CC BY
12
В1СНИК ВДНЗУ «Украхнська медична стоматологгчна академя»
histochemical techniques and scanning electron microscopy with X-ray diffraction. The average age of the dead persons with atherosclerotic aorta was 68, 47 ± 1, 32 years, and in those having no signs of mineralization was 51, 8 ± 2, 56 years. The equal number of men and women (both 30 patients) were selected for the study. During the macroscopic study of wall tissue, biomineral deposits were found to be located in the inner layer of the aortic wall in the case of atherosclerosis. Histological study has shown the thickening of fibrous layer and elastic fibbers, focal lipid plaques, cholesterol fissures, oedema in the affected aortic components. The presence of calcium compounds in identified biominerals was confirmed by using histochemical staining by Alizarin Red and Von Kossa method. SEM with X-ray microanalysis has demonstrated mineralized elements in aortic tissue are detected as bright greyish-white objects in the form of blocks, clots, and fine powder particles, inlaid into histological structure of valves and closely related to connective tissue components of the organ. In some sites elastic and connective fibbers foliation was observed, in other locations biomineral component smoothly turns into the surrounding stroma. X-ray diffraction of aortic mineralized components in all sites has showed a similar chemical composition, close to the ratio between calcium and phosphorus, most of which corresponde to hydroxyapatite.
УДК 616 - 099: 547. 593] - 036.11 - 092. 9
Наконечна С.А., Гафт К.Л., Кощ'ш 6.6., Наконечний 6.В.
ВПЛИВ ПОХ1ДНИХ ФЕНОЛУ НА СПОЛУЧЕН1СТЬ ПРОЦЕС1В М1КРОСОМАЛЬНОГО ОКИСНЕННЯ Й Б1ОЕНЕРГЕТИКИ В ХРОН1ЧНОМУ ДОСЛ1Д1 НА ЛАБОРАТОРНИХ ТВАРИНАХ
Харшський нацюнальний уыверситет iM. В.Н. КаразЫа ДУ «Харшський науково дослщний шститут загально!' та невщкпадно!' допомоги НАМН Укра'ши iMeHi В.Т. Зайцева»
У статтi був описаний взаемозв'язок мж активнстю монооксигеназноУ системи та станом про-цес/в л'топероксидацИ у мкросомах печiнки щур'в при diï на органiзм пох'дних фенолу. Використову-ючи методи диференц/йованого ультрацентрифугування, спектрофотометрiï та хем'тюм'месце-нтного анал'зу, визначено активнсть НАДф-цитохром-с-редуктази, вмст цитохром'т b5 та Р-450, диенових кон'югат'в, гiдроперикисiв л/'п/'д/'в, малонового диальдег'ду, iнтенсивнсть вльноради-кальних процес'т та антирадикальну спроможнсть м/кросом печiнки блих щур'т-самщв лш Встар. Встановлено, що напрямок ступеню порушень й строки виникнення зм/'н компонент/в монооксиге-назноУ системи, показник'т окремих стадш перекисного окиснення лШд 'т визначаються як будовою, так й iнтенсивнстю та тривалстю ôiï ксеноб'ютик'т.
Ключовi слова: мiкросомальне окиснення, ксенобютики, цитохроми, тканинне дихання, окисне фосфорилювання. Робота виконана у рамках науково-досл/дноГ роботи «Медико-еколог/чна характеристика фактор/в навколишнього й вироб-ничого середовища та здоров'я Харювського рег/ону у зв'язку з проблемою формування методичних п/дход/в впровадження мон/торингу здоров'я», № держ. реестрацп 01940038038.
