CC BY
12
УДК 613-615.092.044:616.099.036 Кратенко P. I.
Б10Л0Г1ЧН1 ЕФЕКТИ 15-КРАУН-5 ПРИ ДМ НА АКТИВНЮТЬ СИСТЕМИ М1КР0С0МАЛЬН0Г0 0КИСНЕННЯ ТА В1ЛЬН0РАДИКАЛЬН1 ПР0ЦЕСИ У
П1ДГ0СТР0МУ ЕКСПЕРИМЕНТ1
Хармвський нацюнальний педагопчний ушверситет ¡мен1 Г.С. Сковороди (м. Харкш)
Робота е фрагментом НДР «Мехаызм бюлопчно1 дм ксенобютиюв на оргаызм теплокровних тварин» (№ державно'!' реестрацп 0111U011921).
Вступ. Краун-етери являють собою макрогете-роциклiчнi системи з 9 - 60 атомами в цикл^ з яких третину складають атоми етерного кисню, роздi-лен мiж собою етановими групами [15]. Найбтьш важливою властивiстю макроциклiчних полiетерiв е ¿хня здатнiсть утворювати стмю комплекси з солями лужних та iнших металiв, залучаючи катион ме-талу до порожнини свое' молекули [11]. Bластивiсть краун-етерiв «коронувати» катiон, а також короно-подiбна молекулярна структура ¿х макроцикла були вирiшальним фактором для американського хiмiка-органiка C.J. Pedersen при пiдборi назви для цього нового класу синтетичних сполук («crown» - корона) [15]. Разом з вщходами хiмiчного виробництва кра-ун-етери надходять у бюсферу та можуть впливати на здоров'я населення. Для бiльшостi представни-кiв краун-сполук немае единого стандарту щодо гранично-допустимих концентрацiй (ГДК) у водних об'ектах та визначення точного мехаызму ¿х бюло-гiчноi дм на органiзм людини та теплокровних тва-рин.
Мета дослщження. Вивчити вплив 15-краун-5 на активнiсть системи мiкросомального окиснення та вiльно-радикальнi процеси в органiзмi щурiв у пiдгострому експериментг
0б'ект i методи дослщження. Експеримент проводили на бiлих щурах-самцях лiнii Biстар трьох-мiсячного вiку. 15-краун-5 вводили тваринам що-денно у виглядi водного розчину через зонд у шлу-нок протягом одного мюяця у 1/100 LD50 та 1/1000 LD50, що становило 13,5 та 1,35 мкг/кг. Контроль^ тварини отримували водопровiдну воду. По закш-ченню пiдгострого експерименту щурiв обох груп забивали декаптащею гiльйотинним ножем, попе-редньо анестезуючи тiопенталом натрт (50 мг/кг внутрiшньопорожнинно) [8].
Проведення експерименту здмснювалось is дотриманням принцитв бiоетики, що викладен у Хельсинсьюй декларацп Bсесвiтньоi медично' асо^-ацп про гуманне ставлення до тварин, а також згщно до Закону Украши «Про захист тварин вщ жорстоко-го поводження» вiд 15.12.2009 р. № 1759-VI та «За-гальних етичних принципiв експериментiв на твари-нах» (Кив, 2001).
Одним iз найбiльш iстотних факторiв, що визна-чають бiологiчну активнiсть ксенобютиюв, е 1хня бiотрансформацiя в органiзмi [4,7,10]. За своею молекулярною оргаызащею ферментна система метаболiзму ксенобiотикiв являе собою вбудова-ний у мембрани ЕПР гепатоци^в електронно-тран-спортний ланцюг, який е специфiчним до НАДФН2 i залучае до себе, як термшальну ланку, гемопротеiн цитохром Р-450. До складу даноi системи надходять також цитохром b5, НАДФН-цитохром Р-450-редуктаза, НАДН-цитохром b5-редуктаза. Основну роль у метаболiзмi ксенобютиюв виконують НАДФН-залежнi системи транспорту електроыв [1,9]. Стан системи мiкросомального окиснення оцiнювали за дихальною та ферментативною активнютю, вмiстом цитохромiв b5 i Р-450. Мембрани ендоплазматично-го ретикулуму видiляли за методом Komoth, Narayn
[16] у модифiкацii [12]. Визначення швидкос^ спо-живання кисню суспензieю мiкросом проводили за допомогою закритого платинового кисневого елек-троду Кларка полярографiчним методом [12]. Швид-кiсть окиснення НАДФН2 визначали за допомогою флюориметричного методу, що базуеться на вимi-рюваннi швидкостi падшня флюоресценцii у процес1 окиснення. Визначення активнос^ оксидоредуктаз проводили у присутнос^ акцептора електронiв - ци-тохрому с [12]. Принцип методу базуеться на визна-чены змiни поглинання акцептора електронiв при переходi з окиснено( форми у вiдновлену. Bимiрю-вання швидкостi вiдновлення цитохрому с проводили на двопроменевому спектрофотометрi "Specord UV VIS" (НДР) при 30° С при довжиы хвилi 550 нм. Активнiсть оксидоредуктаз розраховували за допомогою коефiцieнта молярно: екстинкцii цитохрому с. що складав 18,5103 см-1М-1 [12]. Кiлькiсне визначення цитохромiв b5 та Р-450 проводили в суспензп мi-кросом методом диференцмно( спектрофотометрii
[17], як описано у [12]. При визначены цитохрому b5 враховували рiзницю в поглинаны окисненоi та вiдновленоi форми гемопроте1ыв. При визначенн1 цитохрому Р-450 вимiрювали величину поглинання комплексу вщновленого цитохрому Р-450 з монооксидом вуглецю при довжинi хвилi 450 нм. Вмют цитохромiв визначали за допомогою двопромене-вого рееструючого спектрофотометра "Specord UV VIS" (НДР). Для визначення швидкос^ реакцп окис-лювального деметилювання, субстратом яко' був ксенобютик p-нiтроанiзол, суспензiю мiкросом до-
давали у середовище ¡нкубацй, шщюючи II внесениям НАДФН. Зупиняли реакц\ю додаванням розчину трихлороцтово1 кислоти. Реакц\йну сум\ш обробля-ли лугами, зсаджували б\лок центрифугуванням \ спектрофотометрично визначали р-н\трофенол при довжин\ хвил\ 436 нм на спектрофотометр! СФ-46.
