CC BY
24
УДК 615:849
DOI: 10.15587/2313-8416.2015.37451
ВПЛИВ ОКСИДУ АЗОТУ НА ФОРМУВАННЯ ХРОМОСОМНО! НЕСТАБ1ЛЬНОСТ1 В Л1МФОЦИТАХ КРОВ1 ЛЮДИНИ В УМОВАХ КО-МУТАГЕННО1 МОДИФ1КАЦ11
© Е. А. Дьомша, В. М. Михайленко, О. П. Пилипчук
Встановлено, що за дИ оксиду азоту на лiмфоцити людини додатковий вплив ко-мутагену аскорбтово'1 кислоти у високш концентрацИ тдвищуе рiвень хроматидних аберацт та пригтчуе пролiферативний потенцiал miтин. Беручи до уваги екологiчну ситуацiю, що склалася в Укра'т, в тому чист за рахунок головного забруднювача повiтря оксиду азоту, одержанi результати мають значення при проведеннi екологiчного мотторингу довюлля
Ключовi слова: оксид азоту, ко-мутаген, аскорбтова кислота, лiмфоцити кровi, аберацИ хромосом, пролiферативний потенцiал
Aim. Identify the features of formation of chromosomal instability in lymphocytes of nominally healthy individuals under conditions of combined action of nitrogen oxides (NO) and ascorbic acid (AA), depending on their concentration (study in vitro).
Material and methods. Culture of human peripheral blood lymphocytes (PBL) with metaphase analysis of chromosome aberrations. Nitrosated glutathione as the main transport form of NO injected into PBL culture in the concentration range 0,25-0,5-1,0 mmol/ml of blood. As co-mutagen used AA in the concentration range 20,0-40,0-80,0 mg/ml of blood, corresponding therapeutic drug concentrations, as well as 2 and 4 times exceeding its value.
Results. Discovered co-mutagenic effect of AA manifested in increasing the overall frequency of chromosomal aberrations in 1.7 and 1.4 times respectively the concentration of NO. The spectrum induced damage presents a whole by chromatid type aberrations that occur mainly by single-strand DNA breaks and kept stable in a number of cell generations. In all experimental observation points an additional impact of AA (regardless of concentration) strengthened depressing effect of NO in concentration of 1.0 mmol/ml of blood on proliferative potential of cells.
Conclusions. By the action of chemical mutagens NO on blood lymphocytes of nominally healthy persons an additional impact of AA in high concentration (80 mg/ml of blood) complicates chromosome instability of cells, increasing the level chromatid aberrations in 2 times, and inhibits their proliferative potential Keywords: nitrogen oxide, co-mutagen, ascorbic acid, blood lymphocytes, chromosome aberration, proliferative potential
Б1ОЛОГ1ЧН1 НАУКИ
1. Вступ
Експериментальш та ещдемюлопчш спосте-реження переконують в тому, що заново 1ндуковаш мутаци за рахунок фактор1в навколишнього середовища обумовлюють шдвищення р1вня захворювань, в тому числ1 онколопчних. Чинне мюце у виршенш/подоланш ще! проблеми мае займати вивчення особливостей та мехашзм1в ди ко-мутагешв, що не проявляють власно! мутагенно! активносп, але можуть суттево модиф1кувати (потенцшвати) генотоксичш ефекти деяких чиннишв х1м1чно! природи. Особливу небезпеку серед виявлених ко-мутагешв являють препарати медичного призначення.
2. Огляд лггератури
Важливу роль у дестабшзаци геному людини ввдграе вплив одного з найпотужшших та найбшьш поширених хишчних мутагенних чинникш довкшля -оксида азоту (ОА). Встановлено мультипотентний характер до ОА на соматичт клггини людини, в тому числ1 за рахунок накопичення хромосомних перебудов, яю можуть слугувати коректним бiологiчним маркером щдвищеного канцерогенного ризику [1-3]. При цьому домiнуючим мехатзмом у формуваннi хромосомних аберац1й за до ОА розглядають гх здатшсть до пригнiчення ферменпв репараци [4]. Фактичного матерiалу, що з'ясував би мехатзми ко-мутагенезу, недостатньо. В цьому напрямку виконано поодиною та
фрагментарт дослвдження на культур1 клттин експериментальних тварин. Виникае питання щодо утверсальносп формування ко-мутагенних ефекпв в соматичних клттинах людини. На думку дослвднишв [5], об'ективна вщповщь може бути отримана внаслвдок проведення цитогенетичних дослвджень на культур1 л1мфоципв периферично1 кров1 людини. Нещодавно нами встановлено ко-мутагент властивосп кардюлопчного препарату верапамшу, як1й може потенщювати ращацшно-шдуковаш цитогенетичш ефекти в соматичних клттинах умовно здорових оаб [6]. Дотепер не ставилося i тому не виршувалося питання щодо впливу ко-мутагенiв на формування генотоксичних ефекпв ОА, як визнанi головним забруднювачем атмосферного повпря i можуть суттево п^двишувати обсяг генетичного тягаря в популяцiях людини [7]. Окремий науково-практичний iнтерес представляе визначення ко-мутагенних властивостей у найбшьш поширеного в медичнiй практицi серед препарапв антиоксиданпв аскорбiновоï кислоти (АК), для якоï на даний час юнуе певна невизначенiсть в ощнщ характеру ïï впливу на геном людини.
