Shweta, K. Rima [et al.] // J. Env. Biol. - 2009. - Vol. 30, № 5. - P. 677-684.
12. Bielawski W. Reduced and oxizidized glutathione reducatase activity in tissues of Pisum sativum / W. Bielawski, K. W. Joy // Planta. - 1986. - Vol. 169. - P. 267-272.
13. Ascorbic acid metabolism in the ascorbate deficient Arobidopsis mutant vtc1 / P. L. Conklin, J. E. Pallanca, R. L. Last [et al.] // Plant Physiol. - 1997. - Vol. 115. - P. 1277-1285.
14. Sies H. Biochemistry of thiol groups: the role of glutathione / H. Sies // Naturwissenschaften. - 1989. - Vol. 76, № 2. - P. 57-64.
15. Interactions between biosynthesis, compartmentation and transport in the control of glutathione homeostasis and signaling / G. Noctor, L. Gomez, H. Vanacker [et al.] // J. Exp. Bot. - 2002. - Vol. 53. - P. 1283-1304.
16. The role of oxygen species in plant signal transduction / F. Van Breusegem, E. Vranova, J. Dat [et al.] // Plant Sci. - 2001. - Vol. 161. - P. 405-414.
17. Turhan E. The activity of antioxidative enzymes in three strawberry cultivars related to salt-stress tolerance / E. Turhan, H. Gulen, A. Eris // Acta Physiol. Plant. - 2008. - Vol. 30. - P. 201-208.
18. Expression of ascorbate peroxidase and glutathione reductase in roots of rice seedlings in response to NaCl and H2O2 / Y.C. Tsai, C.Y. Hong, L.F. Liu, C.H. Kao // J. Plant Physiol. - 2005. - Vol. 162. - P. 291-299.
19. Dixit V. Differential antioxidative responses to cadmium in roots and leaves of pea (Pisum sativum L.) / V. Dixit, V. Pandey, R. Shyam // J. Exp. Bot. - 2001. - Vol. 52. - P. 1101-1109.
20. Бараненко В.В. Супероксиддисмутаза в клетках растений / В.В. Бараненко // Цитология. - 2006. - Т. 48, № 6. - С. 465-474.
21. Гусейнова И.М. Антиоксидантная система у инфицированных нановирусами бобовых растений / И.М. Гусейнова, А.Ч. Мамедов, Н.Ф. Султанова // Электронный научный журнал «Современные проблемы науки и образования». - 2011. - № 6.
22. Fu J. Involvement of antioxidants and lipid peroxidation in the adaptation of two cool-season grasses to localized drought stress / J. Fu, B. Huang // Environ. Exp. Bot. - 2001. - Vol. 45. - P. 105-114.
23. Hernandez J.A. Short-term effects of salt stress on antioxidant systems and leaf water relations of pea plants / J.A. Hernandez, M.S. Almansa // Physiol. Plant. - 2002. - Vol. 115, № 2. - P. 251-257.
24. Прооксидантно-антиоксидантный статус хлоропластов гороха при действии стрессирующих абиотических факторов среды. 2. Антиоксидантная система защиты / Л.Н. Курганова, И.В. Балалаева, А.П. Веселов [та ш.] // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. - 2010. - № 2 (2). - С. 550-556.
Сандецкая Н.В. Влияние условий минерального питания на элементы антиоксидантного статуса растений озимой пшеницы / Н.В. Сандецкая, О.П. Каменчук, О.В. Ситар // Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. Серия «Биология, химия». - 2012. -Т. 25 (64), № 3. - С.179-186.
Исследована активность глютатионредуктазы, глютатионпероксидазы, супероксиддисмутазы, содержание малонового диальдегида и SH-групп в органах проростков пшеницы при действии внекорневой обработки различными концентрациями сульфата и ортофосфата. Выявлены изменения в антиоксидантном статусе растений при внекорневой обработке минеральными удобрениями (сера и фосфор).
Ключевые слова: озимая пшеница (Triticum aestivum L.), внекорневая подкормка, SH-группы, глютатионредуктазы, глютатионпероксидаза, малоновый диальдегид, супероксиддисмутаза.
Sandetska N.V. The effect of mineral nutrition conditions on antioxidant status of winter wheat plants
parameters / N.V. Sandetska, O.P. Kamenchuk, O.V. Sytar // Scientific Notes of Taurida V.Vernadsky
National University. - Series: Biology, chemistry. - 2012. - Vol. 25 (64), No. 3. - Р. 179-186.
The activity of glutathione reductase, glutathione peroxidase, superoxide dismutase and malondialdehyde
content and SH-groups in leaves and roots of wheat seedlings under the actions of foliar treatment by various
concentrations of sulfur and phosphorus has been studied. Stated Ganges in antioxidant status of wheat plants
under foliar treatment by various concentrations of sulfur and phosphorus was discussed.
Keywords: winter wheat (Triticum aestivum L.), foliar treatment, sulfhydryl groups, glutathione reductase,
free thiols, malondialdehyde, superoxide dismutase.
Поступила в редакцию 11.10.2012 г.