Визначення д\енових кон'югат\в е чутливим тестом на наявнють у бюлопчному об'ект\ г\дро-пероксид\в пол\ненасичених жирних кислот. Вони виявляються спектрофотометричним методом, бо здатн\ поглинати в ультрафюлетовм област\ спектра (у =233 нм). Попередню очистку проводили шляхом екстракцп гептано-\зопропаноловою сум\шшю [6]. Кшькють д\енових кон'югат\в розраховували, ви-ходячи ¡з коефщ\ента молярно1 екстинкцп е=2,2-105 моль-1-см-1.
Вм\ст малонового д\альдег\ду визначали за до-помогою реакцм м\ж д\альдег\дом та т\обарб\туро-вою кислотою, яка за умов високо! температури та кислого середовища прот\кае з утворенням забарв-леного комплексу, що мае максимум поглинання при довжин\ хвил\ 532 нм [14]. Кшькють малонового д\альдег\ду розраховували, виходячи з молярного коеф\ц\ента екстинкцп 8=1,56-105моль-1-см-1.
Утворення активних форм кисню та подальш\ в\льнорадикальн\ перетворення лтщв та ¡нших ор-ган\чних сполук е основою ктмтинно! хемшюмшес-ценцп [13], тому було проведено оц\нку спонтанно! бюхемтюмшесценцп (БХЛ) та стимульовано! ¡онами вщновленого зал\за й пероксидом водню у сироват-ц\ кров\ експериментальних тварин за дм 15-краун-5. Величини цих показник\в вим\рювали на хемтюм\-нометр\ ХЛМЦ1 - 01 [13]. Р\вень спонтанно! БХЛ ха-рактеризуе, у першу чергу, штенсивнють в\льнора-дикального окиснення лтщ\в [2,3]. Було дослщжено р\вень спонтанно! хемшюмшесценцп гомогенат\в головного мозку, печ\нки та сироватки кров\ щур\в п\д впливом 15-краун-5. Проби сироватки або гомо-генату пом\щали до камери, що не пропускав св\тла, \ термостатували при температур! 38°С. Вим\рювали фон приладу з пустою кюветою. Пот\м вим\рювали спонтанну БХЛ в дослщн\й проб\. Для оптим\зацп умов роботи хемтюм\нометру проводили 10 ци-кл\в вим\рювання фону та сигналу дослщно! проби з наступним розрахуванням середн\х значень. 1н-тенсивн\сть спонтанно! БХЛ розраховували шляхом вщн\мання середнього значення фону ¡з середнього значення сигналу дослщно! проби.
Методи дослщження процес\в перекисного окиснення за допомогою ¡ндуковано! хемшюмшесценцп базуються на активацп процес\в БХЛ шляхом використання ряду х\м\чних реагент\в [3,13]. Поси-лення цього процесу надлишком ¡он\в двохвалент-ного зал\за пояснюеться катал\зом розщеплення орган\чних та неорган\чних гщропероксид\в з утворенням вшьних радикал\в. У зв'язку з цим, ¡нду-кована Ре2+ БХЛ е вщображенням вм\сту у систем\ гщропероксид\в. Дослщження Ре2+-шдуковано! хемшюмшесценцп проводили на гомогенатах мозку та печ\нки \ у сироватц\ кров\. До оптично прозоро! термостатовано! при 30°С кювети додавали 3,5 мл 0,020 М фосфатного буферу (рН 7,45), до якого додавали 0,5 мл дослщно'! сироватки (або гомогена-
ту), п\сля чого перем\шували розчин. Одночасно проводили реестрац\ю хемшюмшесцентного фону хемшюмшометру при зад\афрагмованому ФЕУ. Пот\м вщкривали шторку прибору, через 1 хвилину додавали 1 мл 5-10-2 М розчину Ре804-7Н20 та рее-стрували хемшюмшограму протягом 6 хвилин. Дал\ знову додавали розчин сол\ зал\за та вим\рювали хемшюмшесценц\ю ще 4 хвилини. П\сля цього за-кривали шторку \ протягом одн\е! хвилини запису-вали фон прибору.
Система Н2О2-шдуковано! БХЛ дозволяе оц\ни-ти ефективн\сть генерацп, перш за все, гщроксиль-ного радикала з пероксиду водню завдяки реакцп Фентона [2,13]. Хемшюмшесценц\ю, ¡ндуковану пероксидом водню, дослщжували у сироватц\ кров\ та гомогенатах мозку \ печ\нки. До оптично прозоро! термостатовано! при 30°С кювети наливали 5 мл 0,9% ЫаС!, пот\м додавали 0,5 мл дослщно! сироватки (або гомогенату), п\сля чого перем\шу-вали розчин. Одночасно проводили реестрац\ю хемтюмшесцентного фону хемшюмшометру при зад\афрагмованому ФЕУ. Пот\м вщкривали шторку прибору, протягом 20 секунд записували спонтанну хемшюмшесценц\ю, пот\м додавали 0,25 мл 2% Н2О2 та реестрували хемшюмшограму протягом 302 секунд.