3. Мета роботи
Визначити особливосп формування хромосомно! нестабшьносл в лiмфоцитах кровi умовно здорових оаб за умов комбiнованоï дп ОА та АК в залежносп вiд 1'х концентрацiï (дослiдження in vitro).
4. Матерiали i методи
Цитогенетичне дослiдження виконано в умовах in vitro з використанням тест-системи лiмфоцитiв периферично1 кровi (ЛПК) умовно здорових оаб, вжом 23-34 р., яш дали iнформовану згоду на участь у дослщженнях. У роботi керувались положенням Хельсинксько1' декларацiï Всесвiтньоï Медично1 Асоцiацiï (2008 р.), а також загальними етичними принципами, ухваленими Першим нацю-нальним конгресом Украши з бюетики (2001 р.). Алгоритм дослщження наведено на рис. 1.
ФГА ОА АК К Ф
j * i11-ЯЧЕШ
if Метафазний анализ
I Час шк>'бацц кл1тин, год аберацш хромосом
Рис. 1. Алгоритм цитогенетичного дослiдження (in vitro): ФГА - мггоген, ОА - оксид азоту, АК - аскорбшова кислота, К - колцемш, Ф- фжсация культури клiтин
Вибiр дано1' моделi аргументовано високою чутливiстю даних клiтин до до мутагенних чиннишв, в тому числi оксидiв азоту [3, 7], що дозволяе моделювати особливосп формування хромосомно1' нестабiльностi в соматичних клттинах людини за рiзних експериментальних умов. Нiтрозований глутатюн, як основну транспортну форму ОА, вводи-ли в культуру
ЛПК в во-перюда клiтинного циклу в дапазот концентрацiй 0,25-0,5-1,0 мкМ/кровт В якосп ко-мутагену використовували АК в iнтервалi концентрацiй 20,0-40,0-80,0 мкг/мл кровi, що вщповщало терапевтичнш концентрацй' препарата, а також у 2 i 4 рази перевищуючи ïï значення. Культивування ЛПК, приготування препарапв хромосом i цитогенетичний (метафазний) аналiз клiтин виконували вщшвщно до стандартного протоколу [8]. З метою ощнки пролiферативного потенцiалу лшфоципв за рiзних експериментальних умов визначали мiтотичний iндекс (к1льк1сть мiтозiв / 2000 проаналiзованих клiтин). Математичну обробку одержаних експериментальних даних проводили стандартними методами з використанням програми Excel [9].
5. Результати та обговорення
На рис. 2 прошюстровано, що тд впливом ОА частота аберацш хромосом шдвищуеться в середньому у 2 рази порiвняно зi спонтанним рiвнем. АК в дiапазонi концентрацш 20,0-40,0 мкг/мл кровi не впливае на рiвень хромосомних пошкоджень, шдукованих ОА в лiмфоцитах кровi донорiв. Але додатковий вплив АК на ЛПК донорiв в концентрацй' 80,0 мкг/мл, що перевищуе терапевтичну дозу препарату у 4 рази, потенцше дй' ОА в концентращях 0,5 мкМ/мл та 1,0 мкМ/мл (рис. 2). Виявлений ко-мутагенний ефект АК проявляеться у пiдвишеннi загальнот' частоти аберацш хромосом в 1,7 i 1,4 рази вшповщно до концентрацй ОА.
Рис. 2. Загальна частота аберацш хромосом в лiмфоцитах людини за умов комбшованот' ди ОА
(0,5-1,0 мкМ/мл кров!) та АК (20-80 мкг/мл).
