CC BY
13
УДК 577.152.1:616.36-092.9-099:543.395
ВПЛИВ СУМ1ШЕЙ 1М1ДАЗОЛШШ НА АКТИВН1СТЬ НАДФН-ЦИТОХРОМ С РЕДУКТАЗИ ТА ВМ1СТ ЦИТОХРОМУ Р-450 У М1КРОСОМАЛЬН1Й ФРАКЦП ПЕЧ1НКИ
ЩУР1В
У poöoTi за допомогою спектрофотометричного методу визначено актившсть ферментiв у мiкросомальнiй фракци печшки щурiв на 30-ту добу впливу промислових хiмiчних забруднювачiв довкiлля - сумшей iмiдазолiнiв у дозах 1/10 i 1/100 ДЛ50, що е необхiдним для всебiчного розкриття бiохiмiчних механiзмiв мембранотропно! дп. Iмiдазолiнвмiснi сум^ з алкiльними радикалами С7-9 i С9-15 у дозi 1/10 ДЛ50 викликають iнактивацiю НАДФН-редуктазно! системи мжросом, що пiдтверджуеться зниженням активност НАДФН-цитохром с редуктази та вмюту цитохрому Р-450. Тривалий вплив сумшей у дозi 1/100 ДЛ50, навпаки, призводить до И активацп, що тдтверджуеться пiдвищенням активностi НАДФН-цитохром с редуктази та вмюту цитохрому Р-450. Виявлеш змши е однiею з патогенетичних ланок бiохiмiчних механiзмiв мембранотропно! дп сумiшей iмiдазолiнiв, що необхiдно враховувати при розробленнi засобiв !х корекцп.
Ключов! слова: cyMinii ¡мщазсипшв, щури, мжросоми, НАДФН-редуктаза, цитохром Р-450.
Робота виконана у рамках НДР «Вивчення uexam3uiB бiологiчноl dii простих полiефiрiв у зв 'язку з проблемою охорони навколишнього середовища» (номер держреестраци 0110U001812).
Актуальною проблемою сучасно! медицини е розкриття мехашзм1в розвитку патолопчних процешв при дп на оргашзм х1м1чних фактор1в довкшля [2, 8]. До поширених промислових х1м1чних забруднювач1в вщносяться сумш1 хмщазолшв (С1М), яю характеризуються досить значними об'емами синтезу, широким використанням у р1зних галузях народного господарства (як основа промислового випуску миючих засоб1в, антистатиюв, антикорозшних препарат1в, адгезшних добавок тощо), надходженням до джерел питного водопостачання та завдяки цьому можливим впливом на здоров'я людини [5, 9, 12]. Проте, бюх1мчш мехашзми дп С1М на оргашзм вивчено недостатньо, зокрема, вплив на первинш мшеш !х атаки - клгтинш мембрани. Функцп останшх е життево визначальними: !х порушення за умов впливу х1м1чних фактор1в або шдукуе ряд вщповщних реакцш, або призводить до загибел1 кл1тин [3].
Доведено, що мшросоми здатш зберпати бшьшють морфолопчних та функцюнальних характеристик штактних мембран, включаючи властивост1 шорстко! та гладко! поверхш вщповщно у шорсткого та гладкого ендоплазматичного ретикулума. Шорстю мшросоми в основному пов'язаш з синтезом, а гладю - вщносно багап ферментами, вщповщальними за окислювальний метабол1зм чужорщних лшофшьних х1м1чних сполук, а також сполук, що мютять лшофшьш та пдрофшьш групи (до них належать С1М) [4, 10]. До числа основних ферменпв вщносяться НАДФН-цитохром Р-450 редуктаза (оскшьки цитохром с може слугувати акцептором електрона, цей фермент позначають ще як НАДФН-цитохром с редуктаза) та цитохром Р-450. Актившсть мембранозв'язаних ферменпв за умов тривалого впливу С1М вивчено недостатньо, а саме !х урахування е необхщним для всеб1чного розкриття мехашзм1в дп на оргашзм та розроблення засоб1в !х корекцп.