Результати дослщження та Тх обговорення.
У гепатоцитах щур\в за умов впливу 15-краун-5 у 1/100 та 1/1000 1_050 спостер\гали статистично достов\рне пщвищення показник\в, що характеризуют швидюсть м\кросомального окиснення, пор\вняно з контролем, як на 15-ту, так \ на 30-ту добу експерименту (табл. 1). Д\я 15-краун-5 також призводила до пщвищення швидкост\ окиснення НАДФН2 за умов впливу 1/100 та 1/1000 1_050 як на 15-ту, так \ на 30-ту добу експерименту (на 122%
\ 161% (1/100 1_050) та 95% \ 93% (1/1000 1_050)) (табл. 1). 50 50
Про активац\ю системи м\кросомального окиснення в орган\зм\ щур\в за д\! досл\джувано! речо-вини свщчить також достов\рне п\двищення вм\сту цитохрому Р-450 як на 15-ту, так \ на 30-ту, пор\вня-но з контролем (табл. 2) на 92% \ 138% вщповщно.
Досл\джуваний краун-етер не впливав на вм\ст цитохрому Ь5. Це дозволяе вважати, що перенос електрон\в через цитохром Ь5 не являе собою л\м\-туючу ланку в перетворенн\ краун-сполук моноок-сигеназною системою.
Отриман\ результати корелювали з п\двищен-ням деметилазно! активност\ м\кросом. Так, за умов дм 15-краун-5 у 1/100 та 1/1000 1_050 статистично достов\рно зростали процеси деметилю-вання на 15 \ 30-ту добу експерименту, пор\вняно з контрольною групою тварин. Досл\джувана ре-човина також статистично достов\рно п\двищувала НАДФН- \ НАДН-цитохром с-редуктазну активн\сть, тим самим чинила вплив на дв\ електронно-тран-спортн\ м\кросомальн\ системи орган\зму експериментальних тварин: НАДФН-цитохром Р-450 \ НАДН-цитохром Ь5 (табл. 1).
Таким чином, макроцикгмчний етер 15-краун-5 в орган\зм\ щур\в призводив до активац\! моноокси-
Taблиця 1.
Bплив 15-кpayн-5 нэ пoкaзники мiкpocoмaльнoгo oкиcнeння гeпaтoцитiв eкcпepимeнтaльниx твapин ça yмoв пiдгocтpoгo eкcпepимeнтy (M±m, n=10)
Пoкaзник Дoбa eкoпepи-мeнтy Koнтpoль 15-кpayн-5
1/100 ld50 1/1000 ld50
Швидкioть oпoживaння киoнюa 15 1,29+0,10 2,92+0,21* 2,35+0,22*
30 1,40+0,13 3,72+0,36* 2,81+0,26*
Швидкють oкиoлeння HДДФH2b 15 3,07+ 0,24 6,74+0,52* 5,92+0,55*
30 3,12+ 0,30 8,14+0,76* 6,03+0,68*
Цитoxpoм P-450c 15 0,86+ 0,0В 1,65+0,15* 1,25+0,10*
30 0,90+0,08 2,14+0,19* 1,58+0,16*
^TOxpoivi b5c 15 0,60+ 0,03 0,59+0,06 0,58+0,06
30 0,64+ 0,05 0,56+0,04* 0,58+0,04
Дeмeтилaзad 15 6,02+ 0,59 12,31+1,01* 10,53+1,10*
30 6,23+ 0,60 17,32+1,61* 17,32+1,61*
HДДФH-цитoxpoм с-peдyктaзae 15 195+ 20 296+22* 250+23*
30 202+ 20 381+37* 271+17*
HAДH-цитoxpoм с-peдyктaзae 15 937+ 87 1473+141* 1304+101*
30 956+90 1619+155* 1405+105*
Пpимiтки: a - ш^ль O2/xß Mr бшка,b - ш^ль HAДФH2/xв■мг бшка,c - нм^ь/иг бiлкa, d - ш^ль р-ытрофенолу/хвмг бшка, * - р<0,05 вщ-mocmo кoнтpoлю.
гeнaзнoÏ ^а^ми гeпaтoцитiв, як oднoгo з ocнoвниx гeнepaтopiв aктивниx фopм киcню.
Peзyльтaти дocлiджeнь пoкaзaли, щo нa 15-ту i 30-ту дoбy eкcпepимeнтy дocлiджyвaнa peчoвинa y 1/100 i 1/1000 LD50 пpизвoдилa дo пiдcилeння пpo-цeciв ПОЛ, дocтoвipнoгo пiдвищyючи вмют ДK i МДД y cиpoвaтцi кpoвi eкcпepимeнтaльниx твapин (тэ6л. 2).