Позначення: ^ ОА(0,5 мкМ/мл Kpoei): - ОА(1,0 мкМ/мл кровi)
Зауважимо, що за дй' ОА спектр шдукованих пошкоджень представлено в цшому аберашями хроматидного типу (делецiï i обмiни), яш виникають переважно за рахунок однониткових розривiв ДНК i стабiльнiше збер^аються у ряду клiтинних генерацiй. 1ндуковаш аберацiï даного типу вiдiграють визначальну роль у розвитку хромосомнот' нестабшьносл за дiï мутагенiв хiмiчноï природи (в нашому дослiдженнi ОА), яка е проявом нестабiльностi геному клттин. Найвищу ко-мутагенну активнiсть за рiвнем хроматидних аберацiй АК
проявляе в концентрацп 80,0 мкг/мл, потенцшючи дш ОА (0,5 мкМ/мл ) у 2 рази (рис. 3).
Рис. 3 Частота i спектр аберацш хромосом за умов
комбшованш ди ОА (0,5 мкМ/мл) та АК (20,0-80,0 мкг/мл) на ЛПК донор1в - абераци хромосомного типу; Щ - абераци хроматидного типу
Таким чином, АК у високш концентрацiï потенцше дш ОА на хромосомному рiвнi соматичних клггин людини в 2 рази (рис. 3). Залишаеться нез'ясованим питання стосовно впливу ко-мутагешв на пролiферативний потеншал соматичних клiтин людини. Це пов'язано з тим, що чутливiсть клгшн та органiзму людини до ди мутагенiв визначаеться в цiлому репаративним потеншалом, що тiсно пов'язаний з iмунною системою [10]. Тому науково-практичне значення мае дослiдження мiтотичноï активносп насамперед iмуннокомпетентних клiтин - Т-лшфоципв, як1 визнанi об'ективними iндикаторами ди мутагенних чинник1в [11].
В нашому дослiдженнi показано, що ОА в концентраций 0,5 мкМ/мл кровi пригшчуе мiтотичну активнiсть лiмфоцитiв в культурi ~ на 20 % в порiвняннi з контролем (рис. 4). Подальше шдвищення концентрацiï ОА у 2 рази (ввд 0,5 мкМ до 1,0 мкМ/мл кров1) вже не впливало на значення мгготичного iндексу, що спiвпадае з даними, отриманими нами ранiше [7]. В рамках нашого дослщження окрема дiя АК в дiапазонi концентрацш 20,0-80,0 мкг/мл кровi суттево не впливала на мгготичну активнiсть клгган. СлГд вiдзначити, що в уах експериментальних точках спостережень додатковий вплив АК (незалежно вiд ïï концентрацп) тдсилював пригнiчуючий вплив ОА в концентрацп 1,0 мкМ/мл кровг Але найб№ше пригнiчення спостерiгалось за умов комбшованого впливу ОА та АК (80,0 мкг/мл), а саме, на 24 % порiвняно з ефектом окремо1' ди ОА та ~ на 39 % - з контролем (рис. 4). В рамках виконаного експериментального дослiження можна припустити, що пригшчуючий вплив ОА на мгготичну активнiсть Т-лiмфоцитiв в бiльшiй мГрГ залежить ввд концентрацiï ко-мутагену АК.
Рис.4. Дослвдження впливу комбiнованоï ОА (0,5-1,0 мкМ/мл кров1) i АК (20,0-80,0 мкг/мл кров1) на мгготичну актившсть ЛПК здорових донор1в.
Позначення: щ -контроль; - ОА (0,5 мкМ/мл);
- ОА (1,0 мкМ/мл)
Комбiнований вплив рГзних агентiв х1мГчно1' природи на геном людини е небезпечний з точки зору шдукци мутагенних, ко-мутагенних та канцеро-генних ефектiв. Оск1льки поява хромосомних змш в клтшнних популяшях визнано потенцшно онкогенною, то комбiнований вплив ОА та речовин з ко-мутагенними властивостями на геном людини може тдвищувати канцерогенний ризик. Беручи також до уваги екологiчну ситуацiю, що склалася в Украïнi, в тому числГ, як пiдкреслено вище, за рахунок головного забруднювача атмосферного повиря ОА, одержанi результати можуть мати значення при проведенш екологiчного мониторингу довк1лля.