Вступ
У процес еволюцп в живих оргашзмах сфор-мувалися ферменты системи, як забезпечують Тхне виживання в умовах агресивного хiмiчного оточення. Ц системи представлен численними ферментами, як здшснюють окиснення, вщнов-лення, гiдролiз i кон'югацш чужорщних сполук. Бютрансформа^я ксенобютиш тюно пов'язана з метаболiзмом ендогенних речовин i для бага-тьох ферметчв виявлен як ксенобютичш, так i ендобютичы субстрати [1]. У бшьшосп випадкв метаболiчнi перетворення чужорщних хiмiчних речовин в органiзмi приводить до прискорення |'хньо'|' елiмiнацiï й зниження бюлопчно'Г активность Однак, нерщко в процес метаболiзму ксено-бютимв утворюються реакцшноспроможы штер-медiати й активы форми кисню, як ковалентно зв'язуються i3 кл^инними макромолекулами, компонентами мембран i активують оксидатив-ний стрес. 1стотний внесок у забезпечення ме-ханiзмiв формування оксидативного стресу вносить структурно-функцюнальний стан моноокси-
геназно'Г системи й дихального ланцюга елект-ронного транспорту кл^ин рiзних оргашв, тканин i в першу чергу печшки, нирок, легешв, наднир-никв та ш. [2]. 1ндук^я або блокування активно-ст метаболiзуючих ферметчв ендоплазматич-но'|' атки, мтохондрш, пероксисом, лiзосом мае ютотний вплив на перетворення ксенобютикв в органiзмi й розвиток патолопчних сташв. Для оцшки резервних можливостей, ступеня стшкосп оргашзму шкiдливим факторам навколишнього й виробничого середовища, найбтьш адекватни-ми е методи вивчення модифкуючо'Г дм хiмiчних забруднювачiв на рiвнi мiкросомальноï оксиге-назно'Г системи з паралельним дослщженням можливих несприятливих ефек^в на рiвнi мем-браноструктурних ферметчв [3]. Основною структурно-функцiональною одиницею, що здш-снюе цi процеси, е ендоплазматична атка гепа-тоцитiв, а саме ферментна система мiкросома-льно'Г мембрани, яка приймае участь у детокси-кацп неполярних чужорiдних сполук. Особливий штерес представляють дослiдження й метаболн
чних процеав у мiтохондрiях за впливу на орга-нiзм шкiдливих антропогенних факторiв. Найва-жливiшою ланкою, яка забезпечуе функцюну-вання вiдновних синтезiв, являються бюенерге-тичнi процеси й пов'язаш з ними поглинання не-оргашчного фосфату й споживання кисню. Ная-внi в лiтературi данi про функцюнальний стан мiтохондрiй вказують на ютотш порушення про-цесiв дихання й фосфорилювання в умовах ш-токсикацп органiзму [4,5]. Оцiнка стану мiкросо-мального окиснення, процесiв дихання й фосфорилювання е актуальним при вивченш меха-нiзму бюлопчноТ дм ксенобiотикiв.
Мета дослiдження
У зв'язку з вищевикладеним метою роботи було вивчення монооксигеназноТ системи мiкро-сом i сполучення процесiв тканинного дихання та фосфорилювання в умовах хрошчного експе-рименту при впливi ксенобiотикiв.