Утвopeння aктивниx фopм киcню тa пoдaльшi вiльнopaдикaльнi peaкцiÏ лiпiдiв тa iншиx cпoлyк е ocнoвoю клiтиннoÏ БXЛ [2,13], тoмy нaми бyлo пpo-вeдeнo oцiнкy cпoнтaннoÏ БXЛ тa БXЛ, cтимyльo-вaнoÏ ioнaми вiднoвлeнoгo зaлiзa Fe2+, пepeкиcoм вoдню y твapин зa дiÏ 15-кpayн-5. Пpи вимipювaннi cпoнтaннoÏ БXЛ cиpoвaтки кpoвi бyлo виявлeнo, щo дocлiджyвaнa cпoлyкa cyттeвo пiдвищyвaлa im^-cивнicть (нa 76%), пopiвнянo з кoнтpoлeм. Пpи дo-cлiджeннi cпoнтaннoÏ БXЛ гoлoвнoгo мoзкy ^ocre-piгaлocя нeзнaчнe пiдвищeння iнтeнcивнocтi цьoгo пoкaзникa (31%). Для пeчiнки iнтeнcивнicть cпoнтaн-нoÏ БXЛ мaлa тeндeнцiю дo дocтoвipнoгo пiдвищeн-ня зa yмoв дiÏ дocлiджyвaнoÏ cпoлyки (тэ6л. 3).
Bплив 15-кpayн-5 нa iнтeнcивнicть iндyкoвaнoÏ Fe2+ БXЛ cиpoвaтки кpoвi пpизвoдилa дo знaчнoгo пiдвищeння цьoгo пoкaзникa - нa 250% пopiвнянo з
кoнтpoлeм. Пiдвищeння БXЛ гoмoгeнaтy гoлoвнoгo мoзкy бyлo тaкoж cyттeвим y твapин eкcпepимeн-тaльнoÏ гpyпи (тaбл. 3). Для БXЛ гoмoгeнaтy пeчiн-ки, дocлiджyвaнa peчoвинa cтaтиcтичнo дocтoвipнo пiдвищyвaлa iнтeнcивнicть цьoгo пoкaзникa - нa 100%, пopiвнянo з кoнтpoлeм. Пocилeння iнтeнcив-нocтi БXЛ нaдлишкoм ioнiв двoxвaлeнтнoгo зaлiзa пoяcнюeтьcя кaтaлiзoм poзклaдeння opгaнiчниx тa нeopгaнiчниx гiдpoпepoкcидiв з yтвopeнням вiльниx paдикaлiв i пpиcкopeнням вiльнopaдикaльнoгo o^c-нeння, тoмy iндyкoвaнa Fe2+ xeмiлюмiнecцeнцiя вдо-бpaжae вмicт y cиcтeмi гiдpoпepoкcидiв. Oтpимaнi peзyльтaти cвiдчaть пpo пiдвищeний вмicт гiдpoпe-poкcидiв ocoбливo y cиpoвaтцi кpoвi тa пeчiнцi e^-пepимeнтaльниx твapин зa д iÏ 15-кpayн-5 нa 30-ту дoбy cпocтepeжeння.
Poзклaдeння пepoкcидy вoдню в opгaнiзмi здм-cнюeтьcя зaвдяки дм кaтaлaзи, глyтaтioнпepoкcидa-зи, y гpaнyлoцитax - зa дoпoмoгoю мieлoпepoкcи-дaзи з yтвopeнням гiпoxлopитнoгo aнioнy, a тaкoж y peaкцiÏ Фeнтoнa. Peaкцiя Фeнтoнa пpoтiкae y пpиcyт-нocтi ioнiв мeтaлiв пepeмiннoÏ вaлeнтнocтi, зoкpeмa двoxвaлeнтнoгo зaлiзa. У пpoцeci ^eÏ peaкцiÏ пepoк-cид вoдню poзклaдaeтьcя з yтвopeнням вeльми pea^ цiйнocпpoмiжнoгo гiдpoкcильнoгo paдикaлy [2,3,4].
Taблиця 2.
Bплив кpayн-eтepiв нэ вмicт дieнoвиx кoн'югaтiв i мaлoнoвoгo дiaльдeгiдy в cиpoвaтцi кpoвi eкcпepимeнтaльниx твapин (M±m, n=10)
Peчoвинa Дoзa, LD50 Дieнoвi ra^ioTa™ Maлoнoвий дiaльдeгiд
дoбa cпocтepeжeння
15 30 15 30
Koнтpoль 2,76 + 2,670,18 0,91 + 0,94+
15-кpayн-5 1/100 5,07+ 6,820,23* 3,85+ 4,32+
1/1000 4,43 + 4,85+ 3,04+ 3,60+
Пpимiтки: вмioт виpaжeний в мкмoль/л; * - p<0,05 вд^ню кoнтpoлю.
Таблиця 3.