6. Висновок
Вперше встановлено, що за ди хГмГчного мутагену ОА на лГмФоцити кровГ умовно здорових оаб додатковий вплив АК у шдвищенш концентрацй' (80 мкг/мл кров^ ускладнюе хромосомну неста-бшьшсть клГтин, з6Гльшуючи рiвень хрома-тидних аберацш у 2 рази, та пригшчуе ïx пролiферативний потенцiал.
Лiтература
1. Маеда, Х. Оксид азота и кислородные радикалы при инфекции, воспалении и раке [Текст] / Х. Маеда, Т. Акаике // Биохимия. - 1998. - Т. 63, № 7. - С. 1007-1019.
2. Винк, Д. А. Значение химических свойств оксида азота для лечения онкологических заболеваний [Текст] / Д. А. Винк, И. Г. Водовоз, Дж. А. Кук // Биохимия. -1998. - Т. 63, № 7. - С. 948-957.
3. Дьомша, Е. А. Деяю аспекти генетично1 неста-бшьносл соматичних клгшн людини за комбшовано1 ди юшзуючо1 радiацiï та оксиду азоту [Текст] / Е. А. Дьомша // Вюник Укр. тов-ва генетикв i селекцiонерiв. -2013. - Т. 11, № 3. - С. 39-45.
4. Дьомша, Е. А. Особливоста формування радiа-цшно-шдукованих аберацш хромосом в клпинах людини за умов модифжуючого впливу хТмТчних агенпв [Текст] / Е. А. Дьомша, О. П. Пилипчук // Проблеми радiацiйноï медицини та радюбюлогп. - 2013. - Т. 1, № 18. -С. 330-337.
5. flypHeB, A. fl. Ko-MyTareHe3 - H0B0e HanpaBneHue uccnegOBaHHH b reHOTOKcHKOHOrau [TeKCT] / A. fl. flypHeB, C. E. CepeguHHH // EronneTeHt экcnepнмeнтaпLH0H 6HOHOrau h MeguuuHLi. - 2003. - T. 35, № 6. - C. 604-612.
6. fltoMma, E. A. PagiauiHHO-iHgyKOBaHi a6epaqil xpomocom b niM^OuuTax nroguHH 3a gil KO-MyTareHiB (gOcnigxeHHA in vitro) [TeKCT] / E. A. fltOMma, O. n. nu-nunnyK // BicHHK yKp. TOB-Ba reHeTHKiB i ceneKqiOHepiB. -2013. - T. 11, № 3. - C. 46-52.
7. Mikhailenko, V. M. Nitric oxide coordinates development of genomic instability in realization of combinet effect with ionizing radiation [Text] / V. M Mikhailenko, E. A Diomina, I. I. Muzalov, B. I. Gerashchenko // Experimental Oncology. - 2013. - Vol. 35, Issue 1. - P. 58-64.
8. Cytogenetic Dosimetry: Applications in Preparedness for and Response to Radiation Emergencies [Text] / Vienna: IAEA, 2011. - 232 p.
9. HanaH, C. H. CramcmHecKHe MeTogti b MeguKO-6uonorHHecKHx uccnegOBaHuax c ucnOHMOBaHueM Excel [TeKCT] / C. H. HanaH, A. B. Ty6eHKO, n. H. Ea6uH. - K.: mophoh, 2000. - 408 c.
10. PaK ^HTOBugHOH xene3H [TeKCT] / nOg peg. ro. A. rpuHeBHHa, A. A. ^yMaKa. - K.: 3gOpOB'a, 2011. - 208 c.
11. fleMHHa, Э. A. PaguauHOHHaa uHTOreHemKa [TeKCT] / Э. A. fleMHHa, M. A. nunuHCKaa, ro. H. neTyHHH, fl. A. KnromuH. - K.: 3gOpOB'a, 2009. - 367 c.
References
1. Maeda, H., Akaike, T. (1998). Oksid azota i kislorodnyie radikalyi pri infektsii, vospalenii i rake [Nitric oxide and oxygen radicals at an infection, inflammation and cancer]. Biochemistry, 63 (7), 1007-1019.
2. Vink, D. A., Vodovoz, I. G., Kuk, D. A. (1998). Znachenie himicheskih svoystv oksida azota dlya lecheniya onkologicheskih zabolevaniy [Value of chemical properties of nitric oxide for treatment of oncologic diseases]. Biochemistry, 63 (7), 948-957.