Об'ект та методи дослщження
Об'ектом дослiдження були тварини популяцiТ Вiстар, яким перорально за допомогою метале-вого зонда вводилися водян розчини ксенобю-тикiв в дозах 1/10; 1/100; 1/1000 DL5o. Тривалють пiдгострого дослiду на теплокровних тваринах становила 1,5 мюяця. По закшченш експеримен-ту проведено вивчення впливу похщних фенолу на двi мiкросомальнi електронно-транспортнi системи печiнки щурiв: НАДФ-Н-пов'язану iз цито-хромом Р450 як кiнцева ланка й НАД-Н-систему iз цитохромом Ь5 як акцептор електрошв. Дослн джували такi параметри мiкросомального окиснення, як дихальна активнють, вмiст цитохромiв Р450, Ь5, активнiсть редуктаз. Найбiльш повно й об'ективно активнють системи мiкросомального окиснення може бути оцшена по швидкост ме-таболiзму ксенобiотикiв, що вщображае актив-нiсть як початкових (НАДФ-Н, НАД-Н-редуктаз), так i термiнальних (цитохроми) дтянок. Як субстрат мiкросомальноТ Р450 -залежноТ системи ви-користали р-штроашзол - ксенобiотик, який пщ-даеться окисному деметилюванню з утворенням р-штрофенолу, який мае характерний спектр поглинання в лужному середовищк У робот дослн джували таю параметри мiкросомального окиснення як активнють о-деметилази, НАДФ-Н-цитохром-с-редуктази, НАД-Н-цитохром с-редуктази, швидкють ендогенного подиху мiкро-сом, швидкють окиснення НАДФ-Н, швидкють окиснення НАД-Н у присутност ЕДТА, швидкють перекисного окиснення лт^в i вмiст цитохромiв Р450 i Ь5 [7]. Вимiр активностi Са2+ i Мд2+-залежноТ АТФази проводили загальноприйнятим
Вплив похiдних
методом.
Утримання тварин та експерименти проводи-лися вщповщно до положень «европейськоТ конвенцiТ про захист хребетних тварин, як вико-ристовуються для експериментв та iнших нау-кових цтей» (Страсбург, 2005), «Загальних ети-чних принципiв експериментiв на тваринах», ух-валених П'ятим нацiональним конгресом з бюе-тики (КиТв, 2013).
Результати дослщжень та 1х обговорення
Вивчення о-деметилазноТ активностi мiкро-сом печшки щурiв показав, що пщ впливом похн дних фенолу в дозi 1/10 i 1/100 DL50 процеси де-токсикацiТ ксенобiотикiв штенсифкуються. У бь льшiй мiрi посилення деметилювання вщзнача-лося в 1/10 DL50, iстотно нижче цi процеси були в дозi 1/100 DL50, однак у всiх випадках вiрогiдно пiдвищувалися порiвняно до контрольноТ групи. Ксенобютики в умовах пiдгострого дослщу пщ-вищували НАДФ-Н й НАД-Н-цитохром-с-редуктазну активнiсть, утворюючи вплив на два електронно-транспортш мiкросомальнi ланцюги: монооксигеназний та редуктазний. Швидкють ендогенного подиху мiкросом i окиснення НАДФ-Н, НАД-Н у присутност ЕДТА, а також ш-тенсивнiсть перекисного окиснення лт^в пщ-вищувалися у випадку перорального надхо-дження в органiзм 1/10 i 1/100 DL50 ксенобiотикiв. Речовини пщвищували вмiст цитохрому Р450 i не впливали на концентрацiю цитохрому Ь5.
Результати оцiнки впливу ксенобютиш на монооксигеназний та редуктазний ланцюг мiкро-сом ендоплазматичноТ мереж1 гепатоцитв свщ-чать про те, що дан речовини, що е стресовим фактором на тваринний оргашзм, збтьшували всi дослiдженi параметри мiкросомального окиснення, окрiм вмiсту цитохрому Ь5. Отриманi данi виявили, що випробуваш препарати стимулюють вiльнорадикальнi процеси, перекисне окиснення лт^фв, е iндукторами продукци активних форм кисню, що пщтверджуеться пiдвищенням рiвня практично всiх параметрiв окисноТ гщроксилюю-чоТ монооксигеназноТ системи (табл. 1).
Найважлившим фактором, який забезпечуе функцюнування вiдновних синтезiв, е бюенерге-тичнi процеси й пов'язаш з ними поглинання не-оргашчного фосфату й споживання кисню, як супроводжуються генерацiею макроергiчних субстратiв i в першу чергу АТФ [8]. У зв'язку з вищевикладеним актуальним було вивчення впливу ксенобютиш у субтоксичнш дозi на бюе-нергетичш процеси в умовах хронiчного експе-рименту.
Таблиця 1
олу на систему мкросомального окиснення в дозi 1/100 DL50.