2+
Bплив 1/1000 LD50 кpayн-eтepiв на iнтeнcивнicть cпoнтaннoГ та iндyкoвaнoГ Fe бioxeмiлюмiнecцeнцГГ cиpoвaтки кpoвi та гoмoгeнaтiв opгaнiв в opгaнiзмi ùypie
(M±m, n=10)
Peчoвинa Cиpoвaткa кpoвia Гoлoвниймoзoкb Пeчiнкab
cпoнтaннa iндyкoвaнa cпoнтaннa iндyкoвaнa cпoнтaннa iндyкoвaнa
Koнтpoль 4,12± 0,32 84,3± 8,1 58,82± 5,77 321,4+ 33,0 46,72+ 4,32 266,1± 25,46
15-кpayн-5 7,28± 0,71* 295,4± 30,0* 77,32± 7,20* 432,8± 38,5* 87,64± 7,95* 533,2± 48,6*
пpимiткa: a - Iмп/c■мл cиpoвaтки, b - гмп/ct ткaнини; * - p<0,05 вIднocнo кoнтpoлю
OcкIльки вIльнI paдикaли yтвopюютьcя тIльки y двox ocтaннix Iз чoтиpьox пepeлIчeниx шляxIв, a iнтeнcив-нIcть БXЛ вимIpювaли y cиpoвaтцi кpoвI (a вoнa нe мae фopмeниx eлeмeнтIв) тa y гoмoгeнaтax пeчIнки i гoлoвнoгo мoзкy, oчeвиднo, зpocтaння Iнтeнcивнocтi БXЛ y paзi дoдaвaння eкзoгeннoгo пepoкcидy вoдню бyлo вIдoбpaжeнням дocтyпнocтI IoнIв мeтaлiв з пe-peмIннoю вaлeнтнIcтю, зoкpeмa, нaявнocтI Fe2+. Цe пpипyщeння cпiвпaдae з лIтepaтypними дaними [13], в якиx ввaжaeтьcя, щo cиcтeмa H2O2-IндyкoвaнoÏ БXЛ дoзвoляe oцIнити eфeктивнIcть гeнepaцГi, пepш зa вce, OH' - paдикaлa з пepoкcидy вoдню, зaвдяки peaкцIÏ Фeнтoнa. Peзyльтaти eкcпepимeнтIв cвiдчaть пpo пIдвищeнy дocтyпнIcть IoнIв мeтaлiв з пepeмIн-нoю вaлeнтнIcтю ocoбливo y cиpoвaтцI кpoвI тa пe-ч1нц1 зa дм 15-кpayн-5 нa 30-ту дoбy eкcпepимeнтy (табл. 4).
eкcпepимeнтaльниx твapин, щo мoжe 6ути пoв'язaнo aбo з бIльшoю кoнцeнтpaцieю нeгeмoвoгo зaлIзa, aбo з бшыхюю cпpoмoжнIcтю дo вIднoвлeння зaлIзa.
Moлeкyляpнi мexaнIзми бIoлoгIчнoÏ дм кceнoбIo-тиюв включaють двa взaeмoпoв'язaниx пpoцecи: пo-шкoджyючи д1ю тoкcинIв I кoмпeнcaцiю пopyшeнь, cпpямoвaниx нa пIдтpимкy гoмeocтaзy. Koмпeнca-тopнI пpoцecи в xiмiчнiй пaтoлoгIÏ пoдIляютьcя нa двa типи: пepший включae мexaнIзми, пoв'язaнI з функ-цIoнyвaнням мoнooкcигeнaзниx cиcтeм глaдкoгo e^ дoплaзмaтичнoгo peтикyлyмy й cyпpяжeнoю з ними peaкцIeю кoн'югaцIÏ [1]. ^ в ocнoвнoмy мexaнIзми дeтoкcикaцIÏ лIпoтpoпниx cпoлyк. Дpyгий тип пoeднye мoлeкyляpнI мexaнIзми, лoкaлIзoвaнI y цитoзoлi, м1-тoxoндpIяx, пepoкcиcoмax I лiзocoмax. Цe мexaнIзми дeтoкcикaцIÏ вoдopoзчинниx cпoлyк [4].
Peзyльтaти eкcпepимeнтIв дeмoнcтpyють п^и-
Таблиця 4.
Bплив 1/1000 LD50 кpayн-eтepiв на iнтeнcивнicть cпoнтaннoГ та iндyкoвaнoГ пepoкcидoм вoдню xeмiлюмiнecцeнцГГ cиpoвaтки кpoвi та гoмoгeнaтiв opгaнiв в opгaнiзмi ùypie
(M±m, n=10)
Peчoвини Cиpoвaткa кpoвia Гoлoвний мoзoкb Пeчiнкab
cпoнтaннa iндyкoвaнa cпoнтaннa iндyкoвaнa cпoнтaннa iндyкoвaнa
Koнтpoль 4,12+0,32 415,6+40,5 58,82+5,77 3158+225 46,72+4,32 2614+217
15-кpayн-5 7,28+0,71* 728,3+70,9* 77,32+7,20* 4028+401* 87,64+7,95* 3981+377*
пpимiткa: a - Iмп/c■мл cиpoвaтки, b - гмп/ct ткaнини; * - p<0,05 вIднocнo кoнтpoлю.