Метою роботи було вивчення активносп НАДФН-цитохром с редуктази та вмюту цитохрому Р-450 у мшросомальнш фракци печшки щур1в на 30-ту добу дп сумшей ¡мщазолшв у дозах 1/10 i 1/100 ДЛ50.
Матерiал та методи дослщження. У робот використано зразки С1М з алкшьними радикалами С7-9 (С1М7-9) i С9-15 (С1М9-15). Експерименти проведено на статевозрших щурах-самцях лшп WAG, масою (180-220) г. Утримання та машпуляцп над тваринами виконувались вщповщно до основних принцишв у сфер1 бюетики. 1х шддавали пероральнш затравщ за допомогою зонда водними розчинами сумшей щоденно одноразово протягом 30 д1б у дозах 1/10 i 1/100 ДЛ50. Середньолетальн дози (ДЛ50) становили: для С1М7-9 - 1,8 г/кг; С1М9-15 - 5,0 г/кг маси тша. Тваринам контрольно! групи вводили вщповщш об'еми питно! води. Дослщження показниюв проводили через 30 д1б тсля початку експерименту. У кожнш груш було по 15 тварин. Забш проводили шляхом декаштацп, попередньо анестезуючи тюпенталом натр1ю. Видшення м1кросомально! фракцп печшки щур1в проводили методом диференцшного центрифугування. Визначення активносп НАДФН-цитохром с редуктази здшснювали у присутност1 акцептора електрошв цитохрому с [6]. Принцип методу грунтуеться на визначенш змши поглинання акцептора електрошв при переход! з окислено! форми у вщновлену. Тнкубацшна сум!ш м!стила
100 мкМ НАДФН, 50 мкМ цитохром с, 330 мкМ NaCN, 100 мМ трис-НС1 буфер (рН 7,4), 40 мкг бшка мшросом. Загальний об'ем шкубацшно! сумiшi складав 3 мл. Вимiрювання швидкостi вiдновлення цитохрому с проводили на двопроменевому спектрофотометрi «Specord UV VIS» при 30°С i довжиш хвилi 550 нм. Актившсть ферменту розраховували за допомогою коефщента молярно! екстинкцп цитохрому с, що дорiвнював 18,5103 см-1М-1. Кiлькiсне визначення цитохрому Р-450 проводили спектрофотометричним методом за допомогою двопроменевого рееструючого спектрофотометра «Specord UV VIS» [6], вимiрюючи величину поглинання комплексу вiдновленого цитохрому Р-450 з монооксидом вуглецю при довжиш хвилi 450 нм. Статистичний анатз даних проводили з використанням комп'ютерного пакета прикладних програм для обробки статистично! шформаци Statistica 6.1 (StatSoft, Inc., США). Первинне статистичне опрацювання даних починали з перевiрки припущення про вiдповiднiсть вибiрок закону гаушвського розподiлу. Кiлькiснi ознаки, що мали нормальний розподiл, описували параметричними характеристиками - середшм значенням показника (М) та середшм квадратичним вщхиленням (s); у разi вiдсутностi нормального розподшу непараметричними -медiаною (Ме) та штерквартильним розмахом. Для порiвняння двох нормальних розподiлiв застосовували t-критерш Стьюдента. Якщо принаймнi один з розподшв не був нормальним, то для порiвняння незалежних вибiрок застосовували критерш Манна-У!тш За критичний рiвень значущостi при перевiрцi статистичних гшотез приймали р<0,05.