3. Domina, E. A. (2013). Deyaki aspekti genetichnoyi nestabilnostI somatichnih klitin lyudini za kombinovanoyi diyi ionizuyuchoyi radIatsiyi ta oksidu azotu [Some aspects of genetic instability of somatic cells of man are at the combined
action of ionizing radiation and nitric oxide]. Herald of Ukrainian Society of Geneticists and Selectionists, 11 (3), 39-45.
4. Domina, E. A., Pylypchuk, E. P. (2013). Osoblivosti formuvannya radiatsiyno-indukovanih aberatsiy hromosom v klitinah lyudini za umov modifikuyuchogo vplivu himichnih agentive [Features of forming of the radiation-induced aberrations of chromosomes are in the cells of man at the terms of modifying influence of chemical agents]. Problems of Radiation Medicine and Radiobiology, 18 (1), 330-337.
5. Durnev, A. D., Seredynyn, S. B. (2003). Ko-mutahenez - novoe napravlenie issledovaniy v henotoksikologii [Co-mutagenesis - a new direction of research in genotok-sikology]. Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 35 (6), 604-612.
6. Domina, E. A., Pylypchuk, E. P. (2013). Radiatsiyno-indukovani aberatsiyi khromosom v limfotsytakh lyudyny za diyi ko-mutaheniv (doslidzhennya in vitro) [Radiation-induced chromosome aberrations in human lymphocytes by action of co-mutagens (study in vitro)]. Herald of Ukrainian Society of Geneticists and Selectionists, 11 (3), 46-52.
7. Mikhailenko, V. M., Diomina, E. A., Muzalov, I. I., Gerashchenko, B. I. (2013). Nitric oxide coordinates development of genomic instability in realization of combined effect with ionizing radiation. Experimental Oncology, 35 (1), 58-64.
8. Cytogenetic Dosimetry: Applications in Preparedness for and Response to Radiation Emergencies (2011). Vienna: IAEA, 232.
9. Lapach, S. N., Gubenko, A. V., Babich, P. N. (2000). Statisticheskie metodyi v mediko-biologicheskih isle-dovaniyah s ispolzovaniem Excel [Statistical methods in researches for medicine and biology with the use of Excel]. Kiev, Ukraine: Zdorov'ya, 408.
10. Grinevich, Yu. A., Chumak, A. A. (Eds.) (2011). Rak schitovidnoy zhelezyi [Cancer of thyroid]. Kiev, Ukraine: Zdorov'ya, 208.
11. Domina, E. A., Pilinskaya, M. A, Petunin, Yu. I., Klyushin, D. A. (2009). Radiatsionnaya tsitogenetika [Radiation cytogenetics]. Kiev, Ukraine: Zdorov'ya, 367.
ffama HadxodwemnpyKonucy 27.01.2015
flfcOMma EMMH AHaTO.räBHa, goKTop öio^oriHHHx HayK, npoBigHHH HayKoBHH cniBpo6iTHHK. Biggie eKogoriï i pagioôio^oriï, iHCTHTyT eKcnepHMeHT&ibHoï naTogoriï, oHKo^oriï i pagioôiogoriï iM. P. G. KaBe^Koro Ha^oHa^bHoï AKageMiï HayK yKpaïHH, Byg. BacugbKÎBCbKa, 45, m. Khïb, yKpaïHa, 03022 E-mail: edj omina@ukr. net
MHxaö^eHKO BiKTop MHxaö^OBHH, KaHgugaT öiogorinHHx HayK, 3aBigyBan Biggigy eKogoriï i pagioôiogoriï IHCTHTyT eKcnepHMeHTa^bHoï narogoriï', oHKo^oriï i pagioôiogoriï iM. P. G. KaBe^Koro HamoHa^bHoï AKageMiï HayK yKpaïHH, Byg. BacH^bKÎBCbKa, 45, m. Khïb, yKpaïHa, 03022 E-mail: [email protected]
na^HnnyK O^eHa neTpiBHa, npoBigHHH iH^eHep Biggigy eKo^oriï i pagioôio^oriï', IHCTHTyT eKcnepHMeHTa^bHoï narogoriï, oHKo^oriï i pagioôio^oriï iM. P. G. KaBe^Koro HamoH&ibHoï' AKageMiï HayK yKpaïHH, Byg. BacH^bKÎBCbKa, 45, m. khïb, yKpaïHa, 03022 E-mail: lena.pylypchuk@ukr. net