БIoxIмIчнI мexaнiзми IнIцIaцIÏ, poзгaлyжeння тa гaльмyвaння лaнцюгoвиx peaкцIй y бIoлoгIчнoмy ce-peдoвищi включaють Ioни нeгeмoвoгo зaлIзa, як мaють нecпapeний eлeктpoн, як нeoбxiдний кoмпo-нeнт циx пpoцecIв [2]. З oднoгo бoкy, Ioни Fe2+ cпpия-ють aктивaцIÏ пepeкиcнoгo oкиcнeння л1п1д1в, шляxoм yтвopeння нoвиx лaнцюгiв зaвдяки взaeмoдIÏ з ^po-пepoкcидaми л1п1д1в тa гeнepaцIÏ гIдpoкcильнoгo pa-дикaлa y peaкцIÏ Фeнтoнa [3,13]. З minora бoкy, Fe2+ !oœe взaeмoдIяти з paдикaлaми, пpивoдячи дo o6p^ ву лaнцюгa. Пpи низькиx кoнцeнтpaцIяx гIдpoпepoк-cидIв тa нaдлишкy IoнIв Fe2+ з бIльшoю вipoгiднicтю 6удуть вIдбyвaтиcя peaкцIÏ з yчacтю paдикaлIв, тoбтo Ioни Fe2+бyдyть виcтyпaти у якocтI aнтиoкcидaнтнoÏ cиcтeми. У paзi pIвниx aбo близькиx кoнцeнтpaцiй у кл1тин1 гIдpoпepoкcидIв тa юыв зaлIзa, Ioни Fe2+ вига-нують poль cильнoгo кaтaлIзaтopa пpoцecIв ПOЛ [2]. Taким чинoм, кoнцeнтpaцIя юыв Fe2+ е фaктoм, ^po-мoжним peгyлювaти пpoцec пepoкcидaцIÏ л 1п1д1в. Дaнi, щo xapaктepизyють H2O2-Iндyкoвaнy БXЛ, cвiд-чaть пpи 61льшу eфeктивнIcть гeнepaцIÏ OH-paдикaлa з пepoкcидy вoдню зaвдяки peaкцIÏ Фeнтoнa у пeчIнцi
лeння пpoцecIв мIкpocoмaльнoгo oкиcнeння в пeчiнцi твapин, щo пIдтвepджyeтьcя збIльшeнням швидкocтi cпoживaння киcню мIкpocoмaми, швидкocтI o^c-лeння HAДФH2, зpocтaнням дeмeтилaзнoÏ, HAД(Ф) H-цитoxpoм с-peдyктaзнoÏ aктивнocтI, пIдвищeнням вмюту цитoxpoмy P-450. Уpaxyвaння чacoвиx xapa^ тepиcтик динaмIки зм1ни циx пoкaзникiв дoзвoляe зpoбити виcнoвoк пpo iндyкoвaний бIocинтeз мIкpo-coмaльниx фepмeнтIв мoнooкcигeнaзнoÏ cиcтeми. 15-кpayн-5 мoжнa вIднecти дo IндyктopIв мIкpoco-мaльниx мoнooкcигeнaз n^po^ra cпeктpy дм; в1н здaтeн пpиcкopювaти бIoтpaнcфopмaцIю чиcлeнниx кceнoбIoтикIв, з61льшуючи вмют й aктивнIcть цитox-poмy P-450, a тaкoж aктивyючи HAДФH-цитoxpoм P-450-peдyктaзy. ПIдcилeння цитoxpoмpeдyктaзнoÏ aктивнocтI мiкpocoмaльнoÏ фpaкцIÏ пeчIнки eкcпe-pимeнтaльниx твapин внacлIдoк IндyкyючoÏ дм кpa-yн-eтepy пpизвoдить дo „нaпpyжeння" cиcтeми 6io-тpaнcфopмaцIÏ кceнoбIoтикIв.
AктивaцIя мoнooкcигeнaзнoÏ cиcтeми гeпaтoцитIв cyпpoвoджyeтьcя, як пpaвилo, гeнepaцieю cyпepoк-
сидних радикал1в, перекису водню, оргаычних пере- hoi дм", яка завдяки своУй стабтьност проникае в yci
кис1в, посиленням перекисного окиснення лтщв [2]. структури клiтини, вiддаленi вщ мicця утворення, з
Утворення з полшенасичених жирних кислот ре- наступним ¿х пошкодженням [14]. човин з супряженими подвмними зв'язками - дieно- Висновки
вих кон'югатiв - е одним з основним критерпв вiль- 1. Доcлiджyваний 15-краун-5 пiдcилюe процеси
норадикального окиснення. утворення дieнiв, а потiм мiкроcомального окиснення за рахунок пiдвищення
гiдр0перекиciв лiпiдiв у &°мембранах сприяе виник- швидкоcтi споживання кисню, окиснення НАДФН2,
ненню в пдр°ф°бн°му лiпiдномy бiшарi гiдр0Фiльних iндyкованого бiоcинтезy цитохрому Р-450. клаcтеPiв, у ™ м°же пр°никати в0да, сприяючи р°з- 2. Продукти бiотранcформацii краун-етеру дозо-
ПМУПРННШ м р м ft пя и и я тя kTtik1 FP2+ um мпи^р inm/k^/Rp-
залежно пщсилюють процеси вiльнорадикального окиснення, що проявляеться в активацп перекисного окиснення лт^в (накопичення дieнових кон'югатiв
ти реакцю розгалуження ланцюгiв i посилення перекисного окиснення лтщв.
Малоновий дiальдегiд, один з вторинних продук- , . .
. п^п та малонового дiальдегiдy), пщвищены рiвня бюхемг
тiв ПОЛ, е поперечно-зшиваючим бiфyнкцiональним ...
реагентом, що може взаeмодiяти з амiно-вмicними бюмолекупами (амiнокиcлотами, бiлками, нуклео-
люмiнеcценцil.
Перспективи подальших дослщжень. В по-
тидами, нуклешовими кислотами, амiновмicними даль0°му бул° б цiкаво д0cлiдити вплив краун-сп°-
вуглеводами й лiпiдами) з утворенням високомоле- лУк на фоcфолiпiДний cклад, рецепт°рний апарат
кулярних продyктiв з внутршньо- та мiжмолекyляр- мембран к^тт та п°стрецепт°рну ланку трансмюи
ними зшивками типу Шиффових сполук. Малоновий внyтрiшньоклiтинного сигналу в органiзмi теплокров-
дiальдегiд розглядаеться як одна з молекул „дистант- них тварин.
Л1тература
1. Archakov A.I. Mikrosomalnoe okislenie / A.I. Archakov. — M.: Nauka, 1975. - 327 s.
2. Baraboy V.A. Okislitelno-antioksidantnyi homeostaz v norme i patologii / V.A. Baraboy, D.A. Sutkovoy. — K.: Naukuva Dumka, 1997. - 420 s.