Результати дослiдження та Тх обговорення. Вплив дослiджуваних С1М у дозi 1/10 ДЛ50 призводив на 30-ту добу спостереження до статистично значущого (р<0,001), порiвняно з контролем, зниження активностi НАДФН-цитохром с редуктази у мшросомальнш фракци печшки щурiв (табл.). Найбiльш виразним цей вплив був для С1М7-9 (на 35 %), шж для С1М9-15 (лише на 17 %). У дозi 1/100 ДЛ50 сумiшi iмiдазолiнiв викликали протилежнi результати - шдвищення активностi НАДФН-цитохром с редуктази мшросом гепатоцитiв: на 46 % (р<0,001) у випадку С1М7-9 та 20 % (р=0,001) у випадку С1М9-15. Така сама динамiка змiн спостериалася й для вмiсту цитохрому Р-450 (використовуючи термiн «цитохром Р-450», масться на увазi вся рiзноманiтнiсть варiантiв цього бiлка, тому що вщомо юнування множинних форм цитохрому Р-450 [10]) (табл.). Останнш при ди С1М7-9 у дозi 1/10 ДЛ50 статистично значуще (р=0,049), по вщношенню до контрольно! групи тварин, знижувався на 35 %, а у дозi 1/100 ДЛ50 - шдвищувався на 38 %. Для С1М9-15 характерна аналогiчна динамiка змiн, але при порiвняннi з контролем, вони виявлялися недостовiрними (р=0,135 та р=0,18).
Таблиця
Активнiсть НАДФН-цитохром с редуктази та bmíct цитохрому Р-450 у мжросомальнш фракцп печiнки щурiв на 30-ту добу впливу iмiдазолiнвмiсних оргашчних сумiшей (n=15; _Ме [25%; 75%] або M±s)_
Сумш НАДФН-цитохром с редуктаза, нмоль цитохрому с/хв- мг бшка Цитохром Р-450, нмоль/мг бшка
доза, ДЛ50
1/10 1/100 1/10 1/100
С1М7-9 125,0±16,6 280 [235; 326] 0,81 [0,72; 1,1] 1,72 [0,98; 2,32]
p<0,001 p<0,001 p=0,049 p=0,049
С1М9-15 160,1±9,93 230 [210; 267] 0,95±0,272 1,54±0,468
p<0,001 р=0,001 p=0,135 p=0,18
Контроль 192,3±19,6 1,25±0,551
Примгтка: р - рiвень значущостi пор1вняно з контролем.
Таким чином, дослщжуваш органiчнi сумiшi у дозi 1/100 ДЛ50 призводять до зростання активносп НАДФН-редуктазно! системи мшросомально! фракци печшки щурiв та монооксигеназно! системи у цшому. Слiд акцентувати увагу на той факт, що монооксигеназна система е ютотним джерелом утворення активних форм кисню [11]. Перекисне окисления лшщв (ПОЛ) е ще одним типом реакцш окислення у мембранах ендоплазматичного ретикулума. При цьому доведено, що НАДФН-цитохром с редуктаза е початковою ланкою як в реакщях пдроксилювання, так i в процесах ПОЛ [1]. Останнi е також вагомим фактором порушення структурно-функцiонального стану кл^инних мембран. За умов ди С1М у дозi 1/10 ДЛ50 спостерпаеться протилежний ефект. Пригнiчення активносп монооксигеназно! системи печiнки щурiв у цьому випадку може бути пов'язано з дефщитом НАДФН - як основного джерела для функщонування НАДФН-цитохром с редуктази у мшросомах. Електронотранспортш системи мшросом та мiтохондрiй знаходяться у постшному оновленнi бiлкових ферментних комплексiв, метаболiчна активнiсть яких у значнш мiрi залежить вiд змши фiзiологiчних умов та патологiчних
процешв у клггинах [7]. Цей синтез потребуе значного використання АТФ та НАДФ. М^охон^альна та мiкросомальна системи конкурують за зв'язок з НАДФН у процешв його використання для вшьного мiтохондрiального дихання та спряженого функцюнування систем цитохрому Р-450 гладкого ендоплазматичного ретикулума [13]. У цiлому виявлеш змiни активностi мембранозв'язаних ферментних комплекшв е результатом мембранотропних ефектiв С1М.