Показники Дослiд Контроль
О-деметилаза (нмоль р-штрофенолу/хвмг бтка) 9,62 ± 0,90* 6,69 ± 0,64
НАДФ-Н-цитохром-с-редуктаза (нмоль цитохрому с/хвмг бтка) 222,1 ± 30,3 202,0 ± 24,3
НАД-Н-цитохром-с-редуктаза (нмоль цитохр с/хвмг бтка) 1205,2±293,4 955,1± 182,3
Швидкють ендогенного подиху (нмоль О2/хвмг бiлка) 2,84 ± 0,33* 1,40 ± 0,35
В1СНИК ВДНЗУ «Украгнська медична стоматологгчна академя»
Швидюсть окиснення НАДФН у присутност ЕДТА (нмоль О2/хвмг бтка) 6,06 ± 0,42* 2,91 ± 0,52
Швидюсть окиснення НАДН у присутност ЕДТА (нмоль О2/хвмг бтка) 8,90 ± 1,24* 3,31 ± 0,41
Швидюсть перекисного окиснення лшщв (нмоль О2/хвмг бтка) 2,91 ± 0,60* 0,42 ± 0,11
Вмют цитохрому Р450 (нмоль/мг бтка) 0,917±0,211* 0,652±0,212
Вмют цитохрому Ь5 (нмоль/мг бтка) 0,647±0,131 0,620±0,104
Прим1тка: * - розходження достов1рн1 р <0,05.
Таблиця 2
Вплив пох1дних фенолу в доз11/100 DL5o на метабол1чний стан м1тохондр1й гепатоцит1в в умовах хрон1чного досл!ду (М±т)
Показники Дослщ Контроль
Подих пiсля додавання сукцинату (нмоль О2хв-1мг-1 бiлка) 1,38±0,024* 1,7 ± 1,04
Подих шсля додавання АДФ (нмоль О2хв-1мг-1 бтка) 4,10 ± 1,20* 6,15 ± 0,36
Подих шсля додавання роз'еднувача 2,4-ДНФ (нмоль О2хв-1мг-1 бтка) 5,00 ± 0,16* 7,3 ± 0,44
Дихальний коеф^ент ДК = АТФ/сукцинат (вщн. од.) 2,97 ± 0,16* 3,8 ± 0,18
Коеф^ент фосфорилювання - АДФ/О2 1,70 ± 0,04* 2,7 ± 0,3
Мд2+-активована АТФаза (мкмоль Р/мг бтка1годину) 64,03 ± 1,7* 81,52 ± 2,4
Са2+-активована АТФаза (мкмоль Р/мг бтка1годину) 59,65±1,73* 66,3 ± 2,1
Прим1тка: * - розходження достов1рн1 р <0,05.
Результати дослщжень показали, що швид-кють окиснення сукцинату сукцинатдегидрогена-зою у метаболiчному стан мтохондрш дослн джуваних груп тварин трохи знижувалася в порн внянн з контрольною групою (табл. 2).