3. Vladimirov Yu.A. Otsenka antiokislitelnoy i antiradikalnoy aktivnostei veshestv i biologicheskih ob'ektov s pomoshiu zhelezoinitsiirovanoi hemiliuministsentsii / Yu.A. Vladimirov, M.P. Sherstnev, T.K. Azimbaev // Biofizika. - 1992. - № 6. -S. 1041-1047.
4. Zhukova T.V. Adaptatsionnye reaktsii organizma kak kriterii reglamentatsii himicheskih zagriazniteley okruzhayushey sredy / T.V. Zhukova // Gigiena I sanitaria. - 1997. - № 6. - S. 66-68.
5. Kagan V.E. Izuchenie mehanisma fermentativnogo NADFH-zavisimogo perekisnogo okislenia lipidov v membranah endoplazmaticheskogo retikuluma / V.E. Kagan, E.M. Serbinova, A.A. Minin // Biohimiya. - 1985. - № 6. - S. 986-991.
6. Kauhin A.B. Ekstraktsia lipidov smes'iu geptan-izopropanol dlia opredelenia dienovyh kon'iugatov / A.B. Kauhin, B.S. Ahmetova // Lab. Delo. - 1987. - № 6. - S. 335-337.
7. Lakin K.M. Biotransformatsia lekarstvennyh veshestv / K.M. Lakin, Yu.F Krylov. — M.: Meditsina, 1981. - 304 s.
8. Lang S.M. Laboratornaya krysa / S.M. Lang, R.P. Wilson // Laboratornye zhivotnye. - 1993. — № 2. - S. 101-110.
9. Lemeshko V.V. Sistema mikrosomalnogo okislenia pri razvitii i starenii organisma / V.V. Lemeshko // Biohimia. - 1980. - № 11. -S. 1964-1969.
10. Lutsevich I.N. Izuchenie toksichnosti produktov transformatsii himicheskih veshestv v usloviyah ostrogo opyta / I.N. Lutsevich // Zdorov'e naselenia I okruzhayushaya sreda. — Saratov: SGU, 1986. - S. 68-70.
11. Maksiutina N.P. Perspektivy primenenia kraun-efirov dlia ekstraktsionno-fotometricheskogo opredelenia shelochnyh metallov v lekarstvennyh preparatah / N.P. Maksiutina, P.A. Vetiutneva, A.Yu. Nazarenko, F.A. Mitchenko // Farmakologicheskiy zhurnal. -1991. - № 3. - S. 67-74.
12. Orehovich V.N. Sovremennye metody v biologii / V.N. Orehovich. — M.: Meditsina, 1977. - 371 s.
13. Popova L.D. Otsenka stabil'nosti biologicheskih membrane metodom hemiliuministsentsii / L.D. Popova, S.A. Stetsenko // Problemy kriobiologii. - 2001. - № 4. - S. 3-7.
14. Fedorova T.N. Reaktsii s tiobarbiturovoy kislotoy dlia opredelenia malonovogo dial'degida krovi metodom fluorimetrii / T.N. Fedorova, T.S. Korshunova, E.G. Larskiy // Lab. Delo. - 1983. - № 3. - S. 25-28.
15. Hiraoka M. Kraun-soedinenia, svoistva i primenenia / M. Hiraoka. — M.: Mir, 1986. - 277 s.
16. Komoth S.A. Interaction of Ca2+ with endoplasmic reticulum of rat liver: A standardized procedures for isolation of rat liver microsomes / S.A. Komoth, K.A. Narayn // Anal. Biochem. - 1972. - № 1. - P. 53-61.
17. Omura T. The carbon monooxide-binding pigment of liver microsomеs. Evidence for its hemoprotein nature / T. Omura, R. Sato // Biol. Chem. - 1964. - № 1. - P. 2370-2378.
УДК 613-615.092.044:616.099.036
Б10Л0Г1ЧН1 ЕФЕКТИ 15-КРАУН-5 ПРИ ДМ НА АКТИВН1СТЬ СИСТЕМИ М1КР0С0МАЛЬН0Г0 ОКИСНЕННЯ ТА В1ЛЬН0РАДИКАЛЬН1 ПР0ЦЕСИ У П1ДГ0СТР0МУ ЕКСПЕРИМЕНТ1
Кратенко Р. I.
Резюме. В статт представлен результати бюлопчно! дм 15-краун-5 на систему мiкроcомального окиснення та втьнорадикальы процеси. Експеримент проводили на бтих щурах-самцях лЫп Вютар трьохмюячного в^. 15-краун-5 вводили тваринам щоденно у виглядi водного розчину через зонд у шлунок протягом одного мюяця у 1/100 LD50 та 1/1000 LD50, що становило 13,5 та 1,35 мкг/кг Контроль^ тварини отримували водопро-вщну воду. Дослщжуваний 15-краун-5 активував процеси мiкроcомального окиснення за рахунок пщвищення швидкос^ споживання кисню, окиснення НАДФН2, Ыдукованого бюсинтезу цитохрому Р-450. Продукти бю-трансформацп краун-етеру дозозалежно пщсилювали процеси втьнорадикального окиснення, що проявля-лося в активацп перекисного окиснення лтщв (накопичення дieнових кон'юга™ та малонового дiальдегiдy). пщвищены рiвня бюхемтюмЫесценцп.
Ключов1 слова: 15-краун-5, м1кросомальне окиснення, вшьно радикальне окиснення, малоновий д1альде-rifl, д1енов1 кон'югати, бюхемшюмЫюцен^я.