Узагальнюючи отриманi результати, можна зробити наступш висновки. 1. Тривала штоксикащя органiзму щурiв С1М у дозi 1/10 ДЛ50 викликае iнактивацiю НАДФН-редуктазно! системи мшросомально! фракци печiнки щурiв, що пiдтверджуеться зниженням активностi НАДФН-цитохром с редуктази та вмiсту цитохрому Р-450. 2. Тривала дiя С1М у дозi 1/100 ДЛ50 призводить до пiдвищення активностi НАДФН-цитохром с редуктази та вмюту цитохрому Р-450 у мшросомальнш фракци печiнки щурiв, що свiдчить про активацiю процешв мiкросомального окислення. 3. Змiни активност НАДФН-редуктазно! системи мiкросомальноi фракцii печшки щурiв е однiею з патогенетичних ланок бiохiмiчних механiзмiв мембранотропно! ди С1М, що необхiдно враховувати при розробленш засобiв !х корекцii.
Перспектиеи подальших дослгджень. У подальшому плануетъся провести комплекс дотджень, спрямованих на обхрунтування 6wxiMi4Hux MexaHi3Mie мембранотропноi di'i С1М, зокрема оцшку активностi рецепторних мембранозв 'язаних комплексе.
1. Арчаков А.И. Микросомальное окисление / А.И. Арчаков // - М.: Наука, -1975. - 327 с.
2. Аманжол И.А. Реакция организма на воздействие вредных производ-ственных факторов: оценка профессионального риска / И.А. Аманжол, З.Т. Мухаметжанова, Д.С. Абитаев // - Lambert Academic Publishing, - 2013. - 116 с.
3. Болдырев А.А. Биомембранология / А.А. Болдырев, Е.И. Кяйвяряйнен, В.А. Илюха // - Петрозаводск -: КарНЦ РАН, -
2006. - 226 с.
4. Граник В.Г. Метаболизм экзогенных соединений. Лекарственные средства и другие ксенобютики / В.Г. Гранник // -М.: Вузовская книга, -2006. - 528 с.
5. Жуков В.И. Эколого-гигиеническая характеристика азотсодержащих поверхностно-активных веществ как загрязнителей водоемов / В.И. Жуков, В.В. Мясоедов, С.А. Стеценко [и др.] // - Х. : Торнадо, -2000. - 180 с.
6. Орехович В. Н. Современные методы в биохимии / В. Н. Орехович // - М.: Медицина, -1977. - 371 с.
7. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран / В.П. Скулачев. - М.: Наука, -1989. - 288 с.
8. Цудзевич Б.О. Ксенобютики: накопичення, детоксикащя та виведення з живих органiзмiв / Б.О. Цудзевич, О.Б. Столяр, 1.В. Калшша [и др.] // - Тернопшь: Видавництво ТНТУ iм. I. Пулюя, -2012. - 384 с.
9. Bajpai D. Fatty imidazolines, ^mistey, synthesis, properties and their industrial application / D. Bajpai, V.K. Tyagi // Journal of Oleo Science. - 2006. - Vol. 55, № 7. - P. 319-329.
10. Guengerich F.P. Cytochrome p450 and chemical toxicology / F.P. Guengerich // Chemical Research in toxicology. - 2008. -Vol. 21 (1). - P. 70-83.
11. Karusina I.I. Hydrogen peroxide-mediated inactivation of microcomal cytochrom P-450 during monoxygenase reactions / I.I. Karusina, A.I. Archakov // Free Rad. Biol. Med. -4994. - Vol. 17, № 6. - P. 557-567.
12. Tyagi R. Imidazoline and its derivatives: an overview / R. Tyagi, V.K. Tyagi, S.K. Pandey // Journal of Oleo Science. -
2007. - Vol. 56, № 5. - P. 211-222.
13. Villenve J. Cytochrome H-450 and liver diseases / J. Villenve, V. Pichette // Curr. Drug. Metab. - 2004. - Vol. 5, № 3. - Р. 273-282.