З огляду на тюний зв'язок ферменту сукцина-тдегiдрогенази iз внутрiшньою мембраною мто-хондрiй, можна припускати порушення ''' струк-турно-функцюнального стану, пов'язаного зi змн ною фiзико-хiмiчних властивостей: мембранно' проникностi, в'язкосп, заряду, гiдрофобного об'ему, полярностi та ш. Змiна фiзико-хiмiчних властивостей мембран сполучена з порушенням бiоенегетичних i синтетичних процесiв [8]. Екс-периментальне вивчення метаболiчного стану мiтохондрiй гепатоцитв щурiв контрольно' групи виявило досить його високий рiвень за вама до-слiджуваними показниками i енергетичними станами. Так, додавання акцептора та додатково роз'еднувача 2,4-ДНФ викликало збтьшення швидкостi подиху в присутност сукцинату й АТФ, пов'язаного зi зниженням мембранного по-тенцiалу [9]. При цьому спостер^али зниження швидкост подиху в присутностi 2,4-ДНФ, що су-проводжувалося зниженням дихального коефщн ента до 2,97 ± 0,16 вщн.од. Дослiдження вияви-ли, що ксенобютики в умовах хронiчного дослщу на бiлих щурах приводили до зниження окисного фосфорилювання в мiтохондрiях гепатоцитiв i збiльшували частку втьного дихання. Про це свiдчило зниження штенсивносп дихання в безакцепторному середовищi й у метаболiчному стаж шсля додавання АДФ. Дихальний коефщн ент (вiдношення АТФ/сукцинату) i коефiцieнт фосфорилювання (АДФ/О2) iстотно знижувався в дослщжуваних групах тварин, що дозволило судити про роз'еднання дихання й фосфорилювання [10]. Регенера^я АДФ при оцшц АТФ-гщролазно' реакцп знижувалася також у дослн джуваних групах порiвняно з контролем. Вира-жене пригшчення дихання указуе на зниження штенсивносп реакцiй окисного фосфорилювання й синтезу АТФ, яке може бути пов'язане зi змшою структури мтохондрш i 'хньою фрагмен-тацieю. Дослiдження свiдчили, що ксенобютики в
дозах 1/10; 1/100 DL5o приводять до порушення окисного фосфорилювання й тканинного дихання, що супроводжуеться зниженням продукцп макроерпчних субстратв i в першу чергу АтФ. Наведет результати про порушення метаболiч-ного стану мтохондрш гепатоцитiв корелювали з активнютю 'хшх АТФаз (табл. 2). Осктьки актив-нiсть АТФаз мтохондрш пов'язують iз процеса-ми окиснення й фосфорилювання, ц дат стано-влять значний iнтерес для розумшня структурно-метаболiчних механiзмiв формування патогенезу штоксикацп органiзму експериментальних тварин, що пщдавалися впливу похщних фено-лiв.
Висновки
Таким чином, результати дослщжень свщ-чать про те, що похщн фенолiв в дозах 1/10 i 1/100 DL50 iнгiбуюче впливають на процеси бюе-нергетики, приводять до роз'еднання тканинного дихання й окисного фосфорилювання, стиму-люють втьнорадикальш процеси й перекисне окиснення лт^в, формуючи при цьому патоло-гiчнi реакцп, в основi яких лежить втьнорадика-льна патолопя, енергетичний голод i тканинна ппошя клiтин.
Перспективи подальших дослiджень
В подальшому плануеться вивчення активно-ст нейромедиаторiв i «вторинних месенджерiв» при дм на органiзм теплокровних тварин малих доз дослiджуваних речовин з метою обфунту-вання особливостей мехаызму ''хньо'' бюлопчно' дм, виявлення змш енергетичного забезпечення пристосувальних реакцiй.
Лтература
1. Григорьев А. И. Молекулярные механизмы адаптации к стрессу: гены раннего ответа / А. И. Григорьев, А. Г. Тоневицкий // Физиол. ж-л. - 2009. - Т. 95, № 10. - С. 1041-1057.
2. Зайцева О.В. Структурно-функциональное состояние цитопла-зматических мембран при субхроническом токсическом воздействии на организм теплокровных животных оксиэтилиро-ванного ксилита Л-655-2-100 / О.В. Зайцева, В.А. Телегин, В.И. Жуков [та ш.] // Експериментальна i кшшчна медицина. - 2007. -№ 3. - С. 63-67.
3. Андреев А.Ю. Метаболизм активних форм кислорода в митохондриях / А.Ю. Андреев, Ю.Е. Кушнарева, А.А. Старков // Биохимия. - 2005. - Т. 70, Вып. 2. - С. 246-264.
4. Попова Л.Д. Олигоэфиры - модуляторы радиомиметических 7. эффектов / Л.Д. Попова, В.И. Жуков, В.В. Мясоедов [и др.] // Медицина сегодня и завтра. - ХГМУ. - 2004. - № 4. - С. 51-59. 8.