УДК 613-615.092.044:616.099.036
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФЕКТЫ 15-КРАУН-5 ПРИ ДЕЙСТВИИ НА АКТИВНОСТЬ СИСТЕМЫ МИКРОСО-МАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ И СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ В ПОДОСТРОМ ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Кратенко Р. И.
Резюме. В статье представлены результаты биологического действия 15-краун-5 на систему микросомаль-ного окисления и свободнорадикальные процессы. Эксперимент проводили на белых крысах-самцах линии Вистар трехмесячного возраста. 15-краун-5 вводили животным ежедневно в виде водного раствора через зонд в желудок на протяжении одного месяца в 1/100 LD50 та 1/1000 LD50, что составляло 13,5 та 1,35 мкг/кг Контрольные животные получали водопроводную воду. Исследуемый 15-краун-5 активировал процессы ми-кросомального окисления за счет повышения скорости потребления кислорода, окисления НАДФН2, индуцированного биосинтеза цитохрома Р-450. Продукты биотрансформации краун-эфира дозозависимо усиливали процессы свободнорадикального окисления, что проявлялось в активации перекисного окисления липидов (накопления диеновых конъюгатов и малонового диальдегида), повышении уровня биохемилюминисценции.
Ключевые слова: 15-краун-5, микросомальное окисление, свободнорадикальное окисление, малоновый диальдегид, диеновые коньюгаты, биохемилюминисценция.
UDC 613-615.092.044:616.099.036
BIOLOGICAL EFFECTS OF 15-CROWN-5 INFLUENCING ON MICROSOMAL OXIDATION SYSTEM ACTIVITY AND FREE-RADICAL PROCESSES AT SUB-ACUTE EXPERIMENTS
Kratenko R. I.
Abstract. Crown-ethers structure is represented by macroheterocyclic systems with 9-60 atoms in the cycle. One third of the atoms are etherized oxygens which are separated by ethane groups. The most important property of macrocyclic polyethers is their capacity of forming stable complexes with salts of alkaline and other metals including the metal cation to their molecular niche.
Objective. Investigation of 15-crown-5 influence upon microsomal oxidation system activity and free-radical processes in the rat organism at conditions of sub-acute experiments.
Object and methods. The experiments were performed using Vistar line white rats (three month of age). The experimental animals were administered with 15-crown-5 (water solution) within one month (daily) per orally in 1/100 and 1/1000 LD50 (13.5 and 1.35 mkg/kg). The control group of animals was given water. The state of microsomal oxidation was evaluated by respiratory and enzymes activity and cytochromes P450 and b5 contents. The contents of dienic conjugates and malonic dialdehyde as well as the measurement of tissue biochemiluminiscention levels signified the development of free-radical oxidation and lipid peroxidation.
Investigation results and their discussion. 15-crown-5 1/100 та 1/1000 LD50 action resulted in the elevation of NADPH2 oxidation velocity and cytochrome P450 contents on 15th and 30th experimental days (by 100-110 % on average). The investigated crown-ether did not influence cytochrome b5 contents, which allows suggesting the latter not to be the limiting link in crown-ethers biotransformation by monooxigenase system. The obtained results correlated with the increase in demethylase activity of microsomes. The investigated crown-ether also significantly induced NADPH- and NADH-cytochrome c-reductase activity, and, thus, influenced two electron-transport microsomal chains of experimental animals organism. 15-crown-5 1/100 and 1/1000 LD50 action resulted in the augmentation of lipid peroxidation pronouncedly increasing dienic conjugates and malonic dialdehyde contents in blood serum of experimental animals. The measurement of spontaneous biochemiluminiscence (BCL) displayed the crown-ether to increase this index in blood serum (by 76%) and brain (by 31%) compared with the control magnitudes. The xenobiotics did not alter the in the liver of experimental animals though. Fe2+-induced BCL of blood serum got elevated by 250%, and of brain and liver - by 65 and 100% respectively in the action of 15-crown-5.
The experimental results demonstrate enhancing the processes of microsomal oxidation in the animals liver, and taking into consideration the dynamics of the indexes alterations, one could draw a conclusion about the induction of monooxigenase system enzymes synthesis by 15-crown-5. The stimulation of liver microsomal faction cytochrome reductase activity leads to straining the xenobiotics biotransformation system. Activation of hepatocyte monooxigenase system is accompanied, as a rule, by generation of superoxide radicals and enhancing lipid peroxidation. Formation of substances with paired double bonds (dienic conjugates) facilitates appearance of hydrophilic clusters in the continuous hydrophobic lipid bilayer, in which water and iron ions may penetrate. The former could stimulate the membrane destabilization; the latter might induce the reaction of branching the fatty acid residues chains, and stimulate lipid peroxidation further on. Malonic dialdehyde may be considered as a molecule of distant action, which, due to its stability, penetrates almost all of cellular structures, bringing up their following destruction.
Conclusions
1. 15-crown-5 activates microsomal oxidation processes by increasing oxygen consumption velocity, NADPH2 oxidation, and cytochrome P450 inductive synthesis.
2. The crown-ether biotransformation products dose-dependently enhance processes of free radical oxidation, which was revealed as lipid peroxidation activation (malonic dialdehyde and dienic conjugates accumulation), and biochemiluminescence induction.
Keywords: 15-crown-5, microsomal oxidation, free-radical oxidation, malonic dialdehyde, dienic conjugates, biochemiluminiscence.
Рецензент — проф. Непорада К. С.
Стаття надшшла 10.06.2017 року