ВЛИЯНИЕ СМЕСЕЙ имидазолинов на АКТИВНОСТЬ НАДФН-ЦИТОХРОМ С РЕДУКТАЗЫ И СОДЕРЖАНИЕ ЦИТОХРОМА Р-450 В МИКРОСОМАЛЬНОЙ ФРАКЦИИ ПЕЧЕНИ КРЫС Максимова И. Г.
В работе с помощью спектрофотометрического метода определена активность ферментов в микросомальной фракции печени крыс на 30-е сутки воздействия промышленных химических загрязнителей окружающей среды - смесей имидазолинов в дозах 1/10 и 1/100 ДЛ50, что является необходимым для всестороннего раскрытия биохимических механизмов их мембранотропного действия. Имидазолинсодержащие смеси с алкильными радикалами С7-9 и С9-15 в дозе 1/10 ДЛ50 вызывают инактивацию НАДФН-редуктазной системы микросом, что подтверждается снижением активности НАДФН-цитохром с редуктазы и содержания цитохрома Р-450. Длительное воздействие
INFLUENCE OF IMIDAZOLINES MIXTURES ON THE ACTIVITY OF NADPH-CYTOCHROME C REDUCTASE AND CYTOCHROME P-450 IN A MICROSOMAL FRACTION OF RAT LIVER Maximova I. G.
The activity of enzymes in a microsomal fraction of rat liver on the 30th day of the effects of industrial chemical pollutants - imidazoline mixtures at doses of 1/10 and 1/100 DL50 was determined with the help of spectrophotometric method, which was necessary for the complete explanation of the biochemical mechanisms of their membrane-tropic action. Imidazoline-containing mixtures with alkyl radicals C7-9 and C9-15 at a dose of 1/10 DL50 cause inactivation of microsomal NADPH reductase system, proven by reduced activity of NADPH-cytochrome c reductase and decrease in cytochrome P-450 level. On the contrary, prolonged exposure of mixtures at a dose of 1/100 DL50 leads to its
смесей в дозе 1/100 ДЛ50, наоборот, приводит к ее активации, что подтверждается повышением активности НАДФН-цитохром с редуктазы и содержания цитохрома Р-450. Выявленные изменения являются одним из патогенетических звеньев биохимических механизмов мембран-нотропного действия смесей имидазолинов, что необходимо учитывать при разработке способов их коррекции.
Ключевые слова: смеси имидазолинов, крысы, микросомы, НАДФН-редуктаза, цитохром Р-450.
Стаття надшшла 13.03.2016 р.
УДК 615.47.014.47:617.7
activation, as evidenced by increased activity of NADPH-cytochrome c reductase and level of cytochrome P-450. The revealed changes can be considered as one of the pathogenetic links of biochemical mechanisms of the membrane-tropic action of imidazoline mixtures that need to be taken into account in the development of methods for their correction.
Key words: mixtures of imidazolines, rats, microsomes, NADPH reductase, cytochrome P-450.
Рецензент Запорожець Т.М.
СУЧАСН1 АНТИМ1КРОБН1 МАТЕР1АЛИ З ПРОЛОНГОВАНИМИ Л1КУВАЛЬНИМИ
ВЛАСТИВОСТЯМИ В ОФТАЛЬМОЛОГИ
В робот наведен HOBi дан про юнетику вившьнення ДКМ з полiмерного покриття нейлону моно 9/0. Показано, що ефективний мюцевий протимжробний режим, створений шовним матерiалом нейлон з полiмерним антимжробним покриттям, завдяки зниженню мкробно! колошзацп шфкованих корнеосклеральних ран в пiсляоперацiйному ^p^i достовipно знижуе частоту розвитку тсляоперацшних гнiйно-запальних ускладнень. Доведено, що загоення iнфiкованих наскpiзних ран повiк, кра! яких адаптованi нейлоном, iмпpегнованим антимжробною композицiею на основi ДКМ, перебкае без рецидиву та хpонiзацii' гншного запалення завдяки прискореному очищенню шфжовано! рани повiки вiд мiкpобного забруднення в два рази (S. aureus (1,93±0,23) - (5,82±0,24) lg КУО/мл) поpiвняно з використанням тpадицiйного шовного матеpiалу (р<0,001). Результати дослiдження свщчать про перспективу застосування шовного матеpiалу нейлон з антимiкpобним покриттям при хipуpгiчнiй обpобцi iнфiкованих поранень органа зору з метою профшактики, лжування пiсляопеpацiйних гнiйно-запальних ускладеннь.