5. Биологическая активность детергентов - производных нонил-бензолов в святи с проблемой охраны водных объектов / [В.И. Жуков, С.А. Стеценко, В.И. Пивень и др.]. - Белгород : ОАО 9. «Белвитамины», 2000. - 237 с.
6. Методические основы регламентации сложных смесей: триэта- 10. ноламиновых солей алкилфосфатов и алкилполифосфатов в воде водоёмов / [А.Я. Цыганенко, Н.Г. Щербань, Л.А. Бондаре-нко и др.]. - Белгород, 2001. - 178 с.
Реферат
ВЛИЯНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ФЕНОЛА НА СОПРЯЖЕНИЕ ПРОЦЕССОВ МИКРОСОМАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ И БИОЭНЕРГЕТИКИ В ХРОНИЧЕСКОМ ЭКСПЕРИМЕНТЕ НА ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ Наконечная С.А., Гафт К.Л., Кощий Е.Е., Наконечный Е.В.
Ключевые слова: микросомальное окисление, ксенобиотики, цитохромы, тканевое дыхание, окислительное фосфорилирование.
В статье была описана взаимосвязь между активностью монооксигеназной системы и состоянием процессов липопероксидации в микросомах печени крыс при действии на организм производных фенола. Используя методы дифференцированного ультрацентрифугирования, спектрофотометрии и хемилюминесцентного анализа, определена активность НАДф-цитохром-с-редуктазы, содержание цитохромов b5 и Р-450, диеновых конъюгатов, гидроперекисей липидов, малонового диальдегида, интенсивность свободнорадикальных процессов и антирадикальную способность микросом печени белых крыс-самцов линии Вистар. Установлено, что направление, степени нарушений и сроки возникновения изменений компонентов монооксигеназной системы, показателей отдельных стадий переки-сного окисления липидов определяются как строением, так и интенсивностью и длительностью действия ксенобиотиков.
Summary
INFLUENCE OF PHENOL DERIVATIVES ON CONNECTION BETWEEN PROCESSES OF MICROSOMAL OXIDATION AND BIOENERGY IN CHRONIC EXPERIMENT ON TEST ANIMALS Nakonechna S. A., Gaft K. L., Koshchii Ye.Ye., Nakonechniy Ye. V.
Key words: microsomal oxidation, oxidative stress, biotransformation of xenobiotics, alkylphenols, isononilphenols.
This article describes the interconnection between the activity of monooxygenase system and the state of lipid peroxydation in liver microsomes of rats exposed to oxyethylated alkyl phenols and isononilphenols. We used differential ultracentrifugation, spectrophotometry and chemo luminescence analysis, as well as we assessed the activity of NADF cytochrome reductases, the content of B5 and P-450 cytochromes, diene conjugates, lipid hydroperoxides, malonic dialdehyde, the intensity of free radical processes and antiradical capability of liver microsomes of white Wistar male rats. The findings obtained have demonstrated that direction and intensity of damages as well as the terms when component changes of monooxygenasion system arise, the indices of separate stages of lipid peroxydation are determined by the structure, intensity and duration of xenobiotic action.
Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике / В.В. Меньшиков. - М. : Медицина, 1987. - 368 с. Боев В.М. Свободнорадикальное окисление в оценке риска здоровья / В.М. Боев, С.И. Красиков, Н.В. Свистунова [и др.] // Гигиена и санитария. - 2006. - № 5. - С. 19-20. Октябрьский О.Н. Редокс-регуляция клеточных функций / О.Н. Октябрьский // Биохимия. - 2007. - Т. 72, Вып. 2. - С. 158-174. Лущак В.И. Свободнорадикальное окисление белков и его связь с функциональным состоянием организма / В.И. Лущак // Биохимия. - 2007. - Т. 72, Вып. 8. - С. 995-1017.