Ключовi слова: шовний матеpiал, нейлон, декаметоксин®, корнеосклеральна рана, рана повiки, S. aureus.
Протягом останшх роюв почаспшали випадки поеднаних та комбшованих важких травматичных пошкоджень ока та його допом1жного апарату. Для збереження зорових функцш та ока як органу тактика лшування таких пащенпв передбачае застосування антибютикотерапп, яка на сьогодшшнш день недостатньо профшактуе розвиток гр1зних шфекцшних ускладнень в шсляоперацшному перюдь Посттравматичш гншно-запальш ускладнення проникаючих поранень ока зустр1чаються у 2,6 - 54,2% випадюв, за наявносп штраокулярного стороннього тша показник зростае до 1,3 - 61,0%, суттево ускладнюючи перебп репаративних процешв [1-2]. Актуальним залишаеться розробка нових антимшробних засоб1в, розширення показ1в та шлях1в введения вже юнуючих, надання пролонгованого антимшробного захисту матер1алам медичного призначення. Особливо перспективними в цьому плаш е шовний матер1ал, який застосовуеться у "вхщних воротах" шфекцп для х1рург1чно! обробки поранень ока та його допом1жного апарату.
Враховуючи зростання резистентност у м1кроорган1зм1в до наявного арсеналу антибютиюв, варто спрямувати увагу на розширення сфери застосування антисептиюв, що володдать рядом беззаперечних переваг. Вiтчизияний антисептик декаметоксин (ДКМ) волод1е високою актившстю та широкою сферою застосування в офтальмологи [3-5].
Метою роботи було дослщити кшетику вивiльнения антисептика з шовного матерiалу нейлону, iмпрегнованого антимшробною композицiею декаметоксину, та його вплив на процес пiсляоперацiйного загоення нас^зних iнфiкованих корнеосклеральних ран, поранень повш.
Матерiал та методи дослiдження. Нейлон (моно) 9/0 i 6/0 зi шпательними голками iмпрегнували розчином антишкробно! композицп антисептика ДКМ (пат. и201205692) 10 хвилин, модуль оздоблювано! ванни 5, висушували стутнчасто на повiтрi при температурi 18 - 22 ПС. При цьому на шовному матерiалi утворювалась полiмерна плiвка, у якш утримувався ДКМ. Кiнетику вившьнення ДКМ з полiмерного покриття нейлону моно 9/0 (атравматичний шовний мат^ал дiаметром 0,044 мм, довжиною 30 см, ТУ У 331.1-30468133-001-2006) вивчали на моделi (нейлоновi нитки 5/0 монофшаментш, дiаметром 0,125, довжиною 70 см, ТУ У 24.4 -13725905002-2007) у зв'язку iз малим дiаметром об'екту дослiджения. Моделювання можливе i достовiрне при виконаннi двох умов: економiчнiсть (зручнiсть роботи з моделлю, дешевизна модел^ i традуктившсть моделi (можливiсть перенесення результатiв дослщжень з моделi на оригiнал) [6].
Нитка 5/0 е монониткою з гладенькою поверхнею, подiбною поверхш нитки 9/0. Поверхня ниток практично дорiвнюе !х зовнiшнiй поверхнi, а процеси адсорбцп-десорбцп ДКМ на поверхш
